CN101120653B - 无籽罗汉果及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明将公开无籽罗汉果及其培育方法，其培育方法如下：1)取二倍体罗汉果雌、雄株外植体繁育组培苗；2)取组培继代苗，进行染色体加倍的诱导；3)切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位进行分化培养；4)切取分化培养成的新芽茎尖和茎段进行从生芽培养；5)将培养成的完整植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；6)将四倍体植株和二倍体植株按常规技术种植，开花时进行人工授粉杂交，得到交种子；7)将杂交种子繁殖成完整植株，进行染色体数目检测；筛选出三倍体植株，生根培养、炼苗；8)将三倍体植株和二倍体植株种植，开花时用二倍体雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

Description

无籽罗汉果及其培育方法

(一)技术领域：

本发明涉及生物技术育种领域，尤其涉及无籽罗汉果，本发明还涉及这种无籽罗汉果的培育方法。

(二)背景技术：

罗汉果Siraitiagrosvenororii(Swile)C.Jeffrey是葫芦科罗汉果属多年生藤本植物的果实，为我国所特有，药食两用已有300多年的历史。现代研究表明：罗汉果药用有效成分为罗汉果甜苷，具有镇咳祛痰、双向调节肠道运动、清除人体内的自由基、抑制口腔中变形链球菌致龋、保肝防癌、降低血清胆固醇、降血糖、降血脂作用。罗汉果甜苷是世界最强甜味物质之一，其中甜苷V比蔗糖甜300倍。甜苷最大的优点是热量极低，理化性能稳定，水溶性好，无任何毒副作用，能广泛用于食品、保健品、药品中作甜味剂，适合所有人群长期食用，是国际公认的综合性状最佳的天然甜味剂，市场前景广阔。

常规罗汉果由果皮、果肉、种子构成，为二倍体植株。罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，果实内的种子不含甜苷，并且含有大量油脂等，占果实重的45％左右，口感较差。在提取甜苷时，整果利用率低，果实种子内的油脂使提取液混浊，增加了纯化的难度和生产成本。此外，常规二倍体罗汉果的甜苷平均含量较低，提取收得率仅在1％左右，使得甜苷的价格居高不下，仅能在高端产品中使用。

诱导植物多倍体的形成，是加大植物遗传变异、改良作物品性的重要手段。多倍体植株与二倍体植株相比，抗逆性增强，具有形态上的巨大性，可大幅提高相应部位的产量，多倍体植株中次生代谢产物的含量较二倍体植株明显增加，尤其是三倍体植株果实还具有无籽的特性。将多倍体诱导技术运用于无籽罗汉果的研发，是克服二倍体植株果实缺陷的最佳途径。开发无籽罗汉果，对于整个罗汉果产业具有里程碑意义。

前人对罗汉果植株的多倍体诱导进行了一些研究，已经成功诱导出同源四倍体植株，但植株生长缓慢，生长势比二倍体植株弱，当年结果开花株数较少，结实率下降，果实变小、变短，果实内仍有大量种子，没有克服二倍体植株果实的缺陷，达不到推广应用的要求。迄今为止，人们还未进行三倍体罗汉果的研究，无籽罗汉果及培育方法尚属国际空白。

(三)发明内容：

本发明将公开一种甜苷含量高、整果利用率高、口感好的无籽罗汉果，本发明还将公开这种无籽罗汉果的培育方法。

本发明无籽罗汉果的培育方法，其步骤如下：

1)取二倍体罗汉果雌、雄株外植体，繁育组培苗，一般来说，是取成花因子活化的二倍体罗汉果雌、雄株外植体，繁育组培苗；

2)选取生长势强的组培继代苗，在其不同部位造成创伤，用保水性好的材料包裹，滴入质量浓度为0.01-1.0％的秋水仙素溶液浸润3-10天；然后用无菌水冼净；

3)切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位，分别转入分化培养基中先进行暗培养5-10天，再进行光照培养20-30天；

4)切分经分化培养长出的新芽的茎尖和茎段分别转入增殖培养基中诱导产生丛生芽，将丛生芽分株培养成完整植株；或者是将切分的茎尖、茎段转入愈伤组织培养基中诱导愈伤组织的产生和增殖，将愈伤组织切分成小块，转入分化培养基中诱导产生丛生芽，再将丛生芽分株培养成完整植株；

5)切取步骤4)中得到的完整植株的分生组织进行染色体数目的检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；

6)将培养得到的四倍体植株和二倍体植株按常规技术大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N，♂4N×♀2N)，得到杂交种子；

7)将杂交种子繁殖成完整植株，再对其分生组织进行染色体数目的检测，筛选出三倍体植株进行生根培养、炼苗；

8)将培养得到的三倍体植株与二倍体雄株按常规技术大田种植，开花时用二倍体雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

本发明还包括育成的无籽罗汉果。

本发明的优点：

本发明利用成花因子活化的外植体繁殖组培苗，确保了无籽罗汉果植株当年种植当年丰产，种植经济效益高；利用组培继代苗在不同部位造成创伤，用保水性好的材料包裹，滴入秋水仙素溶液浸润，转入分化培养基中先进行暗培养，再进行光照培养，诱导成功率高；通过将四倍体植株进行育性复壮后和二倍体植株杂交获得的三倍体植株，降低了植株的倍性，增强了可交配性，得到的三倍体植株生理优势高于四倍体植株，随后运用二倍体雄株进行回交，有利于通过回交转导新种携有的有用的外源性状，从而实现优良无籽罗汉果的培育；由上述培育方法育成的无籽罗汉果甜苷含量高，整果利用率高，口感好，大大降低了罗汉果甜苷的加工难度和生产成本，提取收得率显著增加。

(四)具体实施方式：

实施例1

设定室内培养温度为15-24℃，室内操作在无菌条件下进行；

1)取成花因子活化的二倍体罗汉果雌、雄株外植体，按常规方法繁育组培苗；

2)选取生长势强的组培继代苗，在不同部位造成创伤，用脱脂棉包裹严密，在脱脂棉上滴入质量浓度为0.03％的秋水仙素溶液浸润10天，用无菌水冼净；

3)切取经诱导处理后雌、雄株的不同部位，分别转入分化培养基中先进行暗培养10天，再进行光照培养20天，每天光照8-12小时，光照强度为1000-2000LX；

4)切取经上述培养后长出的新芽的茎尖和茎段转入增殖培养基中诱导产生丛生芽，将丛生芽分株培养成完整植株；

5)切取步骤4)中得到的完整植株的茎尖分生组织进行染色体数目的检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；

6)将培养成的四倍体植株和二倍体植株按常规技术大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N，♂4N×♀2N)，得到杂交种子；

7)将杂交种子在30℃时，无菌条件下繁殖成完整植株，再对其茎尖分生组织进行染色体数目的检测，筛选出三倍体植株进行生根培养、炼苗；

8)将培养成的三倍体植株和二倍体雄株按常规技术大田种植，开花时用二倍体的雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

实施例2

设定室内培养温度为24-32℃，室内操作在无菌条件下进行；

1)取成花因子活化的二倍体罗汉果雌、雄株外植体，按常规方法繁育组培苗；

2)选取组培继代苗，用质量浓度为0.8％的秋水仙素溶液将其顶芽浸润3天，用无菌水冼净；

3)切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位，分别转入分化培养基中先进行暗培养5天，再进行光照培养20天，每天光照12-16小时，光照强度为2000-3600LX；

4)切取经上述培养后长出的新芽的茎尖和茎段转入愈伤组织培养基中诱导愈伤组织的产生和增殖，将愈伤组织切分成小块，转入分化培养基中诱导产生丛生芽，再将丛生芽分株培养成完整植株；

5)切取步骤4)中得到的完整植株的根尖分生组织进行染色体数目的检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；

6)将培养成的四倍体植株和二倍体植株大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N，♂4N×♀2N)，得到杂交种子；

7)将杂交种子繁殖成完整的植株，对其根尖分生组织进行染色体数目的检测，筛选出三倍体植株进行生根培养、炼苗；

8)将培养成的三倍体植株和二倍体雄株按常规技术大田种植，开花时用二倍体的雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

Claims (8)

1.无籽罗汉果的培育方法，其步骤依次如下：

1)选取二倍体罗汉果雌、雄株外植体，繁育组培苗；

2)选取组培继代苗，用秋水仙素进行染色体加倍的诱导；所述染色体加倍的诱导，是在雌、雄株组培继代苗的不同部位造成创伤，先用保水性好的材料包裹，再用秋水仙素溶液浸润，对其进行染色体加倍的诱导；所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.01-1.0％；

3)切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位进行分化培养；

4)切取分化培养成的新芽茎尖和茎段进行丛生芽培养；

5)将培养成的完整植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；

6)将四倍体植株和二倍体植株按常规技术种植，开花时进行人工授粉杂交，得到杂交种子；

7)将杂交种子繁殖成完整植株，再进行染色体数目检测；筛选出三倍体植株进行生根培养、炼苗；

8)将三倍体植株和二倍体植株按常规技术种植，开花时用二倍体的雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

2.根据权利要求1所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：步骤1)中，采用成花因子活化的二倍体罗汉果雌、雄株外植体繁育组培苗。

3.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：步骤3)中，所述分化培养是切取诱导处理后的雌、雄株的不同部位，分别转入分化培养基中先进行暗培养5-10天，再进行光照培养20-30天。

4.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：步骤4)中，所述丛生芽培养，是切取分化培养成的新芽茎尖和茎段转入增殖培养基中诱导丛生芽，将丛生芽分株培养成完整植株；或者是将其转入愈伤组织培养基中诱导愈伤组织的产生和增殖，将愈伤组织切分成小块，转入分化培养基中诱导产生丛生芽，再将丛生芽分株培养成完整植株。

5.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：所述步骤5)、7)中，切取任何生长阶段的罗汉果植株的分生组织进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株或三倍体植株。

6.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：所述步骤6)中，是将培养成的四倍体植株和二倍体植株按常规技术大田种植，开花时人工授粉杂交，得到杂交种子。

7.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：步骤1)、2)、3)、4)、5)、7)中，进行培养的温度为15-36℃。

8.根据权利要求1或2所述的无籽罗汉果的培育方法，其特征在于：所述步骤8)中，是将三倍体植株和二倍体雄株按常规技术种植，开花时用二倍体的雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。