CN104285813B

CN104285813B - 一种金花茶组培繁殖方法

Info

Publication number: CN104285813B
Application number: CN201410581398.2A
Authority: CN
Inventors: 李桂娥; 李志辉; 罗燕英; 黄晓娜; 蒋昌杰; 黄连冬; 文萍; 叶品明
Original assignee: Nanning camellia park
Current assignee: Nanning camellia park
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-10-27
Also published as: CN104285813A

Abstract

本发明提供了一种金花茶组培繁殖方法，包括无菌苗的获取、无菌苗的增殖、丛生芽壮芽培养、增殖扩繁和生根培养的工序，通过选取金花茶种胚作为外植体后接种于初代培养基中获取金花茶无菌苗，再将无菌芽接种于继代增殖培养基和壮芽培养基中，重复循环增殖和壮苗的过程，直至获得大量健壮无菌芽，最后转接至生根培养基中进行生根培养。本发明克服了金花茶组织培养过程中的无菌苗玻璃化问题，使得材料能够多次继代，实现大量增殖，缩短了金花茶的育苗周期，节省了育苗材料，并且生根率达95‑98%，移栽成活率达90%以上，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。

Description

一种金花茶组培繁殖方法

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，涉及组织培养育苗技术，尤其是涉及一种金花茶组培繁殖方法。

背景技术

1960年，我国科学工作者首次在广西南宁一带发现了一种金黄色的山茶花，被命名为金花茶。金花茶的发现轰动了全球园艺界、新闻界，受到了国内外园艺学家的高度重视，它被认为是培育金黄色山茶花品种的最优良原始材料。金花茶是一种古老的植物，极为罕见，与银杉、桫椤、珙桐等珍贵“植物活化石”齐名，国外称之为神奇的东方魔茶，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”。此外，金花茶含有特殊的色泽遗传基因，具有重要的科研价值。经科学鉴定，金花茶含有特殊的金花茶皂甙、黄酮类、茶多酚、维生素及氨基酸等人体所需的营养成分，富含对人体具有重要保健作用的天然有机锗、硒、锰、钒、锌、钴等微量元素，其化学成分多达400多种，国内外目前还未发现一种可食用植物，其稀有元素含量能如此丰富齐全给予一体的。目前，在全世界已发现的46个原种和5 个变种的金花茶植物中，约有28个原种和5 个变种产自广西。但是长期以来由于各种人为和自然因素以及物种自身因素，现存野生金花茶组植物资源稀少，甚至位于国家濒危野生动植物之列，是我国八种国家一级保护植物之一（1984.7国务院文件），属《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ中的植物种，也已被列为广西壮族自治区重点保护野生植物。

然而，传统的茶花繁殖方法(扦插、嫁接、压条、播种)对金花茶的植株和种子材料需求量大，严重制约珍稀濒危金花茶物种的保护和大量繁殖；同时，这一繁育瓶颈也使得一些名贵的结实率低的茶花杂交新品种难以扩大推广。因此，实现金花茶的快速繁殖是当前金花茶育种工作者的当务之急。

植物组织培养是在无菌条件下，将植物的离体器官、组织、细胞或原生质体，培养在人工配制的培养基上，人为控制培养基条件，使其生长、分化、增殖，发育成完整植株的过程。由于组织培养是在脱离植物母体的条件下进行的，所以也称为离体培养。植物组织培养具有所需植株原材料少，不受生长季节限制，培养周期短，变异低，可保持母本的优良遗传特性等优点；因此，植物组织培养技术可用于拯救濒危植物，解决植物产种子少或无而无法大量繁殖的难题。植物组织培养技术无疑是茶花育种工作者的福音，这为金花茶的繁育提供了更加可行的方案，避免了杂交一代的纯种选育工作，大大缩短了育种期限。已有茶花育种工作者进行了相关方面的研究，李建安等（2003）对小果油茶和广宁红花油茶的花药进行离体培养，并诱导形成愈伤组织；陈丽华（2007）等以云南红花油茶的嫩芽及带芽嫩茎段为外植体材料，研究探索其茎尖组织培养的外植体处理方法和丛芽诱导培养基，筛选出了云南红花油茶较适宜的丛芽诱导培养基；高宇琼和赖钟雄（2010）以金花茶子叶胚切块和成年植株叶片为材料，进行愈伤组织培养研究，成功诱导出愈伤组织，并能较好地继代。在前人的报道中，关于金花茶的组培研究相对较少，特别在金花茶组培苗诱导生根方面未见报道。

发明内容

发明目的:本发明为了克服金花茶种质资源稀少，结果率低，传统育苗方法所需材料多、周期长等技术问题，提供了一种降低金花茶组培生产成本，提高生产效率的金花茶组培繁殖方法。

技术方案:为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种金花茶组培繁殖方法，包括无菌苗的获取、无菌芽的增殖、丛生芽壮芽培养、增殖扩繁和生根培养的工序，通过选取金花茶种胚作为外植体后接种于初代培养基中获取金花茶无菌芽，再将无菌芽接种于继代增殖培养基和壮芽培养基中，重复循环增殖和壮苗的过程，直至获得大量无菌苗，最后转接至生根培养基中进行生根培养，具体操作步骤如下：

（1）无菌苗的获取：选取金花茶种子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌后，接种于初代培养基，以获取金花茶无菌苗；

（2）无菌芽的增殖：将无菌芽切成顶芽和带芽茎段分别接种于继代增殖培养基上，诱导无菌芽增殖，获得丛生芽；

（3）壮苗培养：将增殖获得的金花茶无菌丛生芽单个切下转接至壮苗培养基中，促进无菌芽伸长增壮；

（4）增殖扩繁：将步骤（3）的金花茶无菌苗再次接种于步骤（2）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（3），循环往复，使得无菌芽进行重复循环增殖和壮苗的过程，直至获得大量无菌芽；步骤（2）和步骤（3）的继代周期均为5-6周；

（5）生根培养：选取健壮、高度为4-6cm的金花茶无菌苗转接至生根培养基进行生根培养。

以上步骤（1）所述的外植体为成熟的金花茶种子；所述的消毒灭菌方法为：剥掉金花茶种子种皮，先用体积浓度75%的酒精表面消毒30～60S，然后用体积浓度为5～10%的NaClO溶液消毒20～30min，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水进行冲洗，直到洗净为止。

以上步骤（4）所述的增殖扩繁获得健壮无菌苗在生根培养前，先将无菌苗基部浸泡于500～1000mg/L的IBA溶液中10～20min，再转接至生根培养基中。

以上步骤（1）所述的初代培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括6-BA 0.2～0.5mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8。

以上所述的继代增殖培养基以MS为基本培养基，还包括6-BA 1.5～2mg/L、KT 1.5～2mg/L、蔗糖40g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8。

以上步骤（3）所述的壮苗培养基是以MS为基本培养基，还包括IAA 0.5～1.0mg/L、40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH调整为5.8。经过一个月的培养后，增殖获得的无菌芽在壮苗培养基中长势良好，叶片浓绿有光泽，可用于再次增殖培养或者直接用于生根。

以上步骤（5）所述的生根培养基是以MW培养基为基本培养基，还包括蔗糖20g/L和琼脂7g/L，pH调整为5.8。

以上所述的无菌苗的获取、无菌芽的增殖、壮苗培养和生根培养的过程均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照16h/黑暗8h，光强2000-3000lx，温度25±2℃。

相比于现有技术，本发明具有的优点和积极效果如下：

1、本发明以金花茶种子为外植体，经过初代诱导产生无菌芽，然后将无菌芽切成顶芽和带芽茎段，使腋芽从顶端优势的抑制下释放出来，形成丛生芽；增殖培养和壮苗培养交替进行，可以克服组织培养过程中的无菌苗玻璃化问题，使得材料能够多次继代，实现大量增殖；通过本方法，无菌芽每6-8周可以增殖一次，且增殖系数始终保持在4左右，从而大大缩短了金花茶的育苗周期，节省了育苗材料，克服了传统金花茶育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

2、本发明在进行无菌苗增殖培养时，采用两种分裂素6-BA和KT同时使用的组合，增殖效果显著，繁殖系数高。据统计经过继代培养，一个芽最多可增殖获得12个无菌芽，平均增殖系数为4.6。

3、本发明无菌苗在MW培养基上生根良好，由于培养基内不含激素，所以无菌苗切口处不会产生愈伤组织，且根系发达，须根较多。根据统计结果可知，该方法的生根率高达95%～98%，移栽成活率达90%以上，最高可达95%，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。

附图说明

图1为本发明金花茶种子诱导生成的无菌芽。

图2为本发明由顶芽茎段增殖获得的无根芽丛。

图3为本发明带腋芽茎段增殖获得的无根芽丛。

图4为本发明壮苗培养后的金花茶无菌苗。

图5为本发明金花茶无菌苗在MW生根培养基中的生根情况。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但是不以任何方式限制本发明。

实施例1：

本方法所用到的基本培养基有MS和MW培养基。MS基本培养基配方：KNO₃ 1900mg/L，NH₄NO₃ 1650mg/L， CaCl₂·2H₂O 440mg/L ，MgSO₄·7H₂O 370mg/L， KH₂PO₄ 170mg/L， KI0.83mg/L， H₃BO₃ 6.2mg/L， MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L， ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L， Na₂Mo₄·H₂O0.025mg/L， CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L， CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L， FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂.EDTA·7H₂O 37.3mg/L，维生素B1 1mg/L,维生素B6 1mg/L,烟酸1mg/L，肌醇 20mg/L，甘氨酸 2mg/L，蔗糖 2-4％，琼脂 6-7g/L。MW培养基配方：除大量元素含量不一样之外，其他元素与MS培养基一样，大量元素含量如下：KNO₃80mg/L,Ca(NO₃)₂·4H₂O 150mg/L，MgSO₄·7H₂O 350mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 100 mg/L,KCl 65mg/L，Na₂SO₄200mg/L。

将2013年10月份采集的成熟普通金花茶种子作为外植体，剥掉种皮，接种前先用体积浓度75%的酒精表面消毒30S，然后用体积浓度10%的NaClO溶液消毒20min，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗，直到洗净为止。

将消毒完成的种子，于中间切开，将带种胚部分放入初代诱导培养基。初代诱导基本培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括6-BA 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导产生无菌芽。

将初代诱导产生的无菌芽，切成顶芽和带芽茎段分别接种在继代增殖培养基上。继代增殖培养基以MS为基本培养基，还包括6-BA 2mg/L、KT 1.5mg/L、蔗糖40g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导无菌芽增殖。该过程的继代周期为5～6周。

增殖培养后，根据无菌芽的具体生长状况，适时将增殖丛生芽单个切下转接至壮苗培养基中进行壮苗培养，促进丛生芽伸长增壮。壮芽培养基是以MS为基本培养基，还包括IAA 0.5mg/L、40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH调整为5.8。该过程的继代周期为5-6周。

将壮苗培养后的金花茶无菌苗再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再进行壮苗培养，循环往复，使得金花茶无菌芽进行重复循环增殖和伸长的过程，直至获得大量无菌苗。

选取健壮、高度4cm的金花茶无菌苗进行生根培养。先将无菌苗基部浸泡于500mg/L的IBA溶液中20min，而后转接于MW生根培养基中进行生根培养。生根培养基是以MW培养基为基本培养基，还包括蔗糖20g/L和琼脂7g/L，pH调整为5.8。

以上所述的无菌苗的获取、无菌芽的增殖、壮苗培养和生根培养的过程均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照16h/黑暗8h，光强2000-3000lx，温度25±2℃。该方法的生根率达98%，移栽成活率达95%。

实施例2：

本方法所用到的基本培养基MS和MW培养基与实施例1相同。

将2013年10月份采集的扶绥中东金花茶的成熟种子作为外植体，剥掉种皮，接种前先用体积浓度75%的酒精表面消毒40S，然后用体积浓度8%的NaClO溶液消毒25min，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗，直到洗净为止。

将消毒完成的种子，于中间切开，将带种胚部分放入初代诱导培养基。初代诱导基本培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括6-BA 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导产生无菌芽。

将初代诱导产生的无菌芽，切成顶芽和带芽茎段分别接种在继代增殖培养基上。继代增殖培养基以MS为基本培养基，还包括6-BA 2mg/L、KT 2mg/L、蔗糖40g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导无菌芽增殖。该过程的继代周期为5周。

增殖培养后，根据无菌芽的具体生长状况，适时将丛生芽单个切下转接至壮苗培养基中进行壮苗培养，促进无菌芽伸长增壮。壮芽培养基是以MS为基本培养基，还包括IAA1.0mg/L、40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH调整为5.8。该过程的继代周期为5周。

将壮苗培养后的扶绥中东金花茶无菌苗再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再进行壮苗培养，循环往复，使得扶绥中东金花茶无菌苗进行重复循环增殖和伸长的过程，直至获得大量无菌苗。

选取健壮、高度5cm的扶绥中东金花茶无菌苗进行生根培养。先将获得的无菌苗基部浸泡于800mg/L的IBA溶液中15min，而后转接于MW生根培养基中进行生根培养。生根培养基是以MW培养基为基本培养基，还包括蔗糖20g/L和琼脂7g/L，pH调整为5.8。

以上所述的无菌苗的获取、无菌芽的增殖、壮苗培养和生根培养的过程均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照16h/黑暗8h，光强2000-2500lx，温度25±2℃。该方法的生根率达97%，移栽成活率达93%。

实施例3：

本方法所用到的基本培养基MS和MW培养基与实施例1相同。

将2013年10月份采集的杂交金花茶种子作为外植体，剥掉种皮，接种前先用体积浓度75%的酒精表面消毒60S，然后用体积浓度5%的NaClO溶液消毒30min,最后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗，直到洗净为止。

将消毒完成的种子，于中间切开，将带种胚部分放入初代诱导培养基。初代诱导基本培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括6-BA 0.2mg/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导产生无菌芽。

将初代诱导产生的无菌芽，切成顶芽和带芽茎段分别接种在继代增殖培养基上。继代增殖培养基以MS为基本培养基，还包括6-BA 1.5mg/L、KT 2mg/L、蔗糖40g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8，诱导无菌芽增殖。该过程的继代周期为6周。

增殖培养后，根据无菌芽的具体生长状况，适时将丛生芽单个切下转接至壮苗培养基中进行壮苗培养，促进丛生芽伸长增壮。壮芽培养基是以MS为基本培养基，还包括IAA0.5mg/L、40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH调整为5.8。该过程的继代周期为6周。

将壮苗培养后的杂交金花茶无菌苗再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再进行壮苗培养，循环往复，使得杂交金花茶无菌苗的丛生芽进行重复循环增殖和伸长的过程，直至获得大量无菌苗。

选取健壮、高度6cm的杂交金花茶无菌苗进行生根培养。先将无菌苗基部浸泡于1000mg/L的IBA溶液中10min，而后转接于MW生根培养基中进行生根培养。生根培养基是以MW培养基为基本培养基，还包括蔗糖20g/L和琼脂7g/L，pH调整为5.8。

以上所述的无菌芽的获取、无菌芽的增殖、壮苗培养、和生根培养的过程均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照16h/黑暗8h，光强2000-3000lx，温度25±2℃。该方法的生根率达98%，移栽成活率达95%。

Claims

1.一种金花茶组培繁殖方法，其特征在于：包括无菌苗的获取、无菌苗的增殖、丛生芽壮芽培养、增殖扩繁和生根培养的工序，通过选取金花茶种子作为外植体后接种于初代培养基中获取金花茶无菌芽，再将无菌芽接种于继代增殖培养基和壮芽培养基中，重复循环增殖和壮苗的过程，直至获得大量丛生芽，最后转接至生根培养基中进行生根培养，具体操作步骤如下：

（1）无菌苗的获取：选取金花茶种子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌后，接种于初代培养基，以获得金花茶无菌苗；

所述的外植体为成熟的金花茶种子；所述的消毒灭菌方法为：剥掉金花茶种子种皮，先用体积浓度75%的酒精表面消毒30～60S，然后用体积浓度为5～10%的NaClO溶液消毒20～30min，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水进行冲洗，直到洗净为止；

所述的初代培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括6-BA 0.2～0.5mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8；

（2）无菌苗的增殖：将金花茶无菌芽切成顶芽和带芽茎段分别接种于继代增殖培养基上，诱导无菌芽增殖，获得丛生芽；

所述的继代增殖培养基以MS为基本培养基，还包括6-BA 1.5～2mg/L、KT 1.5～2mg/L、蔗糖40g/L和琼脂6g/L，pH调整为5.8；

（3）壮苗培养：将增殖获得的丛生芽单个切下转接至壮芽培养基中，促进无菌芽伸长增壮；

所述的壮芽培养基是以MS为基本培养基，还包括IAA 0.5～1.0mg/L、40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH调整为5.8；

（4）增殖扩繁：将步骤（3）的金花茶无菌苗再次接种于步骤（2）的继代增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（3），循环往复，使得无菌芽进行重复循环增殖和伸长的过程，直至获得大量无菌苗；步骤（2）和步骤（3）的继代周期均为5-6周；

（5）生根培养：选取健壮、高度为4-6cm的金花茶无菌苗转接至生根培养基进行生根培养；

所述的生根培养基是以MW培养基为基本培养基，还包括蔗糖20g/L和琼脂7g/L，pH调整为5.8。

2.根据权利要求1所述的一种金花茶组培繁殖方法，其特征在于：步骤（4）所述的增殖扩繁获得健壮无菌苗在生根培养前，先将无菌苗基部浸泡于500～1000mg/L的IBA溶液中10～20min，再转接至生根培养基中。

3.根据权利要求1所述的一种金花茶组培繁殖方法，其特征在于：所述的无菌苗的获取、无菌芽的增殖、壮苗培养和生根培养的过程均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照16h/黑暗8h，光强2000-3000lx，温度25±2℃。