CN110326537B - 一种香椿丛生芽诱导及增殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香椿丛生芽诱导及增殖方法，以当年生未木质化枝条作外植体，置于特定的诱导培养基上，在温度25℃，湿度60％,光照强度20～60μmolm‑2s‑1，光诱导时间16h/d的培养条件下诱导形成愈伤组织，然后在相同的培养条件下，在特定的分化培养基上诱导形成丛生芽；当丛生芽长到3cm以上时切下，选择致密的愈伤组织继续增殖培养。采用本发明的方法，茎段的愈伤组织诱导率可达100％，丛生芽的诱导率高于50％，丛生芽增殖倍数高于8，最高可达26。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种香椿丛生芽诱导及增殖方法。
背景技术
香椿是我国独有的一种材菜兼用的珍贵速生树种，在农业和林业生产中具有重要的经济价值。
在自然状态下，香椿主要靠根蘖繁殖，优点是生长迅速，并能保持母树优良性状，缺点是数量有限不能满足大面积栽培的需要。种子播种和扦插育苗繁殖也是常用的香椿繁殖方法。但是，种子繁殖其后代容易产生性状分离退化，大大降低香椿的商品价值，而扦插繁殖受材料限制，繁殖系数低、繁殖速度慢也无法满足生产需要。因此，香椿组织培养方法在近几十年里得到了广泛的应用，其能够在短时间内获得大量植株，且可以保持母树的优良性状。
随着分子生物学技术的发展，利用愈伤组织分化进行无性快繁在香椿繁殖技术领域得到初步应用。例如授权专利ZL201610947913.3和专利申请CN107006372A中均采用了愈伤组织分化进行香椿快繁，但是上述两个专利的愈伤组织诱导培养基中国均需要添加TDZ以提高形成愈伤组织的能力，但是添加TDZ明显增加了生产成本，不利于在生产实践中进行推广应用,且上述两个专利的繁殖效率较低，还需进一步提高。另外，专利ZL20161094采用种子和叶片作为外植体，材料来源易受母体年龄和大小年结实限制。康冰等在“采用香椿无性系愈伤组织诱导及植株再生”(《园艺学报》2004，第1期第15页)一文中也公开了采用愈伤组织诱导芽分化进行香椿无性繁殖的方法，但是其不定芽的增殖倍数仅为5.5，且其并未对愈伤组织多次再利用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种一种香椿丛生芽诱导及增殖方法，包括如下步骤：
(1)选择当年生未木质化枝条作外植体；
(2)将外植体置于诱导培养基上，在温度25℃，湿度60％,光照强度20～60μmolm- 2s-1，光诱导时间16h/d的培养条件下诱导形成愈伤组织；诱导培养基为MS培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L；
(3)在相同的培养条件下，在分化培养基上诱导愈伤组织分化形成丛生芽；分化培养基为MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；
(4)切下丛生芽，选择致密的愈伤组织切下并在相同的培养条件下继续用分化培养基进行再增殖培养。
进一步的，步骤(1)包括：将采集的当年生未木质化枝条上的叶片去掉并剪为4_6cm，用洗衣粉水冲洗10min，再用流水冲洗1h，滤干；在超净工作台中，用75％酒精处理30s，无菌水洗涤3次；然后用2％次氯酸钠处理5min，无菌水洗涤3次后，吸干水，将外植体切成1cm备用。
优选的，当愈伤组织生长到约2cm*2cm时诱导分化丛生芽。
优选的，诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。
优选的，当大部分丛生芽长到3cm以上时，切下丛生芽。
进一步的，将步骤(4)中获得的丛生芽种植于生根培养基中生根。
进一步的，重复步骤(4)再增殖培养4-5次。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过诱导愈伤组织分化芽实现了香椿的快繁，克服了传统繁殖方法繁殖速度慢、数量有限的缺陷。
(2)本发明以当年生未木质化枝条为外植体，材料来源不受母体年龄和大小年结实限制，材料活力强。本申请通过对愈伤组织诱导培养基和分化培养基以及对应的培养条件的优化选择，解决了现有技术中采用TDZ诱导生产成本高的技术问题，培养基中不需要加入激素TDZ愈伤组织生长质量很好。其茎段的愈伤组织诱导率可达100％，丛生芽的诱导率高于50％，丛生芽增殖倍数高于8，最高可达26。
(3)本发明对愈伤组织进行了多次再利用，丛生芽生长期愈伤组织也在生长，一个周期45天后，愈伤组织直接可进入下一轮丛生芽诱导，如此可反复4-5次丛生芽诱导，大大提高了丛生芽诱导效率，降低了生产成本，比康冰等在“采用香椿无性系愈伤组织诱导及植株再生”(《园艺学报》2004，第1期第15页)一文中采用愈伤组织诱导芽分化进行香椿无性繁殖的方法提高效率10倍以上。
附图说明
图1为不同浓度6-BA处理下的香椿外植体诱导愈伤情况图；
图2为不同浓度NAA处理下的香椿外植体诱导愈伤情况图；
图3为NAA浓度为0.5时，与不同浓度6-BA组合诱导愈伤组织情况图；
图4为采用MS培养基，在NAA浓度为0.5时，与不同浓度6-BA组合诱导愈伤组织情况图；
图5为采用图4的2种诱导培养基诱导的愈伤组织在分化培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L上分化丛生芽30天的生长状况；
图6为再增殖培养情况图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、外植体与消毒方式的选择
2018年4月25日自中国林科院内采集香椿树当年生未木质化枝条作外植体。将枝条上的叶片去掉并剪为4—6cm左右，用洗衣粉水冲洗10min，再用流水冲洗1h，滤干。在超净工作台中，用75％酒精处理30s，无菌水洗涤3次，然后，采用2％次氯酸钠(NaClO3)分别做5min、8min、10min三个处理，处理后采用无菌水洗涤3次，吸干水，将外植体切成1cm左右。
结论：在3种消毒方法处理下，外植体均未污染和褐化。故为节约时间，外植体消毒可采用第一种方式，将枝条上的叶片去掉并剪为4_6cm，用洗衣粉水冲洗10min，再用流水冲洗1h，滤干。在超净工作台中，用75％酒精处理30s，无菌水洗涤3次，2％次氯酸钠(NaClO3)5min处理，无菌水洗涤3次后，吸干水，将外植体切成1cm。
实施例2、茎段诱导愈伤组织
将消毒过的香椿树茎段作外植体。愈伤组织培养基选择在MS培养基中添加激素。激素采用不同浓度6-BA、NAA、2,4-D及激素组合(具体参见表1-5所示)。温度为25℃，湿度为60％,光照强度为20～60μmolm-2s-1，光诱导时间为16h/d。
表1、不同浓度6-BA处理下的香椿外植体诱导愈伤情况
结合表1和图1可以看出，茎段诱导愈伤组织时，培养基中加入浓度0.5-5.0mg/L的6-BA均能诱导出愈伤组织，可见诱导愈伤组织6-BA是必须激素。
表2、不同浓度NAA诱导愈伤情况
结合表2和图2可以看出，NAA浓度小于0.5mg/L时，愈伤组织生长缓慢；NAA浓度为0.5mg/L和0.6mg/L时，愈伤组织生长快且健康；NAA浓度为0.6mg/L以上时，有根长出，随着浓度增加生根数增加；NAA浓度为0.8mg/L到1.5mg/L时，愈伤组织水渍化，部分愈伤组织生乳白色蓬松根；NAA浓度为2.0mg/L时，全部生乳白色蓬松根。因此，诱导愈伤组织培养中NAA最适浓度为0.5mg/L。表
3、不同浓度2,4-D诱导愈伤组织生长情况
由表3可以看出，2,4-D脱分化能力太强，诱导出的愈伤水渍化严重，不宜于茎段诱导愈伤组织。
表4、NAA浓度为0.5与不同浓度6-BA组合诱导愈伤组织情况
注：基本培养基为MS
结合表4和图3可以看出，NAA浓度为0.5mg/L时，浓度为0.1-1.5mg/L的6-BA均能诱导出愈伤组织，当NAA浓度为0.5mg/L,6-BA浓度0.5mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L时愈伤组织诱导率高，几乎100％。愈伤组织为浅白绿色生长快且均一，愈伤紧致。可见当NAA浓度为0.5mg/L、6-BA浓度(0.5—1.0)mg/L、都可以作为愈伤组织诱导的培养基激素配比。为培养基配置方便，故最佳愈伤组织诱导培养基可为MS+NAA0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L和MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L。
通过图4可以看出，诱导培养基MS+NAA0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L和MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L诱导出的愈伤组织，经过增殖培养后，没有明显差异。进一步确定MS+NAA0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L和MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L都可做诱导愈伤组织培养基。
实施例3、丛生芽诱导
愈伤组织生长到2cm*2cm左右时，分别用MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L和MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L三种培养基诱导丛生芽。温度为250C，湿度为60％,光照强度20～60μmolm-2s-1，光诱导时间为16h/d。
30天后，MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L无丛生芽，MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L诱导出的愈伤组织多于诱导出的丛生芽，MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L诱导出的丛生芽率为50％(见图5)。如图5所示，采用MS+NAA0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基诱导的愈伤组织分化丛生芽长势比MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基诱导的愈伤组织分化丛生芽更健壮，故诱导愈伤组织的诱导培养基进一步优选为MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L，诱导丛生芽的分化培养基最佳为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L可作为养基。
实施例4、丛生芽增殖
丛生芽诱导过程中，愈伤组织也在增大，当大部分丛生芽长到3公分以上时，在超净工作台打开无菌愈伤组织丛生芽苗，将其放置在无菌滤纸上，切去愈伤组织，将3公分以上芽，种植于生根培养基中生根，每瓶3株。将切下的愈伤组织，选取致密的继续用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基进行再增殖培养，其培养条件与实施例3中相同，上述再增殖培养可重复4-5次。
如图6所示，其中图A为切除丛生芽后选取的致密愈伤组织刚转移到分化培养基中进行再增殖培养的情况；图B为再增殖培养45天后丛生芽分化生长情况。结合图B可以看出，待45天时，3公分以上丛生芽可达8株以上，最多达26株。以45天为一个繁殖周期，其平均增殖倍数在8以上，最高增殖倍数可达26。
Claims (4)
1.一种香椿丛生芽诱导及增殖方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选择当年生未木质化枝条作外植体；
(2)将外植体置于诱导培养基上，在温度25℃，湿度60％,光照强度20～60μmol·m-2·s-1，光诱导时间16h/d的培养条件下诱导形成愈伤组织；
(3)在相同的培养条件下，当愈伤组织生长到2cm*2cm时在分化培养基上诱导愈伤组织分化形成丛生芽；
(4)当大部分丛生芽长到3cm以上时，切下丛生芽，选择致密的愈伤组织切下并在相同的培养条件下继续用分化培养基进行再增殖培养；
重复所述步骤(4)再增殖培养4-5次；
所述诱导培养基为MS培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；
所述分化培养基为MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
2.根据权利要求1所述的香椿丛生芽诱导及增殖方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将采集的当年生未木质化枝条上的叶片去掉并剪为4-6cm，用洗衣粉水冲洗10min，再用流水冲洗1h，滤干；在超净工作台中，用75％酒精处理30s，无菌水洗涤3次；然后用2％次氯酸钠处理5min，无菌水洗涤3次后，吸干水，将外植体切成1cm备用。
3.根据权利要求1所述的香椿丛生芽诱导及增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。
4.根据权利要求1所述的香椿丛生芽诱导及增殖方法，其特征在于，将所述步骤(4)中获得的丛生芽种植于生根培养基中生根。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210119 |
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