CN105815213A - 一种猕猴桃离体再生体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种猕猴桃离体再生体系建立的方法，其包括：外植体的选取和灭菌步骤，不定芽诱导步骤，不定芽增殖步骤，生根诱导步骤，以及炼苗和移栽步骤。根据本发明提供的猕猴桃离体再生体系建立的方法，腋芽诱导率达100％，叶片愈伤诱导率为92％，出芽率为40％，不定芽增殖系数为4.5，生根率可达96％，不仅使得猕猴桃快速、大量、优质繁殖，而且其叶片愈伤诱导步骤可为猕猴桃遗传转化研究提供基础。

Description

一种猕猴桃离体再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物植物组织培养技术领域，尤其涉及一种猕猴桃离体再生体系建立的方法。

背景技术

软枣猕猴桃(Actinidiaaguta),又名软枣子，猕猴梨，藤瓜，隶属猕猴桃科(Actirlidiaceae)猕猴桃属(ActinidiaLindl.)，是多年生木质藤本植物，分布于我国东北、华北、西北以及长江流域各省份。软枣猕猴桃富含各种营养成分，同时具有医疗保健功效，软枣猕猴桃含有丰富的维生素C，高达430.8mg/100g，含有近20种氨基酸，各种氨基酸总和12155.89mg/100g,以及20多种无机元素；软枣猕猴桃还含有丰富的超氧化物歧化酶(SOD),有提高免疫功能、抗癌、抗衰老、软化血管等功能；同时，与中华猕猴桃和美味猕猴桃相比，它具有不需后熟可直接带皮食用的优点。上述软枣猕猴桃的优良特征引起猕猴桃研究者和生产者的重视，从上个世纪90年代开始人工驯化栽培。目前生产上的软枣猕猴桃栽培品种主要以绿色为主，红色较为少见，近几年，软枣猕猴桃在生态农业中迅速推广，特别是在观光果园和采摘园中很受欢迎，软枣猕猴桃苗木市场前景良好，然而，传统的嫁接繁殖不能满足市场需求，虽然软枣猕猴桃可以通过扦插成活，但受到扦插繁殖季节限制以及其管理方面要求较高，影响到软枣猕猴桃的快速、大量、优质繁殖。

发明内容

(一)技术问题

本发明实施的目的是提供一种适合华北以及长江流域的软枣猕猴桃离体再生体系建立的方法，旨在解决传统的嫁接繁殖和扦插繁殖不能快速、大量、优质繁殖以及由于猕猴桃不同、品种间存在基因型差异而需要筛选适宜的培养基的问题。

(二)技术方案

本发明目的通过以下技术方案得以实施：

一种软枣猕猴桃离体再生体系建立的方法包括以下步骤：

(一)培养基的配制，包括基本培养基及各阶段培养基的组分：

(1)基本培养基：MS或1/2MS,其中蔗糖30g/L，琼脂4-6g/L,PH5.8；

(2)腋芽诱导培养基：MS+6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)0.5-1.0mg·L^-1+IBA(Indole-3-butytricacid,吲哚乙酸)0.5-1.0mg·L^-1或MS+6-BA1.0-2.0mg·L^-1+NAA(1-naphthyla-ceticacid,萘乙酸)0.1mg·L^-1；

(3)叶片、叶柄诱导培养基：MS+ZT(Zeatin,玉米素)0.2-0.5mg·L^-1；

(4)增殖培养基：MS+ZT0.5-1.0mg·L^-1或MS+6-BA1.0-2.0mg·L^-1+IBA1.0-2.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1；

(5)生根培养基：1/2MS+NAA0.2-0.5mg·L^-1或MS+IBA0.7-1.0mg·L^-1；

(二)外植体选取和灭菌：春季刚发芽新稍茎段、叶片和叶柄作为外植体材料，新发枝条上端10cm，截成3cm左右带芽茎段，芽上下各1.5cm，用洗洁精洗净，在流水下冲洗1-2h；在超净工作台上，将茎段在75％酒精中消毒30s，消毒后用无菌水冲洗两次，置于0.1％升汞中消毒45s，无菌水冲洗4-5次，放在滤纸上备用；

(三)不定芽诱导：

(1)腋芽的不定芽诱导：将灭菌后的带腋芽茎段剪成1cm左右接种于腋芽诱导培养；在温度25℃±3℃，光强2000LuX+500LuX,光照时间14h/d的无菌环境下培养30d，抽出2cm左右的初代芽；

(2)叶片、叶柄的不定芽诱导：将灭菌后的叶片、叶柄放在滤纸上，叶片横截叶脉剪成宽0.2cm宽的细长条，叶柄剪成0.5cm长，接种于叶片、叶柄诱导培养基，培养温度25℃±3℃，开始10d黑暗培养后，移至光下，同上培养条件，继续培养30d左右，长出愈伤，并分化出丛生芽；

(四)不定芽增殖培养：在初代芽和丛生芽接种于增殖培养基上，同上培养条件，经20d-35d培养分化出2-4.5倍，长1cm-4cm的继代幼芽或丛生芽；

(五)生根诱导：将继代幼芽或丛生芽接种于生根培养基上，经过15d左右茎部长出愈伤并发根或者茎部直接出根；经30d长出4-6条根，每条根开始发出须根；

(六)炼苗和移栽：将生根后的组培瓶移入日光温室炼苗，遮阴3d不开瓶口，拧松瓶口放置1d，将瓶口敞开2d，之后进行移栽，控制气温不超过30℃，空气相对湿度在90％以上。移栽所用基质为珍珠岩：泥炭：细沙的比例为1:1:1，基质用多菌灵消毒。

(三)有益效果

本发明提供的猕猴桃离体再生体系建立的方法可以使得猕猴桃快速、大量、优质繁殖，满足了市场需求。

附图说明

图1为使用根据本发明的培养基的茎段腋芽出苗效果实物图。

图2为使用根据本发明的培养基的叶片愈伤出芽效果实物图。

图3为使用根据本发明的培养基的叶柄愈伤出芽效果实物图。

图4为使用根据本发明的培养基的不定芽增殖效果实物图。

图5为使用根据本发明的培养基的单棵苗生根效果实物图。

图6为根据本发明的生根苗移栽效果实物图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面根据具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

本发明采用软枣猕猴桃春季刚发芽的新稍茎段、叶片和叶柄作为外植体材料，优选采用全红型软枣猕猴桃‘天源红’春季刚发芽的新稍茎段、叶片和叶柄作为外植体材料。以下将以全红型软枣猕猴桃‘天源红’为例，对本发明作进一步说明，需要说明的是根据本发明的猕猴桃离体再生体系建立的方法并不局限于实施例中提及的全红型软枣猕猴桃‘天源红’，其还适用于其它猕猴桃品种，尤其是华北和长江流域的不抗寒的软枣猕猴桃品种。

本发明实施例的猕猴桃离体再生体系建立的方法可包括：外植体的选取与灭菌步骤，带芽茎段出苗诱导步骤或者叶片、叶柄不定芽诱导步骤，不定芽增殖步骤，生根诱导步骤，炼苗与移植步骤。各个步骤的具体描述如下：

1.外植体的选取与灭菌

截取‘天源红’新发枝条上端10cm，截成3cm左右带芽茎段，芽上下各1.5cm，用洗洁精洗净，在流水下冲洗1-2h；将茎段在75％酒精中消毒45s(优选在超净台上进行)，消毒后还可用无菌水冲洗两次，置于0.1％升汞中消毒45s，再用无菌水冲洗4-5次(冲洗后最好放在滤纸上将水滤干)，将材料剪成1cm左右带芽茎段(芽下部茎稍长些)供接种使用。

2.带芽茎段出苗诱导

消毒后的茎段外植体接种于添加植物生长调节剂0.5-1.0mg·L^-1的6-BA以及0.5-1.0mg·L^-1的IBA的MS培养基中或者接种于含有1.0-2.0mg·L^-1的6-BA以及0.1mg·L^-1的NAA的MS培养基中，表1给出了不同植物生长调节剂对外植体腋芽萌发的影响。根据本发明的培养基的茎段腋芽出苗效果实物图如图1所示。

表1包括五组研究不同培养基配方所得到的生芽率的实验数据，排除污染情况，单从出芽率看，‘天源红’茎段在不同浓度的植物生长调节剂中都有较高的萌芽率，实验所提供的外植体数相同，最终的萌芽数以及萌芽率却不同，特别是在6-BA0.5mg·L^-1+IBA1.0mg·L^-1的MS培养基中，萌芽率达到100％。后两组实验，添加了NAA，由于在培养过程中颈部出现了愈伤，虽然观察到腋芽发芽，但是苗生长不好。

因此，添加6-BA0.5mg·L^-1+IBA1.0mg·L^-1的MS培养基可作为腋芽出苗速度快的最优培养基。

表1不同植物生长调节剂对外植体腋芽萌发的影响

Table1Effectsofdifferentgrowthregulatorsonaxillarybudgermination

3.叶片、叶柄不定芽诱导

采用新稍叶片，经洗洁精洗净后，流水冲洗1-2h；经酒精和升汞消毒后(优选在超净台上进行)，还可用无菌水冲洗4-5次(冲洗后最好放在滤纸上将水滤干)，然后将叶片沿横截叶脉剪成宽0.2cm宽的细长条，或者将叶柄剪成0.5cm长，接种于包含0.2-0.5mg·L^-1的ZT的MS培养基中，表2给出了‘天源红’叶片愈伤组织和不定芽分化情况。根据本发明的培养基的叶片和叶柄愈伤出芽效果实物图如图2、3所示。

表2包含七组研究不同培养基配方所得到的出芽率的实验数据，由于叶片在诱导培养基中容易快速膨大生长，并且在靠近叶脉的位置容易形成愈伤组织，但愈伤组织较为质密，而叶缘部位不容易有愈伤产生，尽管在每个激素组合中都有愈伤组织的产生，但出芽率较低。实验所提供的外植体数相同，最终的愈伤形成率以及出芽率却不同，仅在ZT0.5mg·L^-1时的出芽率为40％，在6-BA和NAA的组合中，愈伤诱导率尚可，但出芽率也较低。虽然在一定范围内提高ZT的浓度，可以提高出芽率，但当ZT的浓度达到0.5mg·L-1时，进一步地提高ZT的浓度反而会导致出芽率降低；此外，仅使用6-BA的MS培养基时，出芽率较低。

因此，添加0.5mg·L^-1ZT的MS培养基可作为叶片出芽率较高的最优培养基。

表2‘天源红’叶片愈伤组织和不定芽分化

Table2Buddifferentiationandcallusinducingofleafin‘tianyuanhong’

表3给出了不同激素对‘天源红’叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响。

表3包括七组研究不同培养基配方所得到的出芽率的实验数据，相对于叶片，叶柄更容易出芽，每个愈伤的增殖系数可到3以上，在增加ZT的培养基中，随着ZT浓度增高，出芽率先增后减，ZT为0.5mg·L^-1时，出芽率最高，ZT浓度升高后形成的愈伤组织硬而质密，不适宜出芽增殖，添加6-BA和NAA组合后，也会诱导形成愈伤组织，但愈伤组织的数量没有单增加ZT效果好。实验所提供的外植体数相同，最终的愈伤形成率以及出芽率却不同。其中，在ZT0.5mg·L^-1的MS培养基中，出芽率最高同时具有100％的愈伤形成率。从表3可见，虽然在一定范围内提高ZT的浓度，可以提高出芽率，但当ZT的浓度达到0.5mg·L^-1时，进一步地提高ZT的浓度反而会导致出芽率降低；此外，仅使用6-BA的MS培养基时，出芽率较低。

因此，添加0.5mg·L^-1ZT的MS培养基可作为叶柄出芽率较高的最优培养基。

表3不同激素对‘天源红’叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响

Table3Buddifferentiationandcallusinducingofleafstemin‘tianyuanhong’

在叶片和叶柄通过愈伤组织出芽的方式中，叶柄的出芽率较高，叶片基本没有出芽，虽然通过愈伤获得苗的方法不如叶芽出苗快捷，但通过愈伤组织建立的再生体系可以为今后的遗传转化研究以及染色体倍性操作相关研究提供基础。

4.不定芽增殖

经腋芽萌发诱导或者经叶片、叶柄不定芽诱导产生的不定芽，需进行增殖培养。将萌发后的幼嫩无菌苗1-2cm接种于添加不同植物生长调节剂0.5-1.0mg·L^-1的ZT的MS培养基中或者在含有1.0-2.0mg·L^-1的6-BA以及0.5mg·L^-1的IBA的MS培养基中。表4给出了不同植物生长调节剂对外植体腋芽萌发的影响。图4为使用根据本发明的培养基的不定芽增殖效果实物图。

表4包含了六组研究不同培养基配方所得到的增值系数的实验数据，单株小苗在不同增殖培养基中培养，发现在添加ZT的培养基中，培养后10天左右开始有芽产生，在30天后可长成>2cm的高度，在ZT为1.0mg·L^-1时增殖率最大，并且提高ZT浓度也没有增大增殖率，我们也发现在添加高浓度6-BA时，小苗同样有增殖的效果，但是6-BA的浓度过高时，茎段基部愈伤组织会加速膨大，并且愈伤质密不利于出苗。实验提供的接种数相同，最终的增值系数却不同。

因此，在ZT1.0mg·L^-1和ZT2.0mg·L^-1的MS培养基中，增殖系数相同且最高，从节约成本的角度考虑，优选ZT1.0mg·L^-1的MS培养基。

表4不同植物生长调节剂组合对‘天源红’不定芽增殖的影响

Table4Effectsofdifferentgrowthregulationonadventitiouspropagationin‘tianyuanhong’

5.生根的诱导

以1/2MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂0.2-0.5mg·L^-1的NAA的1/2MS培养基中或者在含有0.7-1.0mg·L^-1的IBA的1/2MS培养基。表5给出了不同植物生长调节剂对生根的影响。图5为使用根据本发明的培养基的单棵苗生根效果实物图。

表5包含四组研究不同培养基配方所得到的生根率的实验数据，将长2.0cm左右的单棵苗接种在1/2MS培养基中，添加不同浓度的IBA和NAA，发现有两种生根方式，一种是茎部先形成疏松的愈伤组织，愈伤组织发出根；另一种是茎部直接发出根，这种生根方式更有助于提高移栽成活率。实验提供的总株数相同，最终的生根数和相对应的生根率却不同。其中，在1/2MS+NAA0.2mg·L^-1的培养基中，生根率最好。

因此，1/2MS+NAA0.2mg·L^-1的培养基可作为生根率较高的最优培养基。

表5不同植物生长调节剂对生根的影响

Table5Effectsofdifferentgrowthregulationonrooting

6.炼苗与移栽

将生根后的组培装置移入日光温室炼苗，遮阴3天不开瓶口，拧松瓶口放置1天，将瓶口敞开2天，之后进行移栽，控制气温不超过30℃，空气相对湿度在90％以上。移栽所用基质为珍珠岩：泥炭：细沙＝1:1:1，基质用多菌灵消毒。

生根苗移栽在配好的基质中，经过30天，成活率可达到90％以上，根系生长旺盛，可以进行大田栽种。

图6为根据本发明的生根苗移栽效果实物图。

本发明提供的一种软枣猕猴桃离体再生体系的建立方法，旨在解决传统的嫁接繁殖和扦插繁殖不能快速、大量、优质繁殖以及由于猕猴桃不同、品种间存在基因型差异而需要筛选适宜的营养基的问题。

本发明提供的最佳腋芽增殖培养基为MS+6-BA0.5mg·L^-1+IBA1.0mg·L^-1；叶柄愈伤诱导培养基为MS+ZT0.5mg·L^-1；增殖培养基为MS+ZT1.0mg·L^-1；生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg·L^-1。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种猕猴桃离体再生体系建立的方法，其包括：外植体的选取和灭菌步骤，不定芽诱导步骤，不定芽增殖步骤，生根诱导步骤，以及炼苗和移栽步骤。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外植体为刚发芽新稍茎段，所述不定芽诱导步骤具体为：将所述刚发芽新稍茎段消毒、清洗后接种于含有0.5-1.0mg·L^-1的6-BA以及0.5-1.0mg·L^-1的IBA的MS培养基中或者接种于含有1.0-2.0mg·L^-1的6-BA以及0.1mg·L^-1的NAA的MS培养基中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体为新稍叶片或者新稍叶柄，所述不定芽诱导步骤具体为：将所述新稍叶片或者新稍叶柄消毒、清洗后剪切并接种于含有0.2-0.5mg·L^-1的ZT的MS培养基中。

4.根据权利要求2或者3所述的方法，其特征在于，所述不定芽增殖步骤具体为：将所述外植体的不定芽诱导步骤中的不定芽在含有0.5-1.0mg·L^-1的ZT的MS培养基中或者在含有1.0-2.0mg·L^-1的6-BA、1.0-2.0mg·L^-1的IBA以及0.1mg·L^-1的NAA的MS培养基中培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生根诱导步骤具体为：将所述不定芽增殖步骤中的苗在含有0.2-0.5mg·L^-1的NAA的1/2MS培养基中或者在含有0.7-1.0mg·L^-1的IBA的1/2MS培养基中培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述炼苗和移栽步骤中移栽所用基质为珍珠岩：泥炭：细沙的比例为1:1:1，基质用多菌灵消毒。