CN116369196B - 一种异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法，包括用无菌苗茎段节间进行胚性愈伤组织诱导以及将诱导出的胚性愈伤组织分化不定芽的步骤，其中，胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+6‑BA2mg/L+NAA0.1mg/L；胚性愈伤组织分化培养基为：MS+6‑BA2mg/L+IBA 0.1‑0.3mg/L。本发明成功建立完整的异色溲疏组织培养体系，包括将茎段节间接种于诱导愈伤组织培养基诱导出胚性愈伤组织，诱导出的胚性愈伤组织接种于分化培养基中获得不定芽，将不定芽转移到继代培养基中获得丛生芽，将丛生芽转入生根培养基中得到生根苗，炼苗移栽。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法。
背景技术
异色溲疏隶属于绣球花科，溲疏属，其花多而美丽且花期集中在少花的初夏，它多生长在林下和石头缝里，是花境优良的背景材料，是一种较好的园林绿化树种。其本名也有“利尿”之意，记载有清热解毒等药用功效。我国是溲疏属植物的亚洲分布中心，也是世界上溲疏属分布最多的国家，然而目前对于异色溲疏组织培养体系的报道未查询到。
异色溲疏种子较小，播种繁殖成功率较低并且长势相对较慢，生长年限较长；扦插繁殖操作较为简单，但异色溲疏对温度和湿度极为敏感，对于温度和湿度的控制较为困难，成活率较低且生长年限较长；组织培养可以快速、高效繁殖，成活率较高，但现有的快速繁殖体系对于异色溲疏的繁殖系数较低，生长速率较低，使用以上报道的配方无法达到对于异色溲疏的组织培养体系建立，对溲疏属植物的组织培养研究只涉及最为简单的快速繁殖体系搭建，未见愈伤组织诱导及分化培养系统的报道。
现有技术没有涉及异色溲疏(Deutzia discolor)物种的组织培养技术报道，只有相关种类，如小花溲疏(Deutzia parviflora)和大花溲疏(Deutzia grandiflora),以及溲疏的品种矮溲疏(Deutzia hybrida‘Boule’)的组织快繁技术报道。
史宝胜等(2006)研究了野生小花溲疏种子发芽、硬枝扦插和组织培养条件。研究结果表明：该种子最适发芽温度为20℃；以二年生的溲疏枝条扦插生根率最高；溲疏组织培养适宜培养基：①初代培养：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1 mg/L；②继代培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1 mg/L；③生根培养基：1/2MS+IAA1.0 mg/L。史宝胜等(2006)研究了野生大花溲疏的组织培养条件。研究结果表明：溲疏组织培养适宜培养基：①初代培养：MS+6-BA2 mg/L+NAA0.1mg/L；②继代培养基：MS+6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L；③生根培养基：1/2MS+IAA1.0mg/L。柴慈江等(2010)研究了矮溲疏试管苗的茎芽增殖和生根培养技术。研究结果表明：①大量元素浓度为1/2MS处理的茎芽增殖系数可达3.9，与MS处理差异不明显，但在0.05水平显著高于1/4MS处理；②0-0.8mg/LIBA对矮溲疏试管苗的茎芽增殖无明显作用；③蔗糖浓度为5g/L处理的茎芽增殖系数为3.8与10和30g/L处理无明显差异，但在0.05水平显著高于15g/L处理。上述处理的试管苗生根率均为100％。④以土取代琼脂作培养基支撑物进行矮溲疏试管苗的生根培养，生根率可达100％，根茎比大于琼脂支撑培养对照，根毛也长于对照。
然而，使用以上报道的配方无法达到对于异色溲疏的组织培养体系建立，尤其是利用叶片进行愈伤组织诱导和分化在整个溲疏属未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种异色溲疏组织培养方法。
以异色溲疏茎段为外植体材料，从外植体灭菌条件得到无菌培养苗；获得优化继代培养基的激素配方，使其繁殖系数最优；优化生根培养基的激素配方，使其生长速率最优，生根率最高；随后进行炼苗和移栽；最终建立了异色溲疏的快速繁殖体系。
通过不同器官：叶片和不带芽茎段诱导愈伤组织，将叶片接种于诱导愈伤组织培养基诱导出非胚性愈伤组织，诱导出的非胚性愈伤组织进行增殖培养后接种于分化培养基中获得不定根；将不带芽茎段接种于诱导愈伤组织培养基诱导出胚性愈伤组织，诱导出的胚性愈伤组织接种于分化培养基中获得不定芽，将不定芽转移到继代培养基中获得丛生芽，将丛生芽转入生根培养基中得到生根苗，随后进行炼苗和移栽，最终建立了异色溲疏的组织培养体系。
一种异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法，包括用无菌苗茎段节间进行胚性愈伤组织诱导以及将诱导出的胚性愈伤组织分化不定芽的步骤，其中，胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA2mg/L+NAA 0.1mg/L；胚性愈伤组织分化培养基为：MS+6-BA2mg/L+IBA0.1-0.3mg/L。
其中，所述胚性愈伤组织诱导过程具体为：取无菌苗茎段，去除带有芽点的位置，修剪不带芽点的节间至1-2cm，接种于所述的愈伤组织诱导培养基，光照下诱导获得胚性愈伤组织。
在本发明一个实施方案中，所述的异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法还包括以异色溲疏幼嫩带芽茎段或者茎尖为外植体获得无菌苗的步骤。
其中，将取幼嫩茎尖带2-4片小叶的异色溲疏，表面灭菌后接种于MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L培养基中，诱导不定芽。
其中，所述的表面灭菌方式为：用洗洁精清洗幼嫩茎尖后流水处理1h，在操作台修剪茎尖至1-2cm，75％酒精处理10-30s，再用0.1％升汞消毒处理1-9min，再用无菌水冲洗3-5次。
在本发明一个实施方案中，所述的异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法还包括将胚性愈伤组织分化的不定芽进行继代增殖的步骤，继代增殖培养基为MS+6-BA 1-3mg/L+NAA 0-0.1mg/L。
其中，所述的不定芽进行继代增殖包括将获得的不定芽修剪茎段至1-2cm，接种于培养基MS+6-BA 1-3mg/L+NAA 0-0.1mg/L中进行不定芽增殖。
在本发明一个实施方案中，所述的异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法还包括将不定芽进行生根的步骤，生根培养基分别为1/2MS+IBA 0.8mg/L或1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L。
一种异色溲疏愈伤组织诱导以及不定根再生的方法，包括用无菌苗叶片进行非胚性愈伤组织的诱导、非胚性愈伤组织增殖以及非胚性愈伤组织诱导不定根的步骤，其中，非胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D 1-3mg/L；非胚性愈伤组织增殖培养基为：MS+2,4-D1mg/L；不定根诱导培养基为：MS+2,4-D 1mg/L。
其中，所述无菌苗叶片非胚性愈伤组织诱导具体为：取无菌苗叶片，去除叶片首尾两端，沿叶片叶脉纵切造伤，接种于所述的愈伤组织诱导培养基，暗培养诱导获得非胚性愈伤组织。
本发明成功建立了完整的异色溲疏快速繁殖体系，包括初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽。
本发明成功建立完整的异色溲疏组织培养体系，包括将茎段节间接种于诱导愈伤组织培养基诱导出胚性愈伤组织，诱导出的胚性愈伤组织接种于分化培养基中获得不定芽，将不定芽转移到继代培养基中获得丛生芽，将丛生芽转入生根培养基中得到生根苗，炼苗移栽。这使得溲疏属组织培养体系更加完善，繁殖效率更高，可以做到市场化育苗，更好的满足市场对于溲疏属这一类花灌木的需求；为后续溲疏属的遗传转化体系奠定了组织培养基础，同时也为更多木本植物组织培养体系的搭建提供了范例。
附图说明
图1所示为不同培养培养基对于增殖系数和株高生长量的影响。
图2所示为不同培养培养基对于根个数和株高的影响。
图3所示为外植体初代培养。
图4所示为无菌苗继代培养。
图5所示为无菌苗生根培养。
图6所示为无菌苗炼苗移栽。
图7所示为茎段节间胚性愈伤组织的诱导。
图8所示为胚性愈伤组织不定芽的分化。
图9所示为分化后的植株增殖。
图10所示为分化出的植株驯化移栽。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1利用异色溲疏幼嫩茎段为外植体材料诱导植株再生和快繁的方法
(1)初代培养：主要在于外植体灭菌条件，75％酒精和0.1％升汞的消毒处理时间，解决植株污染和组织透明化问题；取幼嫩茎尖带2-4片小叶的异色溲疏，用洗洁精清洗幼嫩茎尖后流水处理1h，在操作台修剪茎尖至1-2cm，开始进行75％酒精(30s、20s、10s)和0.1％升汞(9mim、6min、3min、2min、1min)的消毒处理，再用无菌水冲洗3次，接入培养基配比为MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L(PH为6.2)。观察并统计其污染率和成活率。结果如表1所示。
表1
从表1可以看出，75％酒精10s和0.1％升汞3min为最优组合，其污染率为0，成活率为100％。
(2)继代培养：主要在获得最适继代培养基激素配比，选择6-BA和NAA两种激素，设置不同的激素配比，使其繁殖系数达到最高；取无菌苗若干，修剪茎段至1-2cm，分别接入培养基为N0：MS+6-BA 2mg/L；B1：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；B2：MS+6-BA 2mg/L+NAA0.1mg/L；B3：MS+6-BA 3mg/L+NAA0.1mg/L(pH为6.2)。30天后观察并统计其繁殖系数，结果见图1
从图1可以看出，MS+6-BA 2mg/L为最适继代培养基配方，其繁殖系数可以达到2.8。
(3)生根培养：主要在于验证了最适生根培养基激素配比，选择IBA和NAA两种激素，设置不同的激素配比，使其生根条数最多，增长速率最高；取无菌苗若干，修剪茎段至2-3cm，去除基部叶片，分别接入培养基为生1：1/2MS+IBA 0.8mg/L；生2：1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L(pH为6.2)。结果如图2所示。可以看出，1/2MS+IBA 0.8mg/L为最适培养基配方。
(4)炼苗移栽：通过常规炼苗技术，可以达到70％的成活率。
本发明成功建立了完整的异色溲疏快速繁殖体系，包括初代培养(图3)、继代培养(图4)、生根培养(图5)和炼苗移栽(图6)。
实施例2利用异色溲疏无菌苗进行诱导愈伤组织及植株再生
利用实施例1获得的异色溲疏无菌苗，以叶片和不带芽茎段(节间)进行诱导愈伤组织及植株再生试验。
(1)叶片愈伤组织诱导、增殖和分化：
取无菌苗若干，去除叶片首尾两端，沿叶片叶脉纵切造伤，修剪叶片至1.0*0.5cm2，分别接入培养基为MS+2,4-D 1mg/L、MS+2,4-D 2mg/L、MS+2,4-D 3mg/L(pH为6.2)。暗培养，观察并统计其愈伤组织诱导率和愈伤组织状态，结果如表2所示。
表2
从表2结果可以看出，MS+2,4-D 1mg/L是获得愈伤组织速度最快，效果最好的配方，诱导率80％。
叶片愈伤组织增殖：取上述培养好的带有愈伤组织的叶片若干，剔除已褐化的愈伤组织，接入培养基为D1：MS+2,4-D 1mg/L(pH为6.2)。观察并统计愈伤组织增殖率，结果见表3。
表3
愈伤组织分化：
取进行暗培养处理两周后，将带有愈伤组织的叶片若干，分别接入培养基为D1：MS+2,4-D 1mg/L；D2：MS+2,4-D 2mg/L；D3：MS+2,4-D 3mg/L(pH为6.2)。观察并统计愈伤组织分化率，结果见表4。
表4
从表4中可以看出，叶片愈伤组织仅能分化出不定根，而不能分化出不定芽。
以叶片为外植体，采用上述过程进行愈伤组织诱导和分化试验，区别在于愈伤组织诱导采用光培养而不采用暗培养，其它过程和培养基相同。结果，光培养获得的叶片愈伤组织也仅能诱导出不定根，而不能诱导出不定芽。
(2)节间愈伤组织诱导
在前期的无菌苗继代增殖过程中发现，茎段接触到B2培养基(MS+6-BA 2mg/L+NAA0.1mg/L)表面都会产生大量的胚性愈伤组织。因此，以该培养基作为节间愈伤组织诱导培养基。
取无菌苗若干，去除带有芽点的位置，修剪不带芽点的节间至1-2cm，接入上述愈伤组织诱导培养基，放在光照下培养，观察并统计其愈伤组织诱导率和愈伤组织状态，结果如表5示。
表5
胚性愈伤组织不定芽的分化
取进行正常光照处理两周后，剔除掉胚性愈伤组织的茎段，将剔除后的胚性愈伤组织若干，分别接入培养基为I1：MS+6-BA2mg/L+IBA 0.1mg/L；I2：MS+6-BA 2mg/L+IBA0.2mg/L；I3：MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.3mg/L(pH为6.2)。观察并统计胚性愈伤组织分化率，结果如表6所示。
表6
从表6可以看出，最适的愈伤组织分化培养基为MS+6-BA2mg/L+IBA 0.3mg/L，分化率8％。
(4)愈伤组织分化后的植株再生
取已分化的叶片若干，分离已分化形成的丛芽，接入上述快速繁殖体系的继代培养基中，一段时间后，转接至生根培养基中，待植株形成成苗后驯化移栽，得到完整植株。
本申请成功建立完整的异色溲疏组织培养体系，包括将茎段节间接种于诱导愈伤组织培养基诱导出胚性愈伤组织(图7)，诱导出的胚性愈伤组织接种于分化培养基中获得不定芽(图8)，将不定芽转移到继代培养基中获得丛生芽(图9)，将丛生芽转入生根培养基中得到生根苗，炼苗移栽(图10)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种异色溲疏愈伤组织诱导以及植株再生的方法，其特征在于，包括用无菌苗茎段节间进行胚性愈伤组织诱导以及将诱导出的胚性愈伤组织分化不定芽的步骤，其中，胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L；胚性愈伤组织分化培养基为：MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.2-0.3mg/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导过程具体为：取无菌苗茎段，去除带有芽点的位置，修剪不带芽点的节间至1-2cm，接种于所述的胚性愈伤组织诱导培养基，光照下诱导获得胚性愈伤组织。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以异色溲疏幼嫩带芽茎段或者茎尖为外植体获得无菌苗的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，取幼嫩茎尖带2-4片小叶的异色溲疏，表面灭菌后接种于MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L培养基中，诱导不定芽。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的表面灭菌方式为：用洗洁精清洗幼嫩茎尖后流水处理1h，在操作台修剪茎尖至1-2cm，75%酒精处理10-30s，再用0.1%升汞消毒处理1-9min，再用无菌水冲洗3-5次。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将胚性愈伤组织分化的不定芽进行继代增殖的步骤，继代增殖培养基为MS+6-BA 2mg/L；MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；MS+6-BA2 mg/L+NAA 0.1mg/L；或者MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.1 mg/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的不定芽进行继代增殖包括将获得的不定芽修剪茎段至1-2cm，接种于培养基MS+6-BA 2mg/L；MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1mg/L；或者MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.1 mg/L中进行不定芽增殖。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将不定芽进行生根的步骤，生根培养基分别为1/2MS+IBA 0.8mg/L或1/2MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
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