CN108094200A - 一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：外植体处理；愈伤组织诱导及增殖；不定芽诱导及增殖；不定芽变温热处理；茎尖剥离；茎尖愈伤组织不定芽分化与增殖；病毒检测；脱毒不定芽材料获得；脱毒苗获得。本发明的有益效果为：以本发明方法获得的脱毒苗与直接采用热处理而未进行茎尖剥离的处理方法相比，脱毒率更高，与直接从盆栽植株上获取茎尖外植体进行脱毒苗培育相比，具有一个植株可为茎尖剥离提供上千个外植体的优势，还具有污染率低，成本低，无需损伤取材母株等特点，以此方法进行安祖花脱毒苗培育可在短时间内获得大量脱毒效率高生长健壮的无毒苗，为安祖花脱毒苗的工厂化繁育提供了技术基础。

Description

一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物脱毒及组织培养技术领域，具体涉及一种热处理结合茎尖剥离获 得安祖花脱毒苗的培育方法。

背景技术

[0002] 安祖花(Anthuium andraeanum Lind)是天南星科多年生常绿草本植物，又名红 掌，花烛、火鹤花等，其花形独特，花色艳丽，是花卉市场的高档花卉之一，是重要场合的高 档花卉摆设和切花的首选类型，具有较高的观赏价值和经济价值，已成为全球销售量仅次 于热带兰的第二大商品花卉。

[0003] 病毒是威胁植物品质和产量的主要问题之一，目前仍然没有特效防治药物，而且 由于病毒的侵染，许多作物或花卉的产量、质量不断下降。

[0004] 我国于20世纪70年代后期开始引进栽培安祖花，随后广东、海南、云南等地逐渐成 为我国安祖花鲜切花的主产区，随着安祖花规模化种植的发展，安祖花病毒病也随着不断 地继代而大量积累，造成种质退化，甚至丧失商品价值，已成为安祖花产业化发展进程中一 项毁灭性的病害。目前已报道的安祖花病毒病有芋花叶病毒(DMV)，一经感染，植株会表现 出花叶、叶片变小皱缩、植株明显矮化、花小或不开花，严重影响了其观赏品质。

[0005] 热处理、化学疗法以及茎尖培养等是目前常用的脱除植物病毒病的方法，但其中 最为常用、效果最好的当属以茎尖剥离的方式培育脱毒苗，此法可以使病株复壮，经过脱毒 的植物健壮、产量高、质量好，且组培苗具有无杂菌、优质、均匀、繁殖率高、可批量生产、周 年供应等优点。因此，近年来植物组织培养及其快繁脱毒技术越来越多地应用于各种种苗 生产。但是安祖花一株成花或穴盘苗只有一个茎尖，若是直接以其为外植体进行茎尖剥离， 一个植株提供一个茎尖，如若真正意义上获取一株脱毒苗则需要几十株甚至上百株安祖花 植株的茎尖作为外植体，这无形中给安祖花茎尖脱毒技术的发展带来了难题，同时高昂的 成本也使得研究者们望而却步，严重制约了安祖花脱毒苗产业化繁育的发展进程。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种热处理结合茎尖剥离 获得安祖花脱毒苗的培育方法。

[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种热处理结合茎尖剥离获得安 祖花脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：

[0008] 1)外植体的处理：

[0009] 选取带有叶柄，展开一周的安祖花幼嫩叶片，用自来水冲洗、软刷刷净材料表面， 罩纱布后流水冲洗30-40分钟，然后将冲洗过的外植体置于超净工作台中，用0.1 ^HgCl2灭 菌5分钟，再用无菌水反复冲洗3-4次，每次2-5分钟；

[0010] 2)愈伤组织的诱导及增殖：

[0011] 将处理好的叶柄用无菌滤纸吸干表面多余水分，切成0.5-lcm的小段，叶片切成大 小Icm2的小块，接种至愈伤组织诱导培养基上，黑暗条件23°C-26°C培养60-120天后即可获 得愈伤组织，并将获得的愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基中继代2-4次；

[0012] 3)不定芽的诱导与增殖：

[0013] 将获得的愈伤组织切成Icm的小块，接种至不定芽诱导培养基中，光照培养30-40 天后诱导出I cm小芽，待不定芽长至2cm时即可进行继代增殖；

[0014] 4)不定芽的变温热处理：

[0015] 待不定芽长至2.5-3cm时，将其放入白天16h温度为35°C，夜间8h温度为27°C的人 工智能培养箱中，进行变温热处理，培养时间为20-25天；

[0016] 5)茎尖剥离：

[0017] 选取经变温热处理后生长健壮的安祖花组培苗，剥取其顶端带有1-2个叶原基、直 径为0.1-0.2mm的茎尖，接种至茎尖分化培养基中进行离体培养，黑暗条件23Γ-26°C培养 50-70天后即可获得茎尖愈伤组织，将获得的愈伤组织接种到茎尖愈伤组织增殖培养基中 继代2-4次；

[0018] 6)茎尖愈伤组织不定芽的分化与增殖：

[0019] 将步骤5)获得的茎尖愈伤组织编好株系后，经过与步骤3)相同的处理后，即可获 得大量的不定芽；

[0020] 7)病毒检测：

[0021] 将获得的不同株系的茎尖愈伤组织不定芽，采用RT-PCR法进行病毒检测，每个株 系3次重复；

[0022] 8)安祖花脱毒不定芽材料的获得：

[0023] 经步骤7)病毒检测后，将获得的安祖花脱毒株系采用与步骤3)相同的处理，进行 不定芽的增殖培养；

[0024] 9)安祖花脱毒苗的获得：

[0025] 将步骤8)脱毒愈伤组织上分化出的组培苗转入壮苗生根培养基，待组培脱毒苗长 至4-5cm，即可出瓶种植于温室大棚，获得完整的安祖花脱毒植株。

[0026] 进一步的，上述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，所述 步骤2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.8-1.2) mg/1的6-苄氨基腺嘌呤+ (0.2-0.7) mg/L的2，4-滴丁酯；愈伤组织增殖培养基的组成为:MS 培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.5-1.0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。

[0027] 进一步的，上述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，所述 步骤3)中，不定芽诱导培养基的组成为:MS培养基+3%蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+(0.8-1.2) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+ (0.05-0.12) mg/L的吲哚丁酸+ (0.1-0.3) g/L的活性炭。

[0028] 进一步的，上述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，所述 步骤5)中，茎尖分化培养基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g//L的琼脂粉+ (〇. 8-1.2) mg/L 的6-苄氨基腺嘌呤+ (0.2-0.7) mg/L的2，4-滴丁酯;茎尖愈伤组织增殖培养基的组成为:MS 培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.5-1.0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。

[0029] 进一步的，上述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，所述 步骤7)中，用于芋花叶病毒检测的引物序列分别为序列表中的SEQ ID No. 1和SEQ ID No·2。其中，SEQIDNo·l为上游引物DMVF-AACGGGGCTTGGGTGATGAT;SEQIDNo·2为下游引 物DMVR-CTATGGCGCACTTACGGTCRGATG。

[0030] 进一步的，上述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，所述 步骤9)中，壮苗生根培养基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.1-0.2) mg/L 的萘乙酸+ (0.1-0.2) g/L的活性炭。

[0031] 目前已报道的安祖花病毒病有芋花叶病毒(CMV)，按照以往的茎尖脱毒方法，对于 安祖花这种分株率较低的植物来说获得大量的外植体是比较困难的，如若直接在盆栽花卉 上获取，那么一个植株只能获取一个外植体且在处理过程中还会因为消毒不彻底等因素造 成外植体的大量损失，无形中增大了脱毒苗的生产成本。

[0032] 本发明的有益效果为:本发明提供的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗 的培育方法，是针对现有技术中的缺陷，首先以培养愈伤分化植株获得无菌苗的方式，经热 处理后再以此无菌苗进行茎尖剥离，便可获得安祖花无毒苗，以此方法获得的脱毒苗与直 接采用热处理而未进行茎尖剥离的处理方法相比具有脱毒率高的特点，与直接从盆栽植株 上获取茎尖外植体进行脱毒苗培育的处理方法相比，具有一个植株便可为茎尖剥离提供上 千个外植体的优势，同时还具有污染率低，成本低，无需损伤取材母株等特点，以此方法进 行安祖花脱毒苗的培育可在短时间内获得大量脱毒效率高生长健壮的无毒苗，尤其适用于 稀缺品种安祖花脱毒苗的获得，为安祖花脱毒苗的工厂化繁育提供了技术基础。

具体实施方式

[0033] 实施例1:

[0034] —种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：

[0035] ⑴外植体的处理：

[0036] 选取带有叶柄展开一周的安祖花幼嫩叶片，用自来水冲洗、软刷刷净材料表面，加 入少量吐温20浸泡10分钟，罩纱布后流水冲洗30-40分钟，然后将冲洗过的外植体拿入超净 工作台，用0.1 %HgCl2灭菌5分钟，再用无菌水反复冲洗3-4次，每次2-5分钟。

[0037] ⑵愈伤组织的诱导及增殖：

[0038] 将处理好外植用无菌滤纸上将其表面的残留液体吸干，叶柄切成0.5-lcm的小段， 叶片切成大约Icm2的小块，接种至愈伤组织诱导培养基MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L琼脂粉+ 0 · 8-1 · 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0 · 2-0 · 7mg/L的2，4-滴丁酯，黑暗条件23°C-26 °C下培养 60-120天后即可获得愈伤组织，将获得的愈伤组织接种到增殖培养基MS培养基+3 %蔗糖+ 5 · 8g/L的琼脂粉+ (0 · 5-1 · 0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤中继代2-4次；

[0039] ⑶不定芽的诱导与增殖：

[0040] 将步骤(2)获得的愈伤组织切成Icm左右的小块接种至不定芽诱导培养基MS培养 基+0 · 8-1 · 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0 · 05-0 · 12mg/L的吲哚丁酸+0 · 1-0 · 3g/L的活性炭，光 照培养30-40天后便诱导出1厘米左右的小芽，待不定芽长至2cm左右时即可进行继代增殖； ⑷不定芽的变温热处理：

[0041 ] 待由步骤(3)获得的不定芽长至2.5-3cm时，将其放入白天16h温度为35°C，夜间8h 温度为27°C的人工智能培养箱中，进行变温处理，培养时间为20-25天；

[0042] ⑸茎尖剥离：

[0043] 选取经步骤⑷变温热处理后生长健壮的安祖花组培苗，剥取其顶端带有1-2个叶 原基(直径约为O. l-o. 2mm)的茎尖，接种至茎尖分化培养基MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L琼脂 粉+0.8-1.2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.2-0.7mg/L的2，4-滴丁酯，进行离体培养，黑暗条件 23°C_26°C培养50-70天后即可获得茎尖愈伤组织，将获得的茎尖愈伤组织接种到增殖培养 基MS培养基+3 %蔗糖+5.8g//L的琼脂粉+ (〇. 5-1.0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤中继代2-4次;⑹ 茎尖愈伤组织不定芽的分化与增殖：

[0044] 将经步骤⑸获得的茎尖愈伤组织编好株系后，经步骤⑶处理后即可获得大量的 不定芽。⑺病毒检测：

[0045] 将获得的不同株系的茎尖愈伤组织不定芽，采用RT-PCR法进行病毒检测，每个株 系3次重复，用于芋花叶病毒检测的引物为：

[0046] DMVF-AACGGGGCTTGGGTGATGAT,DMVR-CTATGGCGCACTTACGGTCRGATG 〇

[0047] ⑻安祖花脱毒不定芽材料的获得：

[0048] 经步骤(7)病毒检测后，确定不带有安祖花主要病毒病的株系方可作为基础苗进 行增殖扩繁，将获得的优良脱毒株系经步骤(3)进行不定芽的增殖培养。

[0049] ⑼安祖花脱毒苗的获得:将步骤(8)脱毒愈伤组织上分化出的组培苗达到一定数 量后，转入壮苗生根培养基MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/U京脂粉+〇. 1-0.2mg/L萘乙酸+0.1-0.2g/L活性炭，待组培脱毒苗长至4-5cm即可出瓶种植于温室大棚，获得完整的安祖花脱毒 植株。

[0050] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。

Claims (6)

1. 一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 外植体的处理： 选取带有叶柄，展开一周的安祖花幼嫩叶片，用自来水冲洗、软刷刷净材料表面，罩纱 布后流水冲洗30-40分钟，然后将冲洗过的外植体置于超净工作台中，用O. I^HgCl2灭菌5 分钟，再用无菌水反复冲洗3-4次，每次2-5分钟； 2) 愈伤组织的诱导及增殖： 将处理好的叶柄用无菌滤纸吸干表面多余水分，切成0.5-lcm的小段，叶片切成大小 Icm2的小块，接种至愈伤组织诱导培养基上，黑暗条件23°C_26°C培养60-120天后即可获得 愈伤组织，并将获得的愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基中继代2-4次； 3) 不定芽的诱导与增殖： 将获得的愈伤组织切成Icm的小块，接种至不定芽诱导培养基中，光照培养30-40天后 诱导出I cm小芽，待不定芽长至2cm时即可进行继代增殖； 4) 不定芽的变温热处理： 待不定芽长至2.5-3cm时，将其放入白天16h温度为35°C，夜间8h温度为27°C的人工智 能培养箱中，进行变温热处理，培养时间为20-25天； 5) 茎尖剥离： 选取经变温热处理后生长健壮的安祖花组培苗，剥取其顶端带有1-2个叶原基、直径为

0.1-0.2_的茎尖，接种至茎尖分化培养基中进行离体培养，黑暗条件23°C_26°C培养50-70 天后即可获得茎尖愈伤组织，将获得的愈伤组织接种到茎尖愈伤组织增殖培养基中继代2-4次； 6) 茎尖愈伤组织不定芽的分化与增殖： 将步骤5)获得的茎尖愈伤组织编好株系后，经过与步骤3)相同的处理后，即可获得大 量的不定芽； 7) 病毒检测： 将获得的不同株系的茎尖愈伤组织不定芽，采用RT-PCR法进行病毒检测，每个株系3次 重复； 8) 安祖花脱毒不定芽材料的获得： 经步骤7)病毒检测后，将获得的安祖花脱毒株系采用与步骤3)相同的处理，进行不定 芽的增殖培养； 9) 安祖花脱毒苗的获得： 将步骤8)脱毒愈伤组织上分化出的组培苗转入壮苗生根培养基，待组培脱毒苗长至4-5cm，即可出瓶种植于温室大棚，获得完整的安祖花脱毒植株。

2. 根据权利要求1所述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其 特征在于，所述步骤2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为:MS培养基+3%蔗糖+5.8g/L的琼 脂粉+ (〇 · 8-1 · 2) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+ (0 · 2-0 · 7) mg/L的2，4-滴丁酯;愈伤组织增殖培养 基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.5-1.0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。

3. 根据权利要求1所述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其 特征在于，所述步骤3)中，不定芽诱导培养基的组成为:MS培养基+3%蔗糖+5.8g/L的琼脂 粉 + (Ο · 8-1 · 2) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤 + (Ο · 05-0 · 12) mg/L的吲哚丁酸 + (Ο · 1-0 · 3) g/L的活性 炭。

4. 根据权利要求1所述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其 特征在于，所述步骤5)中，茎尖分化培养基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.8-1.2) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+ (0.2-0.7) mg/L的2，4-滴丁酯;茎尖愈伤组织增殖培养 基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0.5-1.0) mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。

5. 根据权利要求1所述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其 特征在于，所述步骤7)中，用于芋花叶病毒检测的引物序列分别为序列表中的SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2。

6. 根据权利要求1所述的一种热处理结合茎尖剥离获得安祖花脱毒苗的培育方法，其 特征在于，所述步骤9)中，壮苗生根培养基的组成为:MS培养基+3 %蔗糖+5.8g/L的琼脂粉+ (0 · 1-0 · 2) mg/L的萘乙酸+ (0 · 1-0 · 2) g/L的活性炭。