CN102771395A - 一种黄精的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄精的组织培养方法，对当年生地下茎上的幼芽进行丛生芽诱导、生根培养、炼苗后进行移栽；对当年生带有隐藏芽点的块茎部分进行愈伤组织培养、增殖培养、生根培养、炼苗后进行移栽，通过该方法可以对黄精进行快速繁殖，并实现大面积工业化种植，以解决野生地藏黄精产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养方法，具体地说是黄精的组织培养方法。
背景技术
黄精(Polygonaturm sibiricum Redoute)别名鸡头黄精、鸡头参，属于百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物。中药以黄精根茎入药，具有补脾润肺、益气养阴、强壮筋骨等功效，能治疗体虚乏力、心悸气短、肺燥干咳、病后体虚、风湿痛疼、糖尿病等疾病，其活性成分主要为黄精多糖及皂甙等。
地藏黄精是安徽九华山地区特有的野生黄精品种，有着极高的药用和经济价值，随着黄精药用价值和保健价值越来越被人们认识,黄精原料的需求量也越来越大,致使野生黄精的无计划采集加剧,导致其资源枯竭加速,影响可持续开发利用。因此,为了保证黄精原料来源、实行产业化种植将成为必然趋势。近年来虽然有些地方开始人工种植黄精,但由于生产上多采用分根繁殖,其繁殖系数低,质量不稳定,故黄精种苗问题成了人工大面积种植的瓶颈。
植物的离体快速繁殖，是目前植物组织培养中应用最广泛、最有效的技术，尤其对于新引进品种、脱毒苗、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可实现离体快速增殖，且不受地区、气候影响，繁殖速度比常规生产快数百万倍，能迅速提供大量优质种苗。目前，人们对黄精的研究主要集中在其成分测定、药理作用以及人工栽培等方面，而关于组织培养方面的研究内容较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄精的组织培养方法，通过该方法可以对黄精进行快速繁殖，并实现大面积工业化种植，以解决野生地藏黄精产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。
本发明解决技术问题采用如下方案：
（1）外植体的选择与灭菌
选择当年生地下茎上的幼芽或当年生带有隐藏芽点的的块茎部分，所述块茎将其切成小块，且每块都带有至少一个隐藏的芽点；
将所述幼芽或块茎用自来水快速冲去泥沙，并用洗涤剂液浸泡30min以除去表面污垢，然后自来水冲洗3h，再置于超净工作台用体积浓度75%酒精灭菌15s，无菌水冲洗3遍，再将其放入体积浓度0.2%Hgcl2溶液中浸泡12-14min，所述Hgcl2溶液中包含有体积浓度0.15%-02%的吐温20，之后无菌水冲洗5遍，转入培养皿中吸干水分，等待接入培养基；
（2）幼芽丛生芽的诱导、块茎丛生芽愈伤组织培养和增殖培养
A、将经过步骤（1）处理的幼芽转入丛生芽诱导培养基中，所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；培养条件为温度：23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为20-30天；然后直接转入生根培养；
B、①将经过步骤（1）处理的带有隐藏芽点的的块茎接种MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为20-30天；中间剔除污染的块茎外植体；②在块茎组织分化形成愈伤组织后，转入培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为10-20天；愈伤组织进行增殖，将增殖后的愈伤组织切成1.0cm*1.0cm*1.0cm大小然后转入原先的诱导培养基MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为15-25天；
（3）生根的培养
将经过步骤（2）处理的外植体转入生根培养基中培养，所述生根培养基的配方为：1/2-1/3MS、NAA 0.2-0.5mg/L、琼脂6-8g/L、蔗糖20-30g/L；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为35-50天；
（4）炼苗和移栽
将经过炼苗的黄精根茎从接种瓶中取出，用清水洗掉培养基，在质量浓度0.1%高锰酸钾溶液中消毒1min，用清水冲洗干净后，假植在腐殖质土：沙子=1:1（v：v）的基质上，保持空气湿度95%以上，用遮阳网遮荫；根据成苗的时间安排栽植，在春季以后成苗则选择秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗则选择春栽即3月下旬，将假植的黄精根茎栽种到整好的露地畦内，将根茎段芽眼向上，每隔10～15cm平放1个根茎，行距20～25cm，覆土4～6cm，浇足水；在土壤封冻前，畦面上盖一层有机肥或薄膜，以利保暖越冬。
本发明方法中，采用不同营养体作为材料，既保证了遗传的稳定性，又增加了原材料利用的可能性。利用芽直接分化成叶片，然后进行成苗阶段，缩短了原先用芽经过诱导愈伤组织再分化成苗阶段的时间，同时利用块茎分化并增殖，大大提高繁殖的效率和数量，而对于不同部位消毒方法的不同，不仅降低了污染率也保证了较高的成活率，从而满足大规模推广和工厂化生产的要求。
本发明方法具有如下优点或效果：
1.本方法采用的黄精材料是安徽特有的野生品种，有极高的药用价值，而本方法可以适合工厂化使用，解决野生产量较少的问题，同时通过不同部位不同的培养方式多方面的对材料进行扩大和快速培养，提高材料的利用率的同时缩短培育时间，而且保证了较高的成活率。
2.本方法改进了常用的繁殖方法如：选择和常用方法不一样的取材部位，针对不同的取材部位采取不同的灭菌方式。针对不同部位的质地不同采用不同浓度的表面活性剂吐温20，使得消毒溶液Hgcl2能有效的渗透表层，改善之前的消毒效果不佳的状况，提高消毒的效率，从而大大提高无菌率和成活率。在此过程中因为茎段芽选取的是去除外层较厚苞片的最内层幼芽（一般成乳白色），所以需要表面活性剂的加入，提高灭菌效果，但是由于芽的组织选取的比较幼嫩，所以活性剂的量减少，达到即加强渗透效果又不损伤幼芽，而对于块茎组织，为坚硬的肉质结构，为了达到好的灭菌效果，所以增加吐温20的浓度，两种不同的取材选择不同的灭菌方式是为了在不伤害组织本身都能到达理想的灭菌效果。
3.本方法采用的诱导培养基对于茎段芽组织进行直接诱导分化形成叶片，而不需要通过先诱导愈伤组织再进行分化的长时间过程，大大缩短了成苗时间，对于野生黄精的资源利用，快速繁殖有极大的作用。
4.本方法在对于块茎培养的过程中采用了与前人不同的循环路径，即先将块茎在诱导培养基中进行培养，快速诱导出愈伤组织后立即转入增殖培养基进行增殖，将增殖后的材料再切分成1.0cm*1.0cm*1.0cm的大小接入原先的诱导培养基进行接下来的诱导分化培养，在两次诱导培养中间加入增殖的部分，这样做可以大大提高最终诱导产生的实验苗的数量，从而获得较大量的成苗，也可以一定程度上缩短常规成苗的时间。
5.本方法在前期诱导的过程中采用一种培养基对不同材料产生两种不同的诱导结果，可以节约配置不同实验材料所需的时间，能提高材料的利用率。
6.本方法中的组培苗营养充足、温光合理，长势旺盛。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。
以下实施例MS培养基配方：每升培养基中含KNO3（1900mg/L），NH4NO3（1650mg/L），MgSO4·7H2O（370mg/L），KH2PO4（170mg/L），CaCl2（330mg/L），KI（0.83mg/L）,H3BO3（6.2mg/L）,MnSO4·H2O（16.9mg/L）,ZnSO4·4H2O（8.6mg/L）,CuSO4·5H2O（0.025mg/L）,CoCl2·6H2O（0.025mg/L）,Na2MoO4·2H2O（0.25mg/L）,FeSO4·7H2O(27.85mg/L)，Na2EDTA(37.25mg/L),甘氨酸(2.0mg/L),烟酸B3(0.5mg/L),盐酸硫胺素B1(0.4mg/L),盐酸吡哆醇B6(0.5mg/L),肌醇(100mg/L)。
实施例1
（1）外植体的选择与灭菌
选择地藏黄精的当年生地下茎上的幼芽，将幼芽从土中挖出切取幼芽，自来水快速冲去泥沙，可用牙刷辅助冲洗，洗涤剂液（市售常规洗衣粉）浸泡30min并用软刷轻轻刷去表面污垢，将外层苞片去除，留下最内层乳白色幼芽，自来水冲洗3h，置于超净工作台上：体积浓度75%酒精溶液灭菌15s，之后无菌水冲洗3遍，体积浓度0.2%Hgcl2，Hgcl2溶液中包含有体积浓度0.15%的吐温20，浸泡12min，无菌水冲洗5遍，转入培养皿中吸干水分等待接入培养基；混合了吐温20后的Hgcl2溶液消毒效果比原先没有混合的溶液无菌率提高了10倍。
（2）茎段芽的诱导分化：
将茎上幼芽接种MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，5周后直接分化形成叶片。诱导率达到了81%。
（3）生根的培养：从中选取生长健壮，叶片展开，长度适中的诱导分化幼芽，转入以1/3MS+NAA 0.6mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L pH 5.8；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为7-10天；在3次重复处理，每次处理3组，每组9株的实验中，平均每个外植体生根7.9条。
（4）炼苗与移栽
将生根后的成苗每隔25-30天重新转入生根培养基，如此反复2-3次，这样的成苗质量优良，能经受外界环境带来的影响。将壮苗后的成苗瓶口打开，在培养室半遮光放置2-3日，期间适时补充水分，使组培苗逐步适应外界环境，达到炼苗的目的。
将经过炼苗的黄精从接种瓶中取出，用清水洗掉培养基，在质量浓度0.1%高锰酸钾溶液中消毒1min，用清水冲洗干净后，假植在基质[V(腐殖质土)：V(沙子)--1：1]上，保持空气湿度95%以上，用遮光率75%遮阳网遮荫。30d后假植成活率达90%以上。以后每隔7d喷施1次MS营养液。为了缩短培育时间，根据成苗的时间安排栽植，在春季以后成苗则选择秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗则选择春栽即3月下旬，将假植的黄精根茎栽种到整好的露地畦内，将根茎段芽眼向上，每隔10～15cm平放1个根茎，行距20～25cm，覆土4～6cm，浇足水；在土壤封冻前，畦面上盖一层有机肥或薄膜，以利保暖越冬；成活率达80%。
实施例2
（2）外植体的选择与灭菌
选择地藏黄精的当年生（即栽植后第一年生长出来的）带有隐藏芽点的的块茎部分，块茎先切成1.0cm3左右的小块，且每块都必须带有至少一个隐藏的芽点，自来水快速冲去泥沙，可用牙刷辅助冲洗，洗涤剂液浸泡30min并用软刷轻轻刷去表面污垢，自来水冲洗3h，置于超净工作台上：体积浓度75%酒精溶液灭菌15s，之后无菌水冲洗3遍，体积浓度0.2%Hgcl2，Hgcl2溶液中包含有体积浓度0.2%的吐温20，浸泡14min，无菌水冲洗5遍；转入培养皿中吸干水分等待接入培养基。混合了吐温20后的Hgcl2溶液消毒效果比原先没有混合的溶液无菌率提高了10倍。
（2）块茎的的分化增殖培养
1）将带有隐藏芽点的的块茎接种MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为20-30天；中间剔除污染的外植体。81组平行试验中，1周后每个块茎外植体长出愈伤组织，但是在不转入增殖培养基一直在分化培养基中6周后外植体也可获得平均9.8个不定芽，所需时间较长，且最终产量不高。
2）在块茎组织分化形成愈伤组织后，转入培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为10-20天。愈伤组织进行增殖，进行接下来的诱导分化培养，将增殖后的愈伤组织切成1.0cm*1.0cm*1.0cm大小然后再转入原先的诱导培养基MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为15-25天。最终发现不定芽数量提高了12倍左右，大大提高了组培苗量。同时也缩短了整个培育时间。
（3）生根的培养：从中选取生长健壮，叶片展开，长度适中的组织，切除多余的愈伤组织，转入以1/3MS+NAA 0.6mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L pH 5.8；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为7-10天。在3次重复处理，每次处理3组，每组9株的实验中，平均每个外植体生根7.7条。
（4）炼苗与移栽
生根后的成苗每隔25-30天重新转入生根培养基，如此反复2-3次，这样的成苗质量优良，能经受外界环境带来的影响。将壮苗后的成苗瓶口打开，在培养室半遮光放置2-3日，期间适时补充水分，使组培苗逐步适应外界环境，达到炼苗的目的。
将经过炼苗的黄精从接种瓶中取出，用清水洗掉培养基，在质量浓度0.1%高锰酸钾溶液中消毒1min，用清水冲洗干净后，假植在基质[V(腐殖质土)：V(沙子)--1：1]上，保持空气湿度95%以上，用遮光率75%遮阳网遮荫。30d后假植成活率达90%以上。以后每隔7d喷施1次MS营养液。为了缩短培育时间，根据成苗的时间安排栽植，在春季以后成苗则选择秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗则选择春栽即3月下旬，将假植的黄精根茎栽种到整好的露地畦内，将根茎段芽眼向上，每隔10～15cm平放1个根茎，行距20～25cm，覆土4～6cm，浇足水；在土壤封冻前，畦面上盖一层有机肥或薄膜，以利保暖越冬；成活率达75%。
综合以上各实验步骤，本发明的方法，在现有黄精、地藏黄精组织培养技术的基础上添加了茎段芽直接诱导分化和块茎组织培养过程。在增加的材料的利用率的同时对于不同的材料选择不同的处理方法，能够提高诱导率的同时增加增殖数量和质量，从而适合大规模的工厂化生产，解决原材料稀缺的问题，缩短的培育周期，使材料可以发挥更大的药用和经济价值。
Claims (1)
1.一种黄精的组织培养方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
（1）外植体的选择与灭菌
选择当年生地下茎上的幼芽或当年生带有隐藏芽点的的块茎部分，所述块茎将其切成小块，且每块都带有至少一个隐藏的芽点；
将所述幼芽或块茎用自来水快速冲去泥沙，并用洗涤剂液浸泡30min以除去表面污垢，然后自来水冲洗3h，再置于超净工作台用体积浓度75%酒精灭菌15s，无菌水冲洗3遍，再将其放入体积浓度0.2%Hgcl2溶液中浸泡12-14min，所述Hgcl2溶液中含有体积浓度0.15%-02%的吐温20，之后无菌水冲洗5遍，转入培养皿中吸干水分，等待接入培养基；
（2）幼芽丛生芽的诱导、块茎丛生芽愈伤组织培养和增殖培养
A、将经过步骤（1）处理的幼芽转入丛生芽诱导培养基中，所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；培养条件为温度：23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为20-30天；然后直接转入生根培养；
B、①将经过步骤（1）处理的带有隐藏芽点的的块茎接种MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为20-30天；中间剔除污染的块茎外植体；②在块茎组织分化形成愈伤组织后，将诱导出的的愈伤组织转入培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为10-20天；愈伤组织进行增殖，然后将增殖后的愈伤组织切成1.0cm*1.0cm*1.0cm大小，再转入原先的诱导培养基MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8培养基上，23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为15-25天；
（3）生根的培养
将经过步骤（2）处理的外植体转入生根培养基中培养，所述生根培养基的配方为：1/2-1/3MS、NAA 0.2-0.5mg/L、琼脂6-8g/L、蔗糖20-30g/L；培养条件为温度23±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为35-50天；
（4）炼苗和移栽
将经过炼苗的黄精根茎从接种瓶中取出，用清水洗掉培养基，在质量浓度0.1%高锰酸钾溶液中消毒1min，用清水冲洗干净后，假植在腐殖质土：沙子=1:1（v：v）的基质上，保持空气湿度95%以上，用遮阳网遮荫；根据成苗的时间安排栽植，在春季以后成苗则选择秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗则选择春栽即3月下旬，将假植的黄精根茎栽种到整好的露地畦内，将根茎段芽眼向上，每隔10～15cm平放1个根茎，行距20～25cm，覆土4～6cm，浇足水；在土壤封冻前，畦面上盖一层有机肥或薄膜，以利保暖越冬。
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