CN108077068A - 一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)无菌播种：取处理后的猕猴桃种子，接种到初代培养基中，培养3—4周，直至种子萌发并生长形成实生苗；(2)增殖培养：切取步骤(1)所述实生苗的不带芽点的茎段或叶片，接种于不定芽诱导培养基中，培养4—6周，直至不定芽生成至一定长度；或者切取步骤(1)所述实生苗的带腋芽或顶芽的茎段，接种于丛生芽诱导培养基中，培养3—5周，直至丛生芽生成至一定长度；(3)壮苗生根培养：将步骤(2)所述不定芽或丛生芽接种至壮苗生根培养基中，培养3—4周，即得猕猴桃无菌种苗。其幼苗培养时间短，生根率高达95％以上，成活率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理。
Description
技术领域
本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法。
背景技术
猕猴桃，也称奇异果，果形一般为椭圆状，早期外观呈绿褐色，成熟后呈红褐色，表皮覆盖浓密绒毛，其内是呈亮绿色的果肉和一排黑色或者红色的种子。因猕猴喜食，故名猕猴桃；亦有说法是因为果皮覆毛，貌似猕猴而得名，是一种品质鲜嫩，营养丰富，风味鲜美的水果。猕猴桃含有猕猴桃碱、蛋白水解酶、单宁果胶和糖类等有机物，以及钙、钾、硒、锌、锗等微量元素和人体所需17种氨基酸外，还含有丰富的维生素C、葡萄酸、果糖、柠檬酸、苹果酸、脂肪，具有很高的推广栽培价值。
现有的猕猴桃砧木栽培一般采用由种子萌发培养的猕猴桃实生苗，猕猴桃种子具有休眠特性，萌发慢，对发芽环境条件要求高，因此生产上使用层积法、变温处理、激素处理等方法来促进其萌发。虽然这些方法能提高其发芽率，缩短了萌芽时间，但仍不能满足快速培育健壮猕猴桃实生苗的大量需求。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其幼苗培养时间短，增殖速率快，生根率高达95％以上，成活率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理；本方法可实现猕猴桃无菌种苗的快速繁殖。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，所述快速繁殖方法包括以下步骤：
(1)无菌播种：取处理后的猕猴桃种子，接种到初代培养基中，培养3—4周，直至种子萌发并生长形成实生苗；
(2)增殖培养：切取步骤(1)所述实生苗的不带芽点的茎段或叶片，接种于不定芽诱导培养基中，培养4—6周，直至不定芽生成至一定长度；
或者切取步骤(1)所述实生苗的带腋芽或顶芽的茎段，接种于丛生芽诱导培养基中，培养3—5周，直至丛生芽生成至一定长度；
(3)壮苗生根培养：将步骤(2)所述不定芽或丛生芽接种至壮苗生根培养基中，培养3—4周，即得猕猴桃无菌种苗。
优选的，步骤(1)所述初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.1—1.0mg/LGA3、1.0mg/LPVP、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
更为优选的，步骤(1)所述初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/LGA3、1.0mg/LPVP、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
优选的，步骤(1)所述猕猴桃种子的处理方法为：在无菌操作台上，将猕猴桃种子先用75％酒精处理20—40s，用无菌水清洗3—4次，再用0.1％的升汞处理10—13min，用无菌水清洗5—7次，晾干即可。
更为优选的，所述猕猴桃种子取自日本红心猕猴桃果实，在取猕猴桃种子之前，先将日本红心猕猴桃果实在1—5℃下冷藏3—7天。通过低温冷藏使种子破除休眠，便于种子的萌发。
优选的，步骤(2)所述不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01—0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
更为优选的，步骤(2)所述不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
优选的，步骤(2)所述丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.1—2.0mg/L 6-BA、0.1—0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
更为优选的，步骤(2)所述丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
优选的，步骤(3)所述壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1—1.0mg/L NAA、0.1—1.0mg/L IBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
更为优选的，步骤(3)所述壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/L NAA、0.2mg/L IBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
优选的，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中，培养温度为23—27℃，光照强度为1800—2200Lx，光周期14/10h。
更为优选的，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中，培养温度为23—27℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h。
本申请技术方案中所述的MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
所述的1/2MS基本培养基为MS基本培养基中大量元素减半，其余不变的一种培养基，有利于根的形成与生长，多数植物组织培养快速繁殖用它作为生根的基本培养基。
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)的简称，因其能与多酚类化合物络合而在植物组培中被用于防止外植体褐化。
所述的GA3为赤霉素，是一种植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟，提高产量和打破种子、块茎、鳞茎等器官的休眠，促进发芽、分蘖、抽苔，提高果实结果率，也可用于植物组织培养。
所述的TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以通过对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。
所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类似物，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，常用于植物组织和细胞培养。
所述的NAA为萘乙酸，是一种生长素类似物，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率，可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
所述的IBA为吲哚丁酸，是生长素类似物，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
本申请技术方案中，利用GA3(赤霉素)打破种子休眠，加快猕猴桃种子萌发；利用TDZ强的细胞分裂素活性，诱导促进猕猴桃叶片和节间(不带芽点)直接再生不定芽；同时利用适当配比的6-BA和NAA，可促进细胞分裂、分化，诱导芽萌发并增殖形成丛生芽；最后再利用IBA和NAA促进细胞分化、分裂及根原基形成的交互作用，快速诱导猕猴桃幼芽生根。
本申请技术方案利用初代培养基诱导猕猴桃种子的萌发并生成猕猴桃实生苗；在此基础上，用实生苗的不带芽点的茎段或叶片，或者是实生苗的腋芽或顶芽，作为增殖培养的材料，诱导不定芽或丛生芽生成；用增殖后的幼芽作为生根材料，通过壮苗生根培养，进行猕猴桃无菌实生苗的快速繁殖。通过对初代培养基、不定芽诱导培养基、丛生芽诱导培养基、壮苗生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，采用前述附加植物生长激素的培养基，得到的幼苗培养时间短，生根率高达95％以上，成活率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理；同时本技术方案充分利用材料，通过不同途径完成增殖培养，加快增殖速率，缩短增殖周期，实现猕猴桃无菌种苗的快速繁殖。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)无菌播种：取日本红心猕猴桃果实，将其在1—5℃下冷藏3—7天后取出，去除果肉，种子冲洗干净，在无菌操作台上，将猕猴桃种子先用75％酒精处理30s，用无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞处理12min，用无菌水清洗5—7次，晾干，取处理后的猕猴桃种子，接种到初代培养基中，培养至种子萌发并生长形成实生苗，其中初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L PVP、0.5mg/L GA3、25g/L蔗糖、6g/L琼脂；
(2)增殖培养：切取步骤(1)所述实生苗的不带芽点的茎段或叶片，接种于不定芽诱导培养基中，培养至不定芽生成至一定长度，其中不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
同时切取步骤(1)所述实生苗的带腋芽或顶芽的茎段，接种于丛生芽诱导培养基中，培养至丛生芽生成至一定长度，其中丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
(3)壮苗生根培养：将步骤(2)所述不定芽或丛生芽接种至壮苗生根培养基中培养，即得猕猴桃无菌种苗，其中壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/LNAA、0.2mg/L IBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂；
其中，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)的培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h。
在本实施例中，步骤(1)无菌播种10天左右，猕猴桃种子开始萌发，胚根分化伸展出根，2周左右芽萌发，快速生长，播种3周后，芽苗生长正常；步骤(2)接种2周后，茎段切口和叶片截断处逐渐有愈伤形成，3周左右时，在愈伤边缘逐渐分化出不定芽，不定芽分化率超过75％，不定芽生长迅速，在其分化形成后1周左右长至3cm；同时带芽茎段在接种10天左右，开始抽芽，2周后芽周围逐渐有丛生芽分化出来，并迅速生长，3—4周后，芽高可达3cm，丛生芽诱导率可达78％；步骤(3)接种2周时，基部有根诱导分化出现，3周时，根长为3—5cm，生根率高达95％。
实施例2
本实施例所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)中，初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L PVP、0.2mg/LGA3、25g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(2)中，不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01mg/L TDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(3)中，壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/L IBA、0.1mg/L NAA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
在本实施例中，步骤(1)无菌播种10天，猕猴桃种子开始萌发，胚根分化伸展出根，2周左右芽萌发，快速生长，播种4周后，芽苗生长正常；步骤(2)接种15天后，茎段切口和叶片截断处逐渐有愈伤形成，25天左右时，在愈伤处上有不定芽逐渐分化出现，不定芽生长迅速，再过10天左右长至2—4cm，不定芽分化率为63.3％；同时带芽茎段在接种12天左右，开始抽芽，2周后芽周围逐渐有丛生芽分化出来，并迅速生长，3—4周后，芽高达3cm；步骤(3)接种18天后，基部有根诱导分化出现，再过10天，根长为3—4cm，生根率为78.3％。
实施例3
本实施例所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)中，初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L PVP、1.0mg/LGA3、25g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(2)中，不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/LTDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂；
步骤(3)中，壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充1.0mg/L NAA、1.0mg/L IBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
在本实施例中，步骤(1)无菌播种10天，猕猴桃种子开始萌发，胚根分化伸展出根，2周左右芽萌发，快速生长，播种4周后，芽苗生长正常；步骤(2)接种2周后，茎段切口和叶片截断处逐渐有愈伤形成，4周左右时，在愈伤边缘逐渐有不定芽分化出现，不定芽生长较快，2周左右长至2—3cm；带芽茎段在接种15天左右，逐渐开始抽芽，20天之后部分芽基部膨大，周围逐渐有丛生芽诱导分化出来，30天之后，丛生芽生长至2.5cm；步骤(3)接种18天时，基部有根诱导分化出现，再过10天，根生长至3—4cm，生根率为86.7％。
实施例4
初代培养基中植物生长调节剂成分和浓度对无菌播种结果的影响
取处理后的猕猴桃种子若干，接种到经过灭菌处理的初代培养基中，培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h，培养至种子萌发并生长形成实生苗，其中初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充GA3、蔗糖、琼脂，在MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据GA3的浓度进行分组，观察并记录培养基中种子的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1初代培养基中GA3的浓度对无菌播种结果的影响
| 分组 | GA3(mg/L) | 种子数(颗) | 开始萌发时间(天) | 萌发率 |
| 1 | -- | 20 | 15 | 55％ |
| 2 | 0.2 | 20 | 10 | 82％ |
| 3 | 0.5 | 20 | 10 | 95％ |
| 4 | 1.0 | 20 | 10 | 85％ |
从上表可以看出，使用GA3比不用时的萌芽率要高，且萌发周期要更短；GA3为0.5mg/L时，萌芽率最高，萌芽时间最短，为初代培养基最适合的植物生长调节剂组成条件。
实施例5
不定芽诱导培养基中TDZ对不定芽生成和生长的影响
取生长情况一致的无菌实生苗若干，取其不带芽点的茎段或叶片，接种于不定芽诱导培养基中，培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h，培养至不定芽生成至3cm长，其中不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充TDZ、蔗糖、琼脂，在MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据TDZ的浓度进行分组，观察并记录培养基中不定芽的诱导培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2不同TDZ浓度对猕猴桃不定芽生成和生长的影响
| 分组 | TDZ(mg/L) | 不定芽形成时间(天) | 诱导率 | 平均不定芽数/个 |
| 1 | -- | 无 | 0％ | 0 |
| 2 | 0.01 | 25 | 63.3％ | 2.8 |
| 3 | 0.05 | 21 | 76.7％ | 3.6 |
| 4 | 0.1 | 28 | 60％ | 3.1 |
| 5 | 0.5 | 28 | 48.3％ | 2.2 |
| 6 | 1.0 | 无 | 0％ | 0 |
从上表可以看出，使用适当浓度的TDZ比不用时的诱导率要高，且不定芽形成时间更短；TDZ为0.05mg/L时，诱导率最高，不定芽形成时间最短，为不定芽诱导培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
实施例6
丛生芽诱导培养基中植物生长调节剂成分和浓度对丛生芽生成和生长的影响
取生长情况一致的无菌实生苗若干，取其腋芽或顶芽，接种于丛生芽诱导培养基中，培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h，培养至丛生芽生成至3cm长，其中丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充6-BA、NAA、
蔗糖、琼脂，在MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据0.1—2.0mg/L 6-BA、0.1—0.5mg/L NAA浓度进行分组，观察并记录培养基中丛生芽的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3 6-BA、NAA对丛生芽生成及生长的影响
从上表可以看出，同时使用6-BA、NAA比单一组分使用的诱导率更高，6-BA为1.5mg/L、NAA为0.1mg/L时，诱导率最高，为丛生芽诱导培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
实施例7
壮苗生根培养基中植物生长调节剂成分和浓度对无菌种苗的生成和生长的影响
取生长情况一致的丛生芽或不定芽接种至壮苗生根培养基中培养，培养温度为25℃，光照强度为2000Lx，光周期14/10h，直至得到猕猴桃无菌种苗，其中壮苗生根培养基的组成为：MS基本培养基，补充生长素类似物IBA、NAA、蔗糖、琼脂，在MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据IBA与NAA的浓度进行分组，观察并记录培养基中无菌种苗的培养情况，具体分组及培养结果见表4。
表4不同植物生长调节剂成分和浓度对猕猴桃芽苗壮苗生根的影响
从上表可以看出，适当配比的IBA与NAA比单独使用NAA时的生根率更高，开始生根的时间更短，IBA为0.2mg/L、NAA为0.2mg/L时，生根率最高，为壮苗生根培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：所述快速繁殖方法包括以下步骤：
(1)无菌播种：取处理后的猕猴桃种子，接种到初代培养基中，培养3—4周，直至种子萌发并生长形成实生苗；
(2)增殖培养：切取步骤(1)所述实生苗的不带芽点的茎段或叶片，接种于不定芽诱导培养基中，培养4—6周，直至不定芽生成至一定长度；
或者切取步骤(1)所述实生苗的带腋芽或顶芽的茎段，接种于丛生芽诱导培养基中，培养3—5周，直至丛生芽生成至一定长度；
(3)壮苗生根培养：将步骤(2)所述不定芽或丛生芽接种至壮苗生根培养基中，培养3—4周，即得猕猴桃无菌种苗。
2.根据权利要求1所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)所述初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.1—1.0mg/ LGA3、1.0mg/LPVP、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
3.根据权利要求2所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)所述初代培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/L GA3、1.0mg/LPVP、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)所述猕猴桃种子的处理方法为：在无菌操作台上，将猕猴桃种子先用75％酒精处理20—40s，用无菌水清洗3—4次，再用0.1％的升汞处理10—13min，用无菌水清洗5—7次，晾干即可。
5.根据权利要求1所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(2)所述不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.01—0.5mg/LTDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
6.根据权利要求5所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(2)所述不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
7.根据权利要求1所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(2)所述丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.1—2.0mg/L 6-BA、0.1—0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
8.根据权利要求7所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(2)所述丛生芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
9.根据权利要求1所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(3)所述壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1—1.0mg/LNAA、0.1—1.0mg/LIBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
10.根据权利要求9所述的一种猕猴桃无菌种苗的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(3)所述壮苗生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/L NAA、0.2mg/L IBA、25g/L蔗糖、6g/L琼脂。
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