CN109452170B - 一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法 - Google Patents

一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，该方法以玉蝉花根部带有须根的成熟区根段为外植体，先对成熟的种子进行消毒，接入种子萌发培养基MS+6‑BA 0.5mg/L，种子萌发率约为100％，待长成带有2‑3片叶的幼苗时，再将幼苗接入生根培养基使其长成具有发达根系的无菌苗，接着切取长1.0‑1.5cm的带有须根(须根部分切除，露出伤口)的成熟区根段放入诱导培养基，其最佳培养基为MS+6‑BA 1.0mg/L+2,4‑D 2mg/L+NAA 0.2mg/L，30天时诱导率高达100％，为优化组织培养体系及建立遗传转化体系奠定坚实基础。

Description

一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法
技术领域
本发明涉及一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法,涉及植物组织培养技术领域。
背景技术
玉蝉(Iris ensata)是鸢尾科鸢尾属的多年生草本植物，其花色艳丽而丰富、株型俊美、抗寒能力强、观赏价值高，做为园林绿化和插花花卉，具有极高的市场潜力，在园林上用途比较广泛，主要应用在林下观赏植被、绿地片植、草地点缀、模纹花坛等方面；玉蝉可作为盆栽花卉应用于室内小环境家居装饰，同时也可用作插花材料。
组织培养因可高效繁殖植株并且可以改进植株质量，而被广为使用(Shimizu,K.et al.)。E.V.Boltenkov和E.V.Zarembo以玉蝉种子为外植体，研究了外植体在脱分化和再分化过程中与激素含量变化的关系，未统计诱导率，且根未形成(E.V.Boltenkov andE.V.Zarembo，2005)。2007年E.V.Boltenkov等人又从植物激素对愈伤组织培养植株再生的影响进行研究，结果表明2,4-D对愈伤组织的形成影响最大，在6-苄基氨基嘌呤的存在下，2,4-D配合激动素(KT)最易产生不定芽，而芽和根原基的发育是用吲哚乙酸(2mg/L)置换2,4-D后观察。再生植株的根系萌生需要一种无激素的培养基(E.V.Boltenkov，et al.，2007)。庄春慧等人利用玉蝉花的种胚进行了丛生芽诱导及植株再生的研究(庄春慧等，2014)。曹柏选择玉蝉花茎尖做外植体，愈伤组织诱导率达到51.51％，而叶片作为外植体则没有诱导出愈伤组织(曹柏，2016)。Tikhomirova,L.以花序轴(卵巢碎片、花丝、花药、花柱和雌蕊的柱头)和花被管为外植体诱导产生不定芽，结论为：正确选择外植体至关重要，不定芽是从外植体中预先存在的分生组织发育而来的卵巢，花柱和花丝无再生能力。(Tikhomirova,L.，2017)
目前玉蝉愈伤组织的诱导率不高，且未见有人使用玉蝉花根部的成熟区根段作为外植体进行诱导愈伤组织，高诱导率可为建立高效组培体系及成功建立遗传转化体系奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法,该方法可诱导培育出大量生长健壮的愈伤组织,在适当的条件下可再分化形成不定芽，进而形成植株,从而实现玉蝉种苗的快速繁殖及为花色遗传研究前期工作打下基础。
本发明提供的一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，技术方案如下：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且种荚开裂的玉蝉种子，将其进行消毒处理；
(2)无菌苗的产生：将消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂中，待其萌发出带有2-3片叶的幼苗后，再将幼苗接入固体培养基MS+活性炭1g/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂中，培养出无菌苗；
(3)愈伤组织的诱导及产生：用无菌手术刀切取无菌苗根部的带有须根部分的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，接入固体诱导培养基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 2mg/L+NAA0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂中，培养15天继代1次，连续继代2次，最终选取获得的颜色为黄色的愈伤组织；
上述所有的操作步骤均在无菌工作台中操作，所有培养基的PH值均调节至5.9，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)；
进一步地，步骤(2)中所述消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂是指消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂后可不用进行暗处理及变温处理，约6天后开始萌发，萌芽率约为100％；
进一步地，步骤(3)中所述切取无菌苗根部的带有须根部分的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，放入诱导培养基是指切取无菌苗根部生长健壮的带有须根部分(每个须根的一部分切除，保留靠近须根与主根连接处的一小部分须根，而不是将一根须根全部切除，露出伤口)的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，放入诱导培养基；
进一步地，步骤(3)中所述选取获得的颜色为黄色的愈伤组织是指颜色为黄色、颗粒明显且松散的愈伤组织；
本发明采用组织培养技术，在愈伤组织诱导过程中产生的有益效果：诱导过程中无褐化现象，产生愈伤组织的没有细菌感染，诱导率高达100％，为实现玉蝉种苗的快速繁殖提供一条新的途径。
图1是玉蝉花根的结构示意图；
图2是玉蝉花根的成熟区根段示意图；
图3是玉蝉花成熟区根段诱导愈伤示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本实施例提供的玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法包括如下步骤：
种子的选择及消毒：挑选已成熟且种荚开裂的玉蝉种子放入锥形瓶中，加入适量的水和洗洁剂，不停的摇晃10min去除杂质，之后在流水下冲洗1h，无泡沫后用初始温度为40℃的自来水浸泡1d，然后在无菌操作台中将种子重新放在已灭菌的锥形瓶中，用无菌纱布封口，75％的酒精消毒1min，无菌水冲洗3次，4％的NaClO消毒30min，无菌水冲洗5次(庄春慧等，2014)；
无菌苗的产生：使用无菌的手术刀和镊子将消毒后的种子剥除种皮接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂中，接种密度为15粒/皿，培养约6d时种子开始萌发，20d左右长成具有2-3片叶的幼苗，将幼苗接入固体培养基MS+活性炭1g/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂中，培养基的PH值为5.9，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)，；
愈伤组织的诱导及产生：使用无菌手术刀切取无菌苗根部带有须根部分的成熟区根段，将根段放在无菌水中清洗至几乎无活性炭附着，再将成熟区根段用无菌手术刀切至长度为1.0-1.5cm/段，用镊子将已切好的根段接入固体诱导培养基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D2mg/L+NAA 0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂中，培养15天继代1次，连续继代2次，培养基的PH值为5.9，接种密度为15个/皿，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)，最终选取获得的颜色为黄色且生长健壮的愈伤组织，其褐化率为0％，污染率为0％，诱导率高达100％。
诱导培养基选择试验
根据已公布资料初选适于玉蝉花根部的成熟区根段诱导愈伤组织的激素浓度，选择MS培养基做基础培养基，在培养基中添加不同浓度的激素(6-BA、NAA和2,4-D)，分别进行L9(34)正交试验，同时培养基中添加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，调节PH至5.9。接种时每个处理接种30个根段，3个重复，培养30d后进行数据统计，具体见表1。
表1不同浓度激素L9(34)正交试验结果比较
Figure GDA0003206605270000031
可以看出6-BA浓度为1mg/L时，与其他两种激素配合所培养出的愈伤组织状态最好，且诱导率较高，NAA浓度为0.2mg/L时，与其他两种激素配合所培养出的愈伤组织状态较好，诱导率也很高；
结果表明，在培养基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂上，玉蝉花根部的成熟区根段诱导率最高，达100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，其描述较为详细和准确，但并不用以限制本发明，凡在本发明构思之内所做的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，其特征在于：
(1)种子的选择及消毒：选择成熟且种荚开裂的玉蝉花种子，将其进行消毒处理；
(2)无菌苗的产生：将消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂中，待其萌发出带有2-3片叶的幼苗后，再将幼苗接入固体培养基MS+活性炭1g/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂中，培养出无菌苗；
(3)愈伤组织的诱导及产生：用无菌手术刀切取无菌苗根部的带有须根部分的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，接入固体诱导培养基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂中，培养15天继代1次，连续继代2次，最终选取获得的颜色为黄色的愈伤组织；
上述所有的操作步骤均在无菌工作台中操作，所有培养基的PH值均调节至5.9，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)。
2.根据权利要求1所述的玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，其特征在于步骤(2)中所述消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂是指消毒后的种子接入固体培养基MS+6-BA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂后可不用进行暗处理及变温处理，约6天后开始萌发，种子萌发率约为100％。
3.根据权利要求1所述的玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，其特征在于步骤(3)中所述切取无菌苗根部的带有须根部分的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，放入诱导培养基是指切取无菌苗根部生长健壮的带有须根部分(每个须根的一部分切除，保留靠近须根与主根连接处的一小部分须根，而不是将一根须根全部切除，露出伤口)的成熟区根段，长度为1.0-1.5cm，放入诱导培养基。
4.根据权利要求1所述的玉蝉花根部诱导愈伤组织培养的方法，其特征在于步骤(3)中所述选取获得的颜色为黄色的愈伤组织是指颜色为黄色、颗粒明显且松散的愈伤组织。
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