CN103444552B - 一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，主要步骤如下：（1）选取合适时期的花药低温预处理；（2）外植体表面消毒，接种；（3）高温黑暗处理；（4）光照培养，诱导愈伤组织产生；（5）愈伤组织培养增殖；（6）愈伤组织分化不定芽；（7）芽苗转接、植株扩繁与继代培养；8）无根小苗生根成为完整植株。本方法获得愈伤组织的几率高，愈伤组织分化频率高，培养效果好。将本发明应用于茄子遗传育种中，可以大大提高茄子花药培养效率，丰富茄子优良基因型个体，完善茄子单倍体育种途径，缩短育种周期，为加快茄子及其它茄科作物遗传育种和花药离体培养研究提供技术和理论依据。

Description

一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法。

背景技术

茄子（Solanum melongena Linn），属于茄科（Solanaceae）茄属（2n=2x=24），起源于亚洲东南亚热带地区，是欧洲、亚洲和北美洲的重要蔬菜品种之一。它不仅具有较高的营养价值，且食用方法多样，是一种可以干鲜结合、周年供应、经济实惠的大宗蔬菜，深受广大生产者和消费者的欢迎。中国是世界上最大的茄子生产国，因此，茄子的遗传育种工作对于实际生产意义重大。

在茄子杂交育种工作中，自交系的选育是非常重要的工作，但往往存在选育周期长、选择效率低等问题。单倍体育种可以大大提高后代选择的效率，缩小育种群体规模，缩短育种年限，加快育种进程。

花药离体培养是以花药为外植体，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，诱导其分化出愈伤组织或胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株。花药培养不需要分离出花粉，程序比较简化，因而是诱导人工单倍体的主要方法之一。

利用花药培养可快速获得纯系和突变体，创新种质资源，对茄子遗传育种及品种改良具有重要意义。70年代初，Riana等成功通过茄子花药培养经愈伤组织途径成苗。茄子不论是花药还是花粉培养，都已有一些成功的报道。目前，有关茄子花药培养的研究大多集中在如何提高愈伤组织和胚状体的诱导频率上.而对从愈伤组织诱导产生单倍体植株的研究则很少。许多愈伤组织不能正常的生长发育而只产生根，不分化芽，成苗率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有花药培养技术中愈伤组织诱导率和分化率低，培养效果差的问题，是在于提供了一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，应用本方法获得愈伤组织的几率高，愈伤组织分化频率高，培养效果好。将本发明花药培养方法及配套培养基应用于茄子遗传育种中，可以大大提高了茄子花药培养效率，丰富了茄子优良基因型个体，完善了茄子单倍体育种途径，缩短了育种周期，为加快茄子遗传育种和茄科作物花药离体培养研究提供技术和理论依据。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，其步骤是：

1）从茄子花期开始，于晴天上午9:00-10:00从健壮植株上选取发育正常，表面无损伤，经显微镜镜检小孢子处于单核中期至单核靠边期的花蕾用于花药培养，对应花蕾外部形态为花冠低于花萼裂基部1mm-2mm至花冠高于花萼裂基部1mm-2mm，花药为黄绿色；

2）将花蕾装于自封袋内置于4℃-5℃冰箱预处理24h-72h；

3）将花蕾外萼剥掉，再用75%（体积百分比）的酒精表面消毒28s-32s，之后用5%（质量百分比）的次氯酸钠溶液消毒15min-20min，然后用无菌水冲洗3-4次；

4）在无菌滤纸上用镊子剥取花药，将花药柄去除干净，接种于装有愈伤组织诱导培养基的培养皿（90mm）中，每皿接种3-5个花蕾的花药；

5）花药接种后，置于35℃-37℃高温黑暗条件下处理6d-7d；

6）于光照强度15001x-20001x、光照时间12h-16h、温度25℃-28℃下继续培养，3周左右产生愈伤组织；

7）待愈伤组织长到直径为5mm-6mm时，切下并接种到愈伤组织增殖培养基上培养增殖；

8）两周后，选取大小一致，色泽新鲜，淡黄色，质地紧密的愈伤组织转移至愈伤组织分化培养基上，诱导不定芽发生；

9）待芽苗长至1cm-3cm长时，切下无根小苗，转接到植株扩繁与继代培养基上，每30d扩繁继代一次；

10）根据育种需求和外界环境条件，在移栽大田前1个月将无根小苗转移至生根培养基上，诱导生根，再生出完整植株。

上述步骤4)、7)、8）、9）、10）中培养基的组分及配比如下：

愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基，0.5mg/L2，4-D，1.0mg/L KT，8mg/L VC，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

愈伤组织增殖培养基：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

愈伤组织分化培养基：MS基本培养基，0.01mg/L NAA，2.0mg/L ZT，20.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L；灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

植株扩繁和继代培养基：MS基本培养基，0.01mg/L NAA，2.0mg/L6-BA，20.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，加水至1L，pH5.8-6.0

生根培养基：1/2MS（MS基本培养基大量元素减半），0.2mg/L IBA，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，加水至1L；灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0。

所述的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、愈伤组织分化培养基、植株扩繁和继代培养基、生根培养基均在121℃，0.1-0.15Mpa下高温高压灭菌15-20min。

为了便于对本发明的理解，申请人对上述各个步骤中所用的培养基，培养基中所用到的植物激素做如下定义：

培养基包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、愈伤组织分化培养基、植株扩繁和继代培养基和生根培养基。本发明所使用基本培养基为MS基本培养基（参见MurashigeT.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497）。

本发明中，所述植物激素定义及简称如下：萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2、4-D）、吲哚丁酸（IBA），植物激素中的细胞分裂素包括激动素（KT）和玉米素（ZT）。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：

（1）本发明是建立在对茄子花药培养影响因素包括取蕾时期、温度处理和培养基配方等系统研究工作基础上的，从试验材料选择、培养到植株移栽大田以及田间表现的观察，比较全面系统地说明了茄子花药培养获得单倍体植株的过程，方法简便、易于操作。

（2）与已有技术相比，本发明具有外植体不易褐化、愈伤组织诱导率和分化率高、培养效率高等优点，愈伤组织诱导率最高可达89.71%，愈伤组织分化不定芽率可达70.00%以上，不定芽成苗率达75%以上。

（3）与已有技术相比，本发明设计愈伤组织增殖和植株扩繁步骤，愈伤组织增殖和植株扩繁效果好，提高了茄子花药培养获得单倍体植株的频率。

附图说明

图1为本发明的一个实施例花药培养选取花蕾的大小示意图。

图2为本发明的一个实施例刚接种的花药示意图。

图3为本发明的一个实施例膨大的花药示意图。

图4为本发明的一个实施例从花药诱导产生的胚状体直接再生植株示意图。

图5为本发明的一个实施例从茄子花药诱导产生的愈伤组织示意图。

图6为本发明的一个实施例愈伤组织分化产生不定芽示意图。

图7为本发明的一个实施例一种不定芽再生出试管苗示意图。

图8为本发明的一个实施例试管苗生根示意图。

图9为本发明的一个实施例田间移栽成活的花培单倍体植株示意图。

图10为本发明的一个实施例供体二倍体植株和花培单倍体植株DNA流式分析图。

a供体二倍体植株DNA流式分析图

b花培单倍体植株DNA流式分析图

具体实施方式

实施例1：

一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，其步骤是：（试验材料选择、培养基设计与接种培养）

1、试验材料来源及其处理：

本发明的试验材料选自茄子的花蕾，采自湖北省武汉市蔬菜科学研究所育种基地大棚，品种代号E83002，为日本杂交一代茄子品种。从茄子花期开始，于晴天上午9:00-10:00从健壮植株上取花蕾，选取发育正常，表面无损伤，经显微镜镜检小孢子处于单核靠边期的花蕾用于花药培养，对应花蕾外部形态为花冠低于花萼裂基部1mm-2mm至花冠高于花萼裂基部1mm-2mm（见图1），花药为黄绿色；将花蕾装于自封袋内置于5℃冰箱预处理24h。

2、培养基制备及设计：

表1列出了本发明的最佳培养基组成成分及其用量。

表1本发明设计的茄子花药培养的最佳培养基

说明：MS基本培养基配制参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版。

1/2MS为MS基本培养基大量元素减半，其他成分及含量与MS基本培养基一样。

3、培养条件：

培养室的温度设置为25℃，光照强度2000lx，每天光照16h。

4、接种与培养：

用75%（体积百分比）的酒精表面消毒30s，之后用5%（质量百分比）的次氯酸钠溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3-4次。在无菌滤纸上用镊子先将花蕾外萼剥掉，剥取花药，将花药柄去除干净，接种于愈伤组织诱导培养基上。接种于愈伤组织诱导培养基（见表1）上，每一培养皿中接种4个花蕾的花药（见图2），36℃培养箱内暗培养6d后，可见花药膨大（见图3），3周后花药两端或花药中部开始产生愈伤组织（见图5），也有少量外植体可直接通过胚状体途径再生出完整植株（见图4）。当愈伤组织长至直径为5mm时，将其从花药上切下，转移至愈伤组织增殖培养基（见表1）上培养增殖。

在光照条件下经过1个月培养后，选取大小一致，色泽新鲜，淡黄色，质地紧密的愈伤组织转移至愈伤组织分化和成苗培养基（见表1）上，每一培养皿约培养10块愈伤组织，2周后大部分愈伤组织表面出现绿色芽点（见图6），一个月后统计愈伤分化率。待芽苗长至3cm长时，切下无根小苗，转接到植株扩繁与继代培养基（见表1）上，每30d扩繁继代一次。

根据育种需求和外界环境条件（一般为翌年3-4月份），在移栽大田前1个月将试管苗（图7）转移至生根培养基（见表1）上，诱导生根，约10-15d后小苗切口处有不定根出现（见图8）。

一个月后，将根系发育良好的再生植株移到有散射光的自然条件下，炼苗一周，取出生根小植株，洗净根部琼脂，然后移栽到装有腐殖土：珍珠岩（体积比3：1）的小花盆中，弱光下放一周左右，使其长出新根，再在强光下生长，注意保湿，使其健康生长。一周后移栽到大田，田间常规管理。移栽植株的田间表现为株型较正常二倍体植株矮小，叶片变薄变窄，结节变短，分枝增多，花蕾变小（见图9），表现出单倍体茄子的特性。取植株幼嫩叶片经DNA流式细胞仪检测，进一步确定该花培植株为单倍体植株（见图10）。

实施例2：

低温预处理对茄子花药愈伤组织诱导率的影响

茄子花期很长（5月上旬一10月上旬），采集的花药经过不同时间的低温（4℃-5℃）处理后，接种在MS＋0.5mg/L2，4-D＋1.0mg/L KT＋8mg/L VC＋30.0g/L蔗糖＋7.5g/L琼脂最适培养基上，光照条件下培养45天后调查的结果表明（见表2），经过不同时间低温处理的花药，其愈伤组织诱导率1和诱导率2显著增高，但不同时间处理之间显著性有差异，这与其它植物效果相似，只是低温的温度和时间不同。本研究表明，相对处理24h诱导率1和诱导率2均达到最高。因此，低温处理24h为最佳处理时间。

表2低温预处理时间对愈伤组织诱导率的影响

说明：出愈数1为凡是产生愈伤的花药总数，诱导率1=出愈数1/接种花药数；出愈数2为花药中部产生愈伤的花药数，诱导率2=出愈数2/接种花药数

实施例3：

植物激素对愈伤组织分化不定芽的影响：

在植物组织培养中，NAA是一种应用得比较广泛的生长素类生长调节剂，细胞分裂素6-BA和KT最显著的生理作用就是能促进细胞分裂。生长素与细胞分裂素混合使用对愈伤组织的分化能起调控作用。

本研究设置了6-BA、KT与NAA的不同浓度组合共6个。从表3可以看出，细胞分裂素KT与NAA组合的效果明显优于6-BA，与邹健等研究结果类似。且以2.0mg/L的KT与0.01mg/L的NAA组合效果最佳。

表3激素对愈伤组织分化的影响

Claims (1)

1.一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，其步骤是：

1)从茄子花蕾发育期开始，于晴天上午9:00-10:00从植株上选取发育正常，表面无损伤，经显微镜镜检小孢子处于单核中期至单核靠边期的花蕾用于花药培养，对应花蕾外部形态为花冠低于花萼裂基部1-2mm至花冠高于花萼裂基部1-2mm，花药为黄绿色；

2)将花蕾装于自封袋内置于4-5℃冰箱预处理24-72h；

3)将花蕾外萼剥掉，用75％体积百分比的酒精表面消毒28-32s，之后用5％质量百分比的次氯酸钠溶液消毒15-20min，然后用无菌水冲洗3-4次；

4)在无菌滤纸上用镊子剥取花药，将花药柄去除干净，接种于装有愈伤组织诱导培养基的培养皿中，每皿接种3-5个花蕾的花药；

5)花药接种后，置于35-37℃高温黑暗条件下处理6-7d；

6)在光照强度1500-20001x、光照时间12-16h、温度25-28℃下继续培养，3周产生愈伤组织；

7)待愈伤组织长到直径为5-6mm时，切下并接种到愈伤组织增殖培养基上培养增殖；

8)两周后，选取大小一致，色泽新鲜，淡黄色，质地紧密的愈伤组织转移至愈伤组织分化培养基上，诱导不定芽发生；

9)待不定芽长至1-3cm长时，切下无根小苗，转接到植株扩繁与继代培养基上，每30d扩繁继代一次；

10)根据育种需求和外界环境条件，在移栽大田前1个月将无根小苗转移至生根培养基上，诱导生根，再生出完整植株；

所述的愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基，0.5mg/L 2，4-D，1.0mg/L KT，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

所述的愈伤组织增殖培养基为：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

所述的愈伤组织分化培养基为：MS基本培养基，0.01mg/L NAA，2.0mg/L ZT，20.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

所述的植株扩繁和继代培养基为：MS基本培养基，0.01mg/L NAA，2.0mg/L 6-BA，20.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

所述的生根培养基为：1/2MS，0.2mg/L IBA，30.0g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0。