JPS6188874A - プロトプラストの培養方法 - Google Patents
プロトプラストの培養方法Info
- Publication number
- JPS6188874A JPS6188874A JP59209132A JP20913284A JPS6188874A JP S6188874 A JPS6188874 A JP S6188874A JP 59209132 A JP59209132 A JP 59209132A JP 20913284 A JP20913284 A JP 20913284A JP S6188874 A JPS6188874 A JP S6188874A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- agarose
- protoplasts
- liquid medium
- medium
- protoplast
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- Granted
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、分裂頻度と再現性が高く、効率の良いプロト
プラストの培養方法に関するものである。
プラストの培養方法に関するものである。
一般に、プロトプラストの培養は、各種の無機塩、ビタ
ミン類、糖、植物ホルモン等を適当な濃度に調整した液
体培地か更にこれに適当な濃度になる様に寒天かアガロ
ースを加えてプロトプラストと共に固めた固体培地中で
行われる。
ミン類、糖、植物ホルモン等を適当な濃度に調整した液
体培地か更にこれに適当な濃度になる様に寒天かアガロ
ースを加えてプロトプラストと共に固めた固体培地中で
行われる。
しかし、植物の種類によっては液体培地中で培養した場
合、プロトプラストが凝集して増殖が妨げられることが
ある。また分裂増殖につれて、代謝産物やフェノール系
物質の酸化により、細胞の活性が低下し、ついには枯死
してしまうことがあるため、適当な頻度で培地の更新を
行う必要があるが、固体培地の場合には、培地交換が出
来ず、正常な細胞の増殖を維持できないことがある。
合、プロトプラストが凝集して増殖が妨げられることが
ある。また分裂増殖につれて、代謝産物やフェノール系
物質の酸化により、細胞の活性が低下し、ついには枯死
してしまうことがあるため、適当な頻度で培地の更新を
行う必要があるが、固体培地の場合には、培地交換が出
来ず、正常な細胞の増殖を維持できないことがある。
この様に、液体培地あるいは固体培地による従来の培養
方法では対応できる限界があり、植物の種類によっては
プロトプラストの培養が因難な場合がある。
方法では対応できる限界があり、植物の種類によっては
プロトプラストの培養が因難な場合がある。
これらの欠点を改良する方法として、例え；ゴ、Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （／Ｖｇ、７）Ｊ：
、２１Ｉ＆−，２９７に報告されているような方法、即
ち、まずプロトプラストをアガロースと共に固め、次い
で、これを適当な大きさに切ってこの切片を：、’（”
、ｊ＞ 電池の中に浮遊させて培養する、所謂、アガロ
ースビーズ法が知られている。この方法をａ 、！＋’
！することにより、培地の更新が容易かつ確実になり、
プロトプラスト培養の効率が大巾に向上した。
ｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （／Ｖｇ、７）Ｊ：
、２１Ｉ＆−，２９７に報告されているような方法、即
ち、まずプロトプラストをアガロースと共に固め、次い
で、これを適当な大きさに切ってこの切片を：、’（”
、ｊ＞ 電池の中に浮遊させて培養する、所謂、アガロ
ースビーズ法が知られている。この方法をａ 、！＋’
！することにより、培地の更新が容易かつ確実になり、
プロトプラスト培養の効率が大巾に向上した。
本発明は、植物の種類、即ちアブラナ科又はナス科の植
物からのプロトプラストをアガロースビーズ法により、
分裂頻度と再現性が高く、更にはより短期間で増殖する
ことが出来るような改良されたプロトプラストの培養方
法を提供するものである。
物からのプロトプラストをアガロースビーズ法により、
分裂頻度と再現性が高く、更にはより短期間で増殖する
ことが出来るような改良されたプロトプラストの培養方
法を提供するものである。
本発明は、アブラナ科又はナス科の植物から得たプロト
プラストをアガロース中に埋め、該アガロースをＮＨ；
を含ま々い液体培地中で培養し、次いでＮＨ＋４を含む
液体培地中で培養することから成るプロトプラストの培
養方法である。
プラストをアガロース中に埋め、該アガロースをＮＨ；
を含ま々い液体培地中で培養し、次いでＮＨ＋４を含む
液体培地中で培養することから成るプロトプラストの培
養方法である。
本発明は、植物の種類により、単に培地を更新するだけ
でなく、同時に培地組成も変更することによって更に効
率よくプロトプラストの培養が可能となること、詳しく
はアブラナ科やナス科の植物はプロトプラスト培養の初
期にＮＨ４が存在すると、分裂の頻度が低いことがある
ためにＮＨ４を含まない培地で培養することが好ま−を
形成することの新規な知見に基づいて達成されたもので
ある。
でなく、同時に培地組成も変更することによって更に効
率よくプロトプラストの培養が可能となること、詳しく
はアブラナ科やナス科の植物はプロトプラスト培養の初
期にＮＨ４が存在すると、分裂の頻度が低いことがある
ためにＮＨ４を含まない培地で培養することが好ま−を
形成することの新規な知見に基づいて達成されたもので
ある。
本発明の方法は、特に、培養中に褐変して枯死に到りや
すいアブラナ科及びナス科の植物に有効であり、その代
表的な植物は次の通りである。
すいアブラナ科及びナス科の植物に有効であり、その代
表的な植物は次の通りである。
アブラナ科 キャベツ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏ
ｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ。
ｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ。
ｃａｐｉｔａｔａ）
〃 カ フ゛ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐ
ａ）ナス科 トマト （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｑｍ）〃 す ス （ｓｏｌａ
ｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）まだ、プロトプラスト
を得るための植物の器官は、若い展開策を用いることが
多いが、必要に応じ子葉や葉柄あるいは、培養細胞を用
いることが出来る。
ａ）ナス科 トマト （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｑｍ）〃 す ス （ｓｏｌａ
ｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）まだ、プロトプラスト
を得るための植物の器官は、若い展開策を用いることが
多いが、必要に応じ子葉や葉柄あるいは、培養細胞を用
いることが出来る。
プロトプラストの調製は、公知の方法に従い容易に得る
ことができる。例えば、温室内で育成した植物体から葉
などの供試する器官を切り取り、表面殺菌した後、裏側
の表皮を出来るだけ剥離した後に細かく刻み、酵素液に
浸して２〜３時間処理し、更に精製してプロトプラスト
を取得する。その際、酵素液は、ペクチナーゼ、セルラ
ーゼ、ＫＤＳ（デキストラン硫酸カリウム）を含み、更
に浸透圧調整のためにマニトールを０．ｊｔ Ｍ程度添
加し、ｐＨをｓ、ｂに調整されたものが使用される。
ことができる。例えば、温室内で育成した植物体から葉
などの供試する器官を切り取り、表面殺菌した後、裏側
の表皮を出来るだけ剥離した後に細かく刻み、酵素液に
浸して２〜３時間処理し、更に精製してプロトプラスト
を取得する。その際、酵素液は、ペクチナーゼ、セルラ
ーゼ、ＫＤＳ（デキストラン硫酸カリウム）を含み、更
に浸透圧調整のためにマニトールを０．ｊｔ Ｍ程度添
加し、ｐＨをｓ、ｂに調整されたものが使用される。
上記の様にして調製したプロトプラストをアガロース中
に埋め、所詣、アガロースビーズを作成する。即ち、Ｎ
Ｈ，＋を含１ない試薬の中から選ばれた＋−ｔｏ；、Ｈ
２ＰＯ；” 、 Ｋ＋、Ｃａ１、Ｍｇ＋、Ｆｅ＋″や微
量金醤を含む無機塩を合計的Ｏ，Ｖ”重量係程度、塩酸
チ゛アミンや塩酸ピリドキシン等のビタミン類及びコ、
４’−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＢＡＰ等（Ｄ 植物ホルモ
ン類を少量とサッカロース、グルコース等の糖類を合計
へＳ重量係等を含む液体培地中にアガロースをｏ、ｇ〜
３重量％、好ましくは、ａ−コ、Ａ重量係となる様に添
加し、加熱滅菌後９０℃位まで冷却し、これと別途調製
したプロトプラストの懸濁液とを等量づつ混ぜ、速やか
にシャーレ−中に広げて薄くして固める。っこの時のプ
ロトプラストの密度は約／ Ｘ ／ ０５ｇｙ”ｍｉと
なるようにし、ｌた、アガロースゲルの厚さは平均０．
７ｙｒｍ程度となるようにするのが良い。
に埋め、所詣、アガロースビーズを作成する。即ち、Ｎ
Ｈ，＋を含１ない試薬の中から選ばれた＋−ｔｏ；、Ｈ
２ＰＯ；” 、 Ｋ＋、Ｃａ１、Ｍｇ＋、Ｆｅ＋″や微
量金醤を含む無機塩を合計的Ｏ，Ｖ”重量係程度、塩酸
チ゛アミンや塩酸ピリドキシン等のビタミン類及びコ、
４’−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＢＡＰ等（Ｄ 植物ホルモ
ン類を少量とサッカロース、グルコース等の糖類を合計
へＳ重量係等を含む液体培地中にアガロースをｏ、ｇ〜
３重量％、好ましくは、ａ−コ、Ａ重量係となる様に添
加し、加熱滅菌後９０℃位まで冷却し、これと別途調製
したプロトプラストの懸濁液とを等量づつ混ぜ、速やか
にシャーレ−中に広げて薄くして固める。っこの時のプ
ロトプラストの密度は約／ Ｘ ／ ０５ｇｙ”ｍｉと
なるようにし、ｌた、アガロースゲルの厚さは平均０．
７ｙｒｍ程度となるようにするのが良い。
アガロースゲルが固まったら０．！； Ｘ ２．０σ位
の適当な大きさに切り、これを前記組成の液体培地中で
、暗条件下、ゆっくり振とう（ｘｒ〜３Ｓｒｐｍ ）
Ｌながら２０〜３０℃で培養を行なう。
の適当な大きさに切り、これを前記組成の液体培地中で
、暗条件下、ゆっくり振とう（ｘｒ〜３Ｓｒｐｍ ）
Ｌながら２０〜３０℃で培養を行なう。
本発明で使用するアガロースの種類として：ｉ、市販さ
れている試薬のいずれでもよいが、ｉ：；Ｉ４製度が高
く、ゲル化温度が低くしかもゼリー強４変の小さいタイ
プ、例えば、シグマ試、薬タイプ＼・ＩＩが、細胞の分
裂に対して好ましい。
れている試薬のいずれでもよいが、ｉ：；Ｉ４製度が高
く、ゲル化温度が低くしかもゼリー強４変の小さいタイ
プ、例えば、シグマ試、薬タイプ＼・ＩＩが、細胞の分
裂に対して好ましい。
本発明においては、プロトプラスト培養の辺期において
は、液体培地中にはＮＨ４が含まないようにする。それ
は、 ＮＨ４がフロドプラストの分裂に阻害的に作用
し、分裂頻度を低下させることがあるためである。
は、液体培地中にはＮＨ４が含まないようにする。それ
は、 ＮＨ４がフロドプラストの分裂に阻害的に作用
し、分裂頻度を低下させることがあるためである。
しかし、ＮＨ↓を含まない液体培地で培養を続けると、
徐々に分裂が遅くなり、最後には、完全に分裂が停止し
てしまうことがある。
徐々に分裂が遅くなり、最後には、完全に分裂が停止し
てしまうことがある。
培養７日目頃）でＮＨ４＋を含む液体培地に換える必要
がある。
がある。
その際、ＮＨ４＋供給源、例えば、ＮＨ４Ｎｏ３等を培
養中の液体培地中に添加してもよいが、好ましくは、前
記組成の液体培地を新たに調製し、これにＮＨ４＋供給
源を添加したものに培養中のアガロースビーズを移し換
えて上記と同条件下に培養を継続するのが良い。
養中の液体培地中に添加してもよいが、好ましくは、前
記組成の液体培地を新たに調製し、これにＮＨ４＋供給
源を添加したものに培養中のアガロースビーズを移し換
えて上記と同条件下に培養を継続するのが良い。
Ｎｘ４−は、液体培地中、ＮＨ層供給源、例えば、ＮＨ
４Ｎｏ３として０．０２〜０．３重量襲、好ましくは、
ｏ、ｏ ｒ〜０．２重量係となるように添加使用する。
４Ｎｏ３として０．０２〜０．３重量襲、好ましくは、
ｏ、ｏ ｒ〜０．２重量係となるように添加使用する。
本発明方法に従えば、アブラナ科及びナス科の植物由来
のプロトプラストを高い分裂頻度で、再現性良く、しか
も、より短期間で培養することができる。
のプロトプラストを高い分裂頻度で、再現性良く、しか
も、より短期間で培養することができる。
そして、本発明方法により培養されたフロドプラストか
ら、常法に従い、容易にカルス、更には、植物体を再生
することができるのである。
ら、常法に従い、容易にカルス、更には、植物体を再生
することができるのである。
次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定さ
れるものではない。
発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定さ
れるものではない。
実施例−７
温室で育成した播種後≠θ日口のキャベツの第３葉を７
０％エタノール１分と３チ次亜塩素酸ナトリウム！Ｏ分
で殺菌処理した後滅菌水で弘回水洗して供試材料とした
。葉の裏側の表皮を出来るだけ剥離し、０１ Ｘ ２０
．Ｏｍｍ位の短冊状に切って常法に従いペクチナーゼと
セルラーゼを含む酵素液（ｐＨｊ、Ａ） で３０℃、
２時間処理した。酵素処理終了後、ダ枚のガーゼを重ね
て濾過し、ｐ液を６０×ｌで７分間遠心し、上清を捨て
試験管の底に集まったプロトプラストを更に２回、０．
３Ｍマニトール液で洗滌し、最後にＭ Ｓ （Ｍｕｒａ
Ｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地からＮＨ，Ｎｏ、を
除いだＮＨ，＋を含まない培地で洗浄した。
０％エタノール１分と３チ次亜塩素酸ナトリウム！Ｏ分
で殺菌処理した後滅菌水で弘回水洗して供試材料とした
。葉の裏側の表皮を出来るだけ剥離し、０１ Ｘ ２０
．Ｏｍｍ位の短冊状に切って常法に従いペクチナーゼと
セルラーゼを含む酵素液（ｐＨｊ、Ａ） で３０℃、
２時間処理した。酵素処理終了後、ダ枚のガーゼを重ね
て濾過し、ｐ液を６０×ｌで７分間遠心し、上清を捨て
試験管の底に集まったプロトプラストを更に２回、０．
３Ｍマニトール液で洗滌し、最後にＭ Ｓ （Ｍｕｒａ
Ｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地からＮＨ，Ｎｏ、を
除いだＮＨ，＋を含まない培地で洗浄した。
この様にして調製したプロトプラスト懸濁液（＃Ｘ１０
５個／ｍＺ ） ／ ｍｌと約ｑｏ℃に温めだアガロー
ス７．６％添加した上記ＮＨ＋４を含まない培地／ ｍ
ｅとを等量に混合し、速やかに乙αφ ンヤーレーに均
一に広げて固化させた。固化したアガロースゲルを５Ｘ
２Ｏｒａｎ位の大きさに切り、上記ＮＨ４＋を含まない
培地６ｍ７！を加えたＡＣｍφＣｍ−レに浮かべ、３０
ｒｐｍ位の回転でゆっくり振とうしながら暗条件下２
５℃で培養した。培養開始後ｑ日目位で第１分裂が始ま
り、３日目頃から第２分裂が始まる。第１分裂が終了し
、第２分裂が始する時点でＮＨ，＋を含むＫ Ｍ （Ｋ
ａ、ｏ ＆Ｍｉｃｈａｙ’ｌｕｋ ）の基本培地に交換
すると、分裂が旺盛に持続し、約７７月後にはコロニー
を形成する。２週間目に観某したプロトプラストの分裂
率は２５％と高率であった。まだ、７７月後のコロニー
の大きさは／ ””−’ ２ ｍＩｎとなっており、旺
盛な生育を示していた。次いで、アガロースゲル中に形
成されたコロニーを不定芽誘導の前段階としてＮＨ４を
含む再分化用のＣ−／培地（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ
／／ヱ、ｌｒタータ２（／り１３） 記載）上に移し
て約２週間培養を続けるとカルスを得ることが出来る。
５個／ｍＺ ） ／ ｍｌと約ｑｏ℃に温めだアガロー
ス７．６％添加した上記ＮＨ＋４を含まない培地／ ｍ
ｅとを等量に混合し、速やかに乙αφ ンヤーレーに均
一に広げて固化させた。固化したアガロースゲルを５Ｘ
２Ｏｒａｎ位の大きさに切り、上記ＮＨ４＋を含まない
培地６ｍ７！を加えたＡＣｍφＣｍ−レに浮かべ、３０
ｒｐｍ位の回転でゆっくり振とうしながら暗条件下２
５℃で培養した。培養開始後ｑ日目位で第１分裂が始ま
り、３日目頃から第２分裂が始まる。第１分裂が終了し
、第２分裂が始する時点でＮＨ，＋を含むＫ Ｍ （Ｋ
ａ、ｏ ＆Ｍｉｃｈａｙ’ｌｕｋ ）の基本培地に交換
すると、分裂が旺盛に持続し、約７７月後にはコロニー
を形成する。２週間目に観某したプロトプラストの分裂
率は２５％と高率であった。まだ、７７月後のコロニー
の大きさは／ ””−’ ２ ｍＩｎとなっており、旺
盛な生育を示していた。次いで、アガロースゲル中に形
成されたコロニーを不定芽誘導の前段階としてＮＨ４を
含む再分化用のＣ−／培地（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ
／／ヱ、ｌｒタータ２（／り１３） 記載）上に移し
て約２週間培養を続けるとカルスを得ることが出来る。
実施例−！
実施例−／と同様の操作をカブ、トマト、ナスについて
実施した結果、キャベツと同様に極めて効率よくプロト
プラストからカルスを得ることができだ。即ち、！週間
目に観察しだプロトプラストの分裂率は、カブＪ７％、
）マド弘０％、ナス３％であり、７７月後のコロニーの
大きさはいずれも／〜３聴となっており、旺盛な生育を
示していた。
実施した結果、キャベツと同様に極めて効率よくプロト
プラストからカルスを得ることができだ。即ち、！週間
目に観察しだプロトプラストの分裂率は、カブＪ７％、
）マド弘０％、ナス３％であり、７７月後のコロニーの
大きさはいずれも／〜３聴となっており、旺盛な生育を
示していた。
（参考例−７）
実施例−／で得られたカルスを再分化培地（前述のＣ−
／培地）に移してｊｊ’ｌ：、／７時間日長の条件下で
培養したところ不定芽の生長が見られた。続いて、生長
してきた不定芽を茎葉伸長培地Ｔ−ｊ培地（Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｍａ ／ ／ ７ 。
／培地）に移してｊｊ’ｌ：、／７時間日長の条件下で
培養したところ不定芽の生長が見られた。続いて、生長
してきた不定芽を茎葉伸長培地Ｔ−ｊ培地（Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｍａ ／ ／ ７ 。
１９−９．２（／９♂３）記載）に移して２５℃、７７
時間日長の条件下で培養したところ発根が見られた。こ
の幼植物をバーミキュライトに移して更に培養を続けた
ところ、正常な植物体を得ることができた。
時間日長の条件下で培養したところ発根が見られた。こ
の幼植物をバーミキュライトに移して更に培養を続けた
ところ、正常な植物体を得ることができた。
Claims (1)
- （１）アブラナ科又はナス科の植物から得たプロトプラ
ストをアガロース中に埋め、該アガロースをＮＨ＾＋＿
４を含まない液体培地中で培養し、次いで、ＮＨ＾＋＿
４を含む液体培地中で培養することを特徴とするプロト
プラストの培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209132A JPS6188874A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | プロトプラストの培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209132A JPS6188874A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | プロトプラストの培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188874A true JPS6188874A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0555106B2 JPH0555106B2 (ja) | 1993-08-16 |
Family
ID=16567816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59209132A Granted JPS6188874A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | プロトプラストの培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6188874A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037060A3 (en) * | 1998-12-22 | 2001-01-04 | Ca Nat Research Council | Transgenic plants comprising a conditionally lethal gene |
| CN105018412A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-11-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法 |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP59209132A patent/JPS6188874A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037060A3 (en) * | 1998-12-22 | 2001-01-04 | Ca Nat Research Council | Transgenic plants comprising a conditionally lethal gene |
| CN105018412A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-11-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0555106B2 (ja) | 1993-08-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |