CN104082140B - 一种盒子草快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种盒子草的繁育方法，所述的方法包括：1)外植体的选取，2）外植体消毒，3)初始诱导培养，4)愈伤组织诱导，5）增殖培养，6）生根培养，7）炼苗和移栽。采用本方法繁育盒子草，可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
Description
技术领域
本发明涉及植物快速繁殖技术领域，尤其是盒子草快速繁殖技术领域。
背景技术
中药盒子草，又名合子草、天球草、无白草等，为葫芦科植物盒子草(ActinostemmatenerumGriff)的全草、种子和叶，分布于我国南北各地，朝鲜、日本、苏联、印度、中南半岛也有分布。合子草性寒、味苦，有小毒，具有利尿消肿、清热解毒、去湿之功效、主治肾炎水肿、腹水肿胀、毒蛇咬伤及疳积初起等病症。
现代研究发现合子草含有很多结构新颖、抗肿瘤活性十分显著的皂苷类成分以及黄酮类、氨基酸和微量元素。
药理学研究发现，盒子草具有显著的抗肿瘤活性，能增强免疫力、抗血栓、抗炎，抗氧化等。
目前，盒子草多为野生，鲜有栽培，导致了盒子草的品种纯度及药材质量得不到有效的控制，制约了盒子草产业的发展。而组织培养育苗技术既可以保持种的纯度和特性，也可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
现有技术中尚无经愈伤组织途径获得盒子草再生植株的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种盒子草快速繁殖的方法，经愈伤组织途径获得盒子草丛生芽，诱导生根，可实现盒子草组培苗的大量快速繁殖。
为了解决上述技术问题，本发明提出下列技术方案：
一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的盒子草茎为外植体，剪去叶片后剪成1-2cm的茎段；
2）外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min；随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.5％升汞溶液中处理6-8分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L；
4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.05mg/L+PVP5-10mg/L；
5）分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
6)生根培养：将5）步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
7）炼苗和移栽：将有生根的盒子草幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫即可；
所述的WPM培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3400mg/L，硫酸钾K2SO4900mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L；四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L；微量元素：硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；
所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO31900mg/L，硝酸铵NH4NO31650mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L；微量元素：碘化钾KI0.83mg/L，硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH为5.7；
所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO3950mg/L，硝酸铵NH4NO3825mg/L，磷酸二氢钾KH2PO385mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L；余同上述MS培养基；
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；
所述的NAA为α-萘乙酸；
所述的IBA为吲哚-3-丁酸；
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
优选的，步骤3)中初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP6mg/L。
优选的，步骤4)中愈伤组织培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.04mg/L+PVP8mg/L。
优选的，步骤5)中分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+PVP8mg/L。
优选的，步骤6)中生根用培养基为：1/2MS+IBA0.3mg/L+PVP8mg/L。
采用本发明繁殖盒子草，可实现盒子草组培苗的大量快速繁殖，为盒子草生产栽培和品种改良奠定基础。
为了更好的阐述技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明所要求的保护范围不限于下列实施例。
具体实施方式
实施例1
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的盒子草茎段为外植体，剪去叶片后剪成1-2cm的茎段；
2）外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHZ超声波清洗中保持温度30℃处理30min，然后以自来水冲洗10min；随后在超净工作台上以70%的酒精消毒25秒，0.5％升汞溶液中处理6分钟，然后以无菌水冲洗4遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养18d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+PVP5mg/L；
4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养20d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+PVP5mg/L；
5）分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养25d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+PVP5mg/L；
6)生根培养：将5）步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养20d后生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.1mg/L+PVP5mg/L；
7）炼苗和移栽：将有生根的盒子草幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为95.2%。
实施例2
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的盒子草茎段为外植体，剪去叶片后剪成1-2cm的茎段；
2）外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理45min，然后以自来水冲洗20min；随后在超净工作台上以75%的酒精消毒25-35秒，0.5％升汞溶液中处理8分钟，然后以无菌水冲洗5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养4d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+PVP10mg/L；
4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养15d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+PVP10mg/L；
5）分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+PVP10mg/L；
6)生根培养：将5）步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养15d后生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.5mg/L+PVP10mg/L；
7）炼苗和移栽：将有生根的盒子草幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为96.3%。
实施例3
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的盒子草茎段为外植体，剪去叶片后剪成1-2cm的茎段；
2）外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理45min，然后以自来水冲洗20min；随后在超净工作台上以75%的酒精消毒35秒，0.5％升汞溶液中处理8分钟，然后以无菌水冲洗5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养5d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养16d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP6mg/L；
4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养18d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.04mg/L+PVP8mg/L；
5）分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养22d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+PVP8mg/L；
6)生根培养：将5）步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养18d后生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.3mg/L+PVP8mg/L；
7）炼苗和移栽：将有生根的盒子草幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为98.8%。
Claims (5)
1.一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的盒子草茎为外植体，剪去叶片后剪成1-2cm的茎段；
2）外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min；随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.5％升汞溶液中处理6-8分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L；
4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d，条件为暗培养，温度20℃±2℃；所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.05mg/L+PVP5-10mg/L；
5）分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d，增殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
6)生根培养：将5）步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养生根，培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；所述生根用培养基为：1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
7）炼苗和移栽：将有生根的盒子草幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽至装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫；
所述的WPM培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3400mg/L，硫酸钾K2SO4900mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L；四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L；微量元素：硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；
所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO31900mg/L，硝酸铵NH4NO31650mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L；微量元素：碘化钾KI0.83mg/L，硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH为5.7；
所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO3950mg/L，硝酸铵NH4NO3825mg/L，磷酸二氢钾KH2PO385mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L；余同上述MS培养基；
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；
所述的NAA为α-萘乙酸；
所述的IBA为吲哚-3-丁酸；
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤3)中初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP6mg/L。
3.根据权利要求1所述一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤4)中愈伤组织培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.04mg/L+PVP8mg/L。
4.根据权利要求1所述一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤5)中分化和增殖培养用培养基为：1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+PVP8mg/L。
5.根据权利要求1所述一种盒子草快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤6)中生根用培养基为：1/2MS+IBA0.3mg/L+PVP8mg/L。
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