CN104082145B - 一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种翅柄铁线蕨的繁育方法,所述的方法包括:1)外植体的选取,2)外植体消毒,3)初始诱导培养,4)愈伤组织诱导,5)增殖培养,6)生根培养,7)炼苗和移栽。采用本方法繁育翅柄铁线蕨,可以降低生产成本,提高繁殖速度和成活率。
Description
技术领域
本发明涉及植物快速繁殖技术领域,尤其是翅柄铁线蕨快速繁殖技术领域。
背景技术
蕨类植物是介于苔藓植物和种子植物之间的一大类群植物,具有独特的生活史。全世界蕨类植物约有12000多种,我国是世界上蕨类植物资源最丰富的地区之一,约有2000余种。蕨类植物分布很广,从高山到海滨,从寒带到热带都有生长,生态类型也极其多样,主要为土生、石生或附生,少数为水生或沼生。
蕨类植物在经济有着一定的重要性,常常被用作药物、食物、指示植物、工农业的原料。
大多数蕨类植物具有较高的观赏价值,它们虽然没有鲜艳夺目的花与果实,然而它们以千姿百态奇特的叶形、叶姿和青翠碧绿的色彩,使人赏心悦目,在观赏植物中占有重要地位。
翅柄铁线蕨(学名:Adiantumsubliferum(Wall.)exHook.)是蕨类植物,多年生草本。植株高约30厘米。根状茎短而直立,被棕褐色披针形鳞片。叶簇生;栗黑色,有光泽,叶片披针形,互生,顶生羽片为扇形,外缘具有3-6缺刻,基部楔形。叶脉多回二歧分叉,叶干后厚纸质,淡褐绿色,有光泽,能着地生根,行无性繁殖。孢子囊群每羽片3-7枚;囊群盖椭圆形或肾形,染色体2n=120。生林下潮湿的地方;分布于中国、越南、印度、尼泊尔、印度尼西亚、菲律宾及非洲西部热带地区。
翅柄铁线蕨乌黑发亮的细长叶柄两侧,装点着浅绿色的翡翠膜带,宛若信鸽的双翼,翩然飞致,因此得名。丛生叶翠绿,由二排对开近半月状的羽片组成,羽片粉红色,十分艳丽。长大的叶自然分披,像少女的披肩长发,洋气洒脱,给人以美感,楚楚动人,别开生面。翠绿色的羽片,先端变窄,有时延长为鞭状,落地生根,根茎繁衍形成新植株。枝芳菲的翅柄铁线蕨,向四周平展的绿叶,簇拥着微红色的幼叶,酷似一丛待放的花朵,妩媚动人,供游人大饱眼富,使观者留恋往返。
目前,翅柄铁线蕨多采用孢子繁育来进行生产栽培,这繁育技术提高品种的纯度,保持了品种特性,但成活率较低及繁殖速度较慢,制约了翅柄铁线蕨产业的发展。而组织培养育苗技术既可以保持种的纯度和特性,也可以降低生产成本,提高繁殖速度和成活率。
现有技术中尚无经愈伤组织途径获得翅柄铁线蕨再生植株的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,经愈伤组织途径获得翅柄铁线蕨丛生芽,诱导生根,可实现翅柄铁线蕨组培苗的大量快速繁殖。
为了解决上述技术问题,本发明提出下列技术方案:
一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述的方法包括以下步骤:
1)外植体的选取:取2cm长的根状茎茎尖,去掉杂质及茎尖周围的绒毛等附属物;
2)外植体消毒:将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30-45min,然后以自来水冲洗10-20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒,0.02%升汞溶液中处理5-7分钟,然后以无菌水冲洗4-5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm,茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃;培养4-6d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12-18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15-20d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗5-8d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙和蛭石基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可;
所述的WPM培养基配方为:大量元素:硝酸铵NH4NO3400mg/L,硫酸钾K2SO4900mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L;四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L;微量元素:硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;
所述的MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO31900mg/L,硝酸铵NH4NO31650mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L;微量元素:碘化钾KI0.83mg/L,硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L,氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素0.5mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;蔗糖30g/L,琼脂粉7g/L,pH为5.7;
所述的1/2MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO3950mg/L,硝酸铵NH4NO3825mg/L,磷酸二氢钾KH2PO385mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L;余同上述MS培养基;
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤;
所述的NAA为α-萘乙酸;
所述的IBA为吲哚-3-丁酸;
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
优选的,步骤3)中初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L。
优选的,步骤4)中愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
优选的,步骤5)中分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
优选的,步骤6)中生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
采用本发明繁殖翅柄铁线蕨,可实现翅柄铁线蕨组培苗的大量快速繁殖,为翅柄铁线蕨生产栽培和品种改良奠定基础。
为了更好的阐述技术方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明,但本发明所要求的保护范围不限于下列实施例。
具体实施方式
实施例1
1)外植体的选取:取2cm长的根状茎茎尖,去掉杂质及茎尖周围的绒毛等附属物;
2)外植体消毒:将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30min,然后以自来水冲洗10min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25秒,0.02%升汞溶液中处理5分钟,然后以无菌水冲洗4遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm,茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃;培养6d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+PVP5mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养225d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+PVP5mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养20d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1mg/L+PVP5mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙和蛭石基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
经试验,采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为91.3%。
实施例2
1)外植体的选取:取2cm长的根状茎茎尖,去掉杂质及茎尖周围的绒毛等附属物;
2)外植体消毒:将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度35℃处理45min,然后以自来水冲洗20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒35秒,0.02%升汞溶液中处理7分钟,然后以无菌水冲洗5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm,茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃;培养4d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+PVP10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+PVP10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L+PVP10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙和蛭石基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
经试验,采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为90.2%。
实施例3
1)外植体的选取:取2cm长的根状茎茎尖,去掉杂质及茎尖周围的绒毛等附属物;
2)外植体消毒:将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理45min,然后以自来水冲洗20min;随后在超净工作台上以75%的酒精消毒35秒,0.02%升汞溶液中处理7分钟,然后以无菌水冲洗5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm,茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃;培养5d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养15d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养18d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养22d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养18d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗7d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙和蛭石基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
经试验,采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为92.2%。
Claims (5)
1.一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述的方法包括以下步骤:
1)外植体的选取:取2cm长的根状茎茎尖,去掉杂质及茎尖周围的绒毛附属物;
2)外植体消毒:将上述茎尖放入盛有自来水的20-25KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30-45min,然后以自来水冲洗10-20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒,0.02%升汞溶液中处理5-7分钟,然后以无菌水冲洗4-5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体两端各剪去2-3mm,茎尖按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强1000-2500Lx、光周期5-8h/d,温度25℃±2℃;培养4-6d后将其中未污染的外植体茎尖转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12-18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15-20d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期8-10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的翅柄铁线蕨幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗5-8d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽于装有河沙和蛭石基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫;
所述的WPM培养基配方为:大量元素:硝酸铵NH4NO3400mg/L,硫酸钾K2SO4900mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L;四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L;微量元素:硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;
所述的MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO31900mg/L,硝酸铵NH4NO31650mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L;微量元素:碘化钾KI0.83mg/L,硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L,氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素0.5mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;蔗糖30g/L,琼脂粉7g/L,pH为5.7;
所述的1/2MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO3950mg/L,硝酸铵NH4NO3825mg/L,磷酸二氢钾KH2PO385mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L;余同上述MS培养基;
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤;
所述的NAA为α-萘乙酸;
所述的IBA为吲哚-3-丁酸;
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤3)中初始诱导培养基组成为:MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L。
3.根据权利要求1所述一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤4)中愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
4.根据权利要求1所述一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤5)中分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
5.根据权利要求1所述一种翅柄铁线蕨快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤6)中生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
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Title |
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