CN116548305B - 一种春兰离体再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种春兰离体再生体系建立及快速繁殖的方法，包括外植体消毒和一步成苗诱导。在外植体消毒后通过浸泡吗啉脂肪酸盐果蜡，有效减少了外植体伤口的暴露面积，在一定程度上保持了生物膜和细胞的完整性，同时减缓了外植体的衰老速度，大大降低了外植体的褐化起始时间和褐化率，从而提高了诱导成功率。同时，利用诱导培养基1/2MS+0.1~1.0mg/L NAA+0.1~1.5mg/L KT+20~30g/L蔗糖+6~8g/L琼脂粉，pH 5.5~7.0，实现了根状茎诱导、增殖以及生根的培养过程，实现春兰离体一步成苗的诱导。采用本发明的春兰组培繁殖方法，以春兰根状茎途径开展组培快繁，具有诱导时间短、诱导率高、技术难度低、遗传性能稳定的优点，可避免生产中发生大量变异，对大规模商业化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于春兰扩繁技术领域，具体涉及一种春兰离体再生体系建立及快速繁殖方法。
背景技术
春兰是兰科，兰属，地生兰类多年生草本，是中国兰的代表种，原产于我国长江流域或西南地区，日本和朝鲜半岛也有分布。春兰叶姿秀美、株型典雅，花香清幽、瓣型丰富，自然花期在春节前后，相对其它不耐寒冷的兰花，春兰作为高档盆花和年宵花优势非常明显。春兰产业开发潜力巨大，但我国春兰在传统上形成了重品种，轻规模化繁殖生产的习惯，其价值取向也是以稀有程度为标准,适合普通消费者的品种几乎没有，产量和商品化程度低，无法满足市场需求。上个世纪九十年代开始春兰价格暴涨，成千上万的人上山淘兰，生态遭到巨大的破坏，1999年我国政府首先把国兰中的春兰列入《中华人民共和国农业植物新品种保护名录》，但目前我国春兰野生资源在整体上已经处于枯竭状态，从野生种中筛选优良品种可能性越来越小。因此通过高效的繁育技术生产培育春兰种苗是发展春兰产业和保护野生资源的唯一途径。
目前春兰优良种苗的高效繁育技术主要为杂交蒴果非共生萌发技术，但种子萌发产生实生苗变异严重，而应用外植体培养快繁可在短期内生产大量整齐一致的种苗，因此更适合用于春兰大规模商业化种植。
然而，由于春兰外植体诱导过程极易发生褐化，极大降低了诱导成功率。兰花的褐化是由于由于切割外植体等造成分布在液泡内的酚类物质与分布在各种质体内或细胞质内酶的区域性分布遭到破坏，氧大量侵入，从而使氧化酶和底物在氧气的作用下发生氧化反应，产生有毒的褐色醌类物质。当醌类物质扩散到培养基后，抑制了其他酶的活性，从而影响外植体的脱分化、再分化和组培苗的生长，最终导致外植体变褐死亡。在春兰组织培养中，外植体的褐变是导致培养失败的主要原因。
目前控制褐变的措施主要有：1、最好选择幼龄材料作为外植体；2、在植物休眠期或生长缓慢的季节进行取材，如早春或者冬季；3、提前对外植体材料或者母苗进行低温处理、暗处理或热激处理；4、选择适宜的培养基；5、在不影响外植体材料正常生长的前提下，添加适宜种类和浓度的防褐剂；6、低温处理或进行一段时间暗培养；7、适当增加外植体转移的周期。
虽然采取以上措施，对控制褐化有一定作用，但作用效果不够显著，褐化仍然是制约春兰组织培养成功的重要因素。因此，研究控制春兰褐化的高效技术，从根本上防控褐变，对提高兰花产业经济效益，推动兰花特别是国兰和珍贵濒危兰花的组织培养快繁，具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于解决上述技术问题，提供一种春兰组培繁殖方法，通过降低外植体褐化率，提高诱导率、缩短诱导时间，该方法技术难度低、遗传性能稳定，可避免生产中发生大量变异，对大规模生产具有重要意义。
一方面，本发明提供了一种春兰离体再生体系的建立方法，所述建立方法包括以下步骤：
步骤S1、外植体的选择与消毒；
步骤S2、外植体预处理：将消毒后的侧芽置于无菌吗啉脂肪酸盐果蜡中浸泡4-6秒，取出待果蜡凝固后，将侧芽切口部位果蜡刮掉小米粒大小，获得待接种的外植体；
步骤S3、将外植体接种在诱导培养基中，暗培养30-60天，之后光照、暗培养交替进行，即得。
进一步地，所述步骤S1的具体操作为，选择生长健壮的优良单株的侧芽作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上用75％酒精浸泡外植体25-45秒，再用10％次氯酸钠浸泡9~15分钟，之后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分。
进一步地，所述诱导培养基为1/2 MS+0.1~1.0 mg/L NAA+0.1~1.5 mg/L KT + 20~30 g/L蔗糖+ 6~8 g/L琼脂粉，pH 5.5~7.0。
进一步地，所述NAA的浓度为0.3 mg/L。
进一步地，所述KT的浓度为1.0 mg/L。
进一步地，所述步骤S3中光照、暗培养交替进行具体为，光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。
现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明首次采用无菌吗啉脂肪酸盐果蜡作对春兰的外植体侧芽浸泡，为外植体增加了一层保护层，在很大程度上保持了生物膜和细胞的完整性，保护了细胞区隔作用，并有效减少了外植体伤口的暴露面积，阻隔了氧化酶、底物及氧气的结合，大大降低了外植体的褐化起始时间和褐化率，从而提高了诱导成功率。
2、本发明采用了适合春兰外植体的诱导培养基，使得春兰能够在同一培养基中实现侧芽的诱导、根状茎增殖以及根的诱导，诱导率高，实现了春兰的一步成苗，有效缩短了春兰离体再生体系的建立时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明的实施例一的侧芽浸果蜡的图片。
图2是本发明的实施例一的侧芽从果蜡中取出的图片。
图3是本发明的实施例一的侧芽的图片。
图4是本发明的实施例一的侧芽膨大图片。
图5是本发明的实施例一的侧芽分化出根状茎的图片。
图6是本发明的实施例一的侧芽分化出的根状茎一步成苗的图片。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：
选取生长健壮的优良单株的新生1cm左右侧芽为外值体。将带有侧芽的单株用自来水冲洗干净，剪去根、叶，保留假鳞茎及侧芽，在超净工作台上用手术刀将侧芽切下，用75％酒精浸泡外植体30秒，再用10％次氯酸钠浸泡13分钟，之后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，再用无菌吗啉脂肪酸盐果蜡浸泡5秒，取出待果蜡凝固后，利用解剖针将侧芽切口部位果蜡刮掉小米粒大小。
3、离体再生体系的诱导
将消毒处理后的侧芽接种于诱导培养基中，诱导培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+ 30 g/L蔗糖+ 8 g/L琼脂粉，pH 6.0，暗培养30-60天，再光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。
实施例2
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：
选取生长健壮的优良单株的新生1cm左右侧芽为外值体。将带有侧芽的单株用自来水冲洗干净，剪去根、叶，保留假鳞茎及侧芽，在超净工作台上手术刀将侧芽切下，用75％酒精浸泡外植体30秒，再用10％次氯酸钠浸泡12分钟，之后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，再用无菌吗啉脂肪酸盐果蜡浸泡5秒，取出待果蜡凝固后，利用解剖针将侧芽切口部位果蜡刮掉小米粒大小。
3、离体再生体系的诱导
将消毒处理后的侧芽接种于诱导培养基中，诱导培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+ 25 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉，pH 5.9，暗培养30-60天，再光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。
实施例3
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：
选取生长健壮的优良单株的新生1cm左右侧芽为外值体。将带有侧芽的单株用自来水冲洗干净，剪去根、叶，保留假鳞茎及侧芽，在超净工作台上手术刀将侧芽切下，用75％酒精浸泡外植体30秒，再用10％次氯酸钠浸泡11分钟，之后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，再用无菌吗啉脂肪酸盐果蜡浸泡5秒，取出待果蜡凝固后，利用解剖针将侧芽切口部位果蜡刮掉小米粒大小。
3、离体再生体系的诱导
将消毒处理后的侧芽接种于诱导培养基中，诱导培养基为1/2 MS+0.3mg/L NAA+0.6 mg/L KT+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂粉，pH 6.0，暗培养30-60天，再光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。对比例1
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：
选取生长健壮的优良单株的新生1cm左右侧芽为外值体。将带有侧芽的单株用自来水冲洗干净，剪去根、叶，保留假鳞茎及侧芽，在超净工作台上用手术刀将侧芽切下，用75％酒精浸泡外植体30秒，再用10％次氯酸钠浸泡13分钟，之后用无菌水冲洗5次。
3、离体再生体系的诱导，同实施例1。
对比例2
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：同实施例1。
3、离体再生体系的诱导：将消毒处理后的侧芽接种于诱导培养基。诱导培养基为1/2 MS+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+ 20 g/L蔗糖+ 8 g/L琼脂粉，pH 5.8。暗培养30-60天，再光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。
对比例3
1、材料：春兰‘大富贵’
2、外植体的选择及消毒：同实施例1。
3、离体再生体系的诱导：将消毒处理后的侧芽接种于诱导培养基。诱导培养基为1/2 MS + 30 g/L蔗糖+ 8 g/L琼脂粉，pH 6.0，暗培养30-60天，再光照培养12hr/d，光照强度1500Lux，培养温度25±1℃。
效果例
分别采用实施例1、对比例1~3诱导30个侧芽，记录侧芽萌动出根状茎时间、诱导数、根状茎增殖出分枝时间、诱导出苗时间、根状茎鲜重量和褐化数，并统计根状茎诱导率、成苗诱导率、鲜重增长率和褐化率，取平均值后得到下表数据。
| 萌动出根状茎时间（d） | 根状茎诱导率（%） | 根状茎增殖出分枝时间（d） | 鲜重增长率（%） | 诱导出苗时间（d） | 成苗诱导率（%） | 褐化率（%） | |
| 实施例1 | 92 | 56.67 | 124 | 416.25 | 183 | 40.00 | 16.67 |
| 对比例1 | 110 | 30.00 | 143 | 326.75 | 215 | 26.67 | 60 |
| 对比例2 | 153 | 10.00 | 187 | 232.88 | - | 0 | 23.33 |
| 对比例3 | 247 | 3.33 | 295 | 137.50 | - | 0 | 26.67 |
如表所示，实施例1侧芽诱导出根状茎的时间为92d，而未经吗啉脂肪酸盐果蜡浸泡的对比例1萌动时间为110d，且诱导率下降，仅为26.67%；诱导出苗时间延迟32d，成苗诱导率降低13.33%，褐化率增加43.33%，可见用吗啉脂肪酸盐果蜡浸泡对促进侧芽萌动和一步成苗有明显的促进作用，并大大降低了褐化率。
侧芽诱导根状茎培养基中以6-BA代替KT的对比例2萌动时间为153d，诱导率只有13.33%。与实施例1相比，萌动时间晚61d，诱导率降低46.67%，成苗诱导率为0，可见在这个阶段所使用的培养基中添加KT是诱导的关键因素之一，KT提高了春兰根状茎诱导率和成苗诱导率，缩短了分化时间。
对比例3与实施例1相比，在根状茎增殖阶段培养基中未添加NAA等激素，其萌动出分枝时间延迟157d，根状茎诱导率降低53.34%，增殖出分枝时间延迟171d，成苗诱导率为0，且鲜重增长率降低278.75%，可见诱导培养基中添加NAA和KT大大提高了诱导成功率和诱导效率，同时根状茎增殖出分枝时间提前近1/3。
可见，诱导培养基中添加适宜浓度的NAA和KT，有效促进了根状茎的形成和增殖，并促进了一步成苗的诱导，大大提高了外植体诱导效率。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (5)
1.一种春兰离体再生体系的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括以下步骤：
步骤S1、外植体的选择与消毒；
步骤S2、外植体预处理：将消毒后的侧芽置于无菌吗啉脂肪酸盐果蜡中浸泡4-6秒，取出待果蜡凝固后，将侧芽切口部位果蜡刮掉小米粒大小，获得待接种的外植体；
步骤S3、将外植体接种在诱导培养基中，暗培养30-60天，之后光照、暗培养交替进行，即得；其中，所述诱导培养基为1/2 MS+0.1~1.0 mg/L NAA+0.1~1.5 mg/L KT + 20~30 g/L蔗糖+ 6~8 g/L琼脂粉，pH 5.5~7.0。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤S1的具体操作为，选择生长健壮的优良单株的侧芽作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上用75％酒精浸泡外植体25-45秒，再用10％次氯酸钠浸泡9~15分钟，之后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分。
3. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述NAA的浓度为0.3 mg/L。
4. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述KT的浓度为1.0 mg/L。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤S3中光照、暗培养交替进行具体为，光照培养12hr/d，光照强度1500-2000Lux，培养温度25±1℃。
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