CN114600772B - 一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法。本发明选择合子胚作为外植体，与目前报道的胚轴、茎段、顶芽等外植体相比更加容易消毒成功，污染率低，且褐化可控；另外，本发明通过胚胎发生途径繁殖深山含笑组培苗，解决了器官发生途径和无性繁殖途径需要对外植体进行生根培养来获得完整植株的问题，避免了由于生根率低和生根部位褐化严重，导致效率不高的情况。本发明提供的方法不受环境因素影响，深山含笑胚性组织能直接生成的是体细胞胚，跳过了正常种子的开花、受精、受精卵发育为成熟的合子胚、形成种子的过程，缩短成苗的周期，同时也缩短了育苗周期，繁殖不受气候条件影响，能够长期进行增殖和分化。

Description

一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法。
背景技术
深山含笑(Michelia maudiae Dunn)是木兰科(Magnoliaceae)含笑属(Michelia)常绿乔木。深山含笑是我国特有的珍贵树种，主产于浙江、福建、湖南、广东、广西、贵州等地。深山含笑树姿优美，花大洁白色芬芳，观赏价值高，为优良的园林绿化树种。花叶可提取香料，木材可用作建筑、装饰材料，用途十分广泛。
胚胎发生是实现深山含笑快速繁殖的理想途径。繁殖能力强不受季节条件限制，体细胞胚可以快速、大量的发育为深山含笑植株，缩短成苗周期。
目前深山含笑的组织培养采用的大多数是种子萌发的胚轴、茎段、植株的茎段、顶芽、侧芽等。这些外植体不仅消毒困难，容易褐化；而且这些外植体虽然都能成功诱导愈伤组织或重生芽，也能再生植株，但想要快速、规模化的生产，还需要一些技术手段。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法。本发明提供的方法将胚性愈伤组织转化为体细胞胚、体细胞胚转化为植株的效率极高，可以快速、规模化的生产深山含笑组培苗。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种深山含笑的组培方法，包括以下步骤：
将深山含笑合子胚进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；
所述诱导培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D1～4mg/L、6-BA 0～1mg/L、PVP 1～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述诱导培养的培养基的pH为4～7；
将所述胚性愈伤组织进行纯化培养和继代增殖培养，得胚性细胞系；
所述纯化培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D 1～4mg/L、6-BA0～0.5mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；
所述继代增殖培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D1～4mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；
所述纯化培养和继代增殖培养的培养基的pH分别为4～7；
将所述胚性细胞系中的胚性细胞团进行分化培养，得体细胞胚；所述分化培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：活性炭0.5～3g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述分化培养的培养基的pH为4～7；
将所述体细胞胚进行萌发培养和生长培养，得组培苗。
优选的，所述萌发培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：活性炭0.5～3g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述萌发培养的培养基的pH为4～7。
优选的，所述生长培养的培养基包括WPM培养基。
优选的，所述萌发培养和组织培养的条件分别包括：温度为22～28℃，光周期为12～16h/8～12h，湿度为40～60％，光照强度为50～80μmol m-2s-1。
优选的，所述深山含笑合子胚的制备方法包括：将深山含笑种子切开，得到深山含笑合子胚；
所述深山含笑种子包括成熟果实的种子和/或未成熟果实的种子。
优选的，所述诱导培养的条件包括：暗培养，温度为22～28℃，湿度为40～60％。
优选的，所述纯化培养和继代增殖培养的条件分别包括：暗培养，温度为22～28℃，湿度为40～60％。
优选的，所述分化培养的条件包括：暗培养，温度为22～28℃，时间为14～42天，湿度为40～60％。
本发明还提供了一种快速繁殖深山含笑的方法，包括：采用上述组培方法得到组培苗；将所述组培苗进行移栽培养，得深山含笑苗。
优选的，所述移栽时所用栽培基质包括腐殖土和草炭；所述栽培基质中腐殖土和草炭的体积比为1:1～3。
有益效果：
本发明提供了一种深山含笑的组培方法，包括以下步骤：
将深山含笑合子胚进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；所述诱导培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1～4mg/L、6-BA0～1mg/L、PVP 1～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述诱导培养的培养基的pH为4～7；将所述胚性愈伤组织进行纯化培养和继代增殖培养，得胚性细胞系；所述纯化培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D 1～4mg/L、6-BA 0～0.5mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述继代增殖培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D 1～4mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述纯化和继代增殖培养的培养基的pH分别为4～7；将所述胚性细胞系中的胚性细胞团进行分化培养，得体细胞胚；所述分化培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：活性炭0.5～3g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；所述分化培养的培养基的pH为4～7；将所述体细胞胚进行萌发培养和生长培养，得组培苗。
本发明选择合子胚作为外植体，与目前报道的胚轴、茎段、顶芽等外植体相比更加容易消毒成功，污染率低，且褐化可控；另外，本发明通过胚胎发生途径繁殖深山含笑组培苗，解决了器官发生途径和无性繁殖途径需要对外植体进行生根培养(即深山含笑的合子胚有能够直接发育成为完成的植株的能力，根自己就能分化出来)来获得完整植株的问题，避免了由于生根率低和生根部位褐化严重，导致效率不高的情况。
另外的，本发明提供的方法不受环境因素影响，深山含笑胚性组织能直接生成的是体细胞胚，跳过了正常种子的开花、受精、受精卵发育为成熟的合子胚、形成种子的过程，缩短成苗的周期，同时也缩短了育苗周期，繁殖不受气候条件影响，能够长期进行增殖和分化。
并且本发明提供的方法将胚性愈伤组织转化为体细胞胚、体细胞胚转化为植株的效率极高，可以进行规模化、批量化的深山含笑组培苗生产。本发明的相比现有报道的深山含笑组培技术，具有高效、快速，成苗率高和技术实用性高的技术特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为深山含笑去皮种子的获取过程；a深山含笑聚合果，b深山含笑蓇葖果裂开露出红色种子，c深山含笑带红色种皮的种子，d深山含笑去掉红色种皮的种子；
图2为深山含笑的合子胚；
图3为深山含笑胚性愈伤组织诱导和纯化过程；b胚刚诱导出的深山含笑胚性伤组织，c纯化的深山含笑胚性愈伤组织；
图4为深山含笑胚性愈伤组织的分化过程；a深山含笑纯化后的胚性愈伤组织，b胚性愈伤组织分化出体细胞胚，c深山含笑体细胞胚，d体细胞胚发育成的深山含笑苗；
图5为深山含笑体细胞胚的成苗驯化移栽过程；a深山含笑体细胞胚，b体细胞胚发育的深山含笑苗，c 32孔穴深山含笑苗，d 16×16cm 1年生深山含笑袋苗；
图6为实施例2中的组培苗移植成活率结果。
具体实施方式
本发明提供了一种深山含笑的组培方法，包括以下步骤：
将深山含笑合子胚进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；
将所述胚性愈伤组织进行纯化培养和继代增殖培养，得胚性细胞系；
将所述胚性细胞系中的胚性细胞团进行分化培养，得体细胞胚；
将所述体细胞胚进行萌发培养和生长培养，得组培苗。
如无特殊说明本发明对所述组培方法中所用到的培养基各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述深山含笑合子胚的制备方法优选包括：将深山含笑种子消毒后切开，得到深山含笑合子胚；所述深山含笑种子优选包括成熟果实的种子和/或未成熟果实的种子，更优选为成熟的种子。调控体细胞的胚胎发生过程的基因在未成熟种子中的胚中表达高于在成熟种子胚中的表达，但是适合诱导体细胞胚的未成熟种子的窗口期特别短，本发明选择成熟果实的种子不仅解决了未成熟种子的窗口期短的问题，而且种子容易消毒，污染率少；另外，将成熟种子中的合子胚作为外植体并结合适宜的培养基及培养条件使胚性愈伤组织转化为体细胞胚、体细胞胚转化为植株的效率也极高。
在本发明中，所述消毒前优选包括对种子进行清洗；所述清洗的方式优选包括将种子用纱布包裹，放置在不锈钢筛网上搓掉外种皮，并用自来水冲洗干净(流水冲洗30min)。在本发明中，所述消毒优选包括第一消毒处理、第二消毒处理和第三消毒处理；所述第一处理的方式优选为将种子浸泡在NaDCC(Sodium Dichloroisocyanurate，二氯异氰尿酸钠溶液)中；所述NaDCC的质量浓度优选为1～5g/L，更优选为1g/L；所述浸泡的时间优选为20～28h，更优选为24h；所述第二处理的方式优选为将第一消毒处后的种子置于酒精中浸泡；所述酒精的体积的百分含量优选为70～75％，更优选为75％；所述浸泡的时间优选为0～10min，更优选为5min；所述第三处理的方式优选为将第二消毒处后的种子置于NaDCC溶液中；所述NaDCC的质量浓度优选为3～6g/L，更优选为5g/L；所述浸泡的时间优选为5～30min，更优选为25min。本发明优选将第三消毒处理后的种子采用无菌水冲洗；所述无菌水的冲洗次数优选为1～5次，更优选为3次。在本发明中，采用这种灭菌方式能够给使得消毒更加充分，减少外植体污染的目的，降低外植体污染率低，对外植体伤害小，达到提高材料成活率的效果。
得消毒处理种子后，本发明优选将所述消毒处理的种子切开，剥取深山含笑合子胚。在本发明中，所述切开的工具优选为镊子和手术刀；所述切开优选在解剖镜下进行。
得到深山含笑合子胚后，本发明将深山含笑合子胚进行诱导培养，得到胚性愈伤组织。在本发明中，所述诱导培养的培养基以WPM培养基(木本植物培养基)为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1～4mg/L、6-BA 0～1mg/L、PVP 1～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；优选包括以下含量组分：2,4-D 2mg/L、6-BA 0.25mg/L、PVP1g/L、CH 1g/L、蔗糖40g/L和植物凝胶3g/L；所述诱导培养的培养基的pH为4～7，更优选为5.7～5.8；在本发明中，所述WPM培养基优选包括以下组分：NH4N03400mg/L、Ca(NO3)2·4H2O556mg/L、K2SO4990 mg/L、CaCl2·2H2O 96mg/L、KH2PO4170mg/L、H3BO36.2mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、MnSO4·H2O 22.4mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、CuSO4·5H2O0.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇100mg/L、维生素B11.0mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B60.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述WPM培养基的pH优选为5.7。在本发明中，所述2,4-D优选为2,4-Dichlorophenoxyacetic acid；所述6-BA优选为N-6-Benzyladenine；所述PVP优选为Polyvinylpyrrolidone；所述CH优选为Caseinhydrolysate；所述植物凝胶优选为Phytagel。在本发明提供的诱导培养的培养基中，2,4-D和6-BA为诱导胚性愈伤组织的植物生长调节激素，PVP抑制诱导过程中的褐化发生，CH调节植物渗透压和为植物提供营养物质，蔗糖为植物提供碳源，植物凝胶将培养液固化。
在本发明中，所述诱导培养的方式优选为暗培养；所述诱导培养的温度优选为恒温22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述诱导培养的湿度优选为40～60％，更优选为40～50％。在本发明中，所述诱导培养优选在密闭的培养皿中进行；所述培养皿优选为直径9cm的培养皿；所述诱导培养的培养基的用量优选为20～30ml，更优选为25ml；所述诱导培养的湿度优选为培养皿放置外界诱导培养时，密闭的培养皿中的湿度。本发明优选将外植体每隔14～42天转到新的诱导培养的培养基，直至诱导出胚性愈伤组织，更优选为30天。
得到胚性愈伤组织后，本发明将所述胚性愈伤组织进行纯化培养和继代增殖培养，得胚性细胞系。
在本发明中，所述纯化培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D 1～4mg/L、6-BA 0～0.5mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；优选包括以下组分：2,4-D 1mg/L、6-BA0.5mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述纯化培养的培养基的pH为4～7，优选为5.7～5.8；所述继代增殖培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：2,4-D 1～4mg/L、活性炭0.5～3g/L、PVP 0～3g/L、CH 0.5～2g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L；优选包括以下组分：2,4-D 2mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述继代增殖培养的培养基的pH为4～7，优选为5.7～5.8。
在本发明中，所述纯化培养和继代增殖培养优选在密闭的培养皿中进行；所述培养皿优选为直径9cm的培养皿；所述纯化培养的培养基和继代增殖培养的培养基的用量优选分别为20～30ml，更优选为25ml；所述纯化培养的湿度和继代增殖培养的湿度优选为培养皿放置外界纯化培养和继代增殖培养时，密闭的培养皿中的湿度。在本发明中，所述胚性细胞团优选为生长良好、未分化、未褐化的胚性细胞团；所述纯化培养的方式优选为暗培养；所述纯化培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述纯化培养的湿度优选为40～60％，更优选为40～50％；所述纯化的周期优选为1～3周，更优选为2周；所述继代增殖培养的方式优选为暗培养；所述继代增殖培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述继代增殖培养的湿度为40～60％，更优选为40～50％；所述继代增殖培养优选为每1～4周继代培养1次，更优选为3周；所述继代增殖培养时优选挑选生长良好、未分化、为褐化的胚性细胞团。本发明通过3轮纯化培养挑选，可以获得生长旺盛、状态良好的胚性细胞系。再将纯化好的胚性愈伤组织在继代培养基上进行增殖培养。胚性细胞系两周可增殖约1倍，继代培养可以获得大量的胚性细胞系。在本发明特定的出花培养和增殖培养条件的设定能够得到繁殖能力强，生长状态一致胚性细胞，纯化培养提高胚性愈伤组织的质量，利于胚性愈伤组织的增殖扩繁和分化体细胞胚。
得胚性细胞系后，本发明将所述胚性细胞系中的胚性细胞团进行分化培养，得体细胞胚。本发明中，所述分化培养的方法优选为将继代培养得到的胚性细胞团置于分化培养基培养，得到体细胞胚；所述分化培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：活性炭0.5～3g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L，更优选包括以下组分：活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述分化培养的培养基的pH为4～7，更优选为5.7～5.8；在本发明中，所述分化培养时优选挑选继代培养1～4周得到的细胞团，更优选为2周；所述分化培养的方式优选为暗培养；所述分化培养的温度优选为恒温22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述分化培养的湿度优选为40～60％，更优选为40～50％。在本发明中，所述分化培养优选在密闭的培养皿中进行；所述培养皿优选为直径9cm的培养皿；所述分化培养基的用量优选为20～30ml，更优选为25ml；所述分化培养的湿度优选为培养皿放置外界分化培养时，密闭的培养皿中的湿度。本发明经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚。本发明通过分化培养中体细胞胚胎途径能快速、高效的繁殖深山含笑组培苗。本发明将深山含笑胚性愈伤组织转到未添加植物生长调节激素的培养基上，能够使胚性细胞不再扩繁而是大量自行分化出体细胞胚，胚性愈伤组织分化速度快，0.1g/团的胚性愈伤组织可分化出5～10个体细胞胚。
得体细胞胚后，本发明将所述体细胞胚进行萌发培养和生长培养，得组培苗。
在本发明中，所述萌发培养的方法优选为将体细胞胚置于萌发培养基培养，得萌发体细胞胚；所述萌发培养基，以WPM培养基为基本培养基，还包括以下组分：活性炭0.5～3g/L、蔗糖20～50g/L和植物凝胶3～4g/L，更优选包括以下组分：活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述分化培养的培养基的pH为4～7，更优选为5.7～5.8。
在本发明中，所述萌发培养优选挑选子叶胚阶段的成熟体细胞胚；所述挑选优选在体视显微镜下进行。在本发明中，所述萌发培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述萌发培养的光周期优选为12～16h/8～12h，即12～16h的光照时间、8～12h的黑暗时间，更优选为16/8h；所述萌发培养的光照强度优选为50～80μmol m- 2s-1，更优选为60μmol m-2s-1；所述萌发培养的湿度优选为40～60％，更优选为50～60％。
在本发明中，所述萌发培养优选在密闭的培养皿中进行；所述培养皿优选为直径9cm的培养皿；所述萌发培养基的用量优选为20～30ml，更优选为25ml；所述萌发培养的湿度优选为培养皿放置外界萌发培养时，密闭的培养皿中的湿度。在本发明中，所述组织培养的方法优选为将萌发体细胞胚置于装有WPM培养基的组培瓶中继续培养，得组培苗。
在本发明中，所述生长培养优选挑选体细胞正处于胚根伸出，子叶展开时的体细胞胚；所述WPM培养基的用量优选为30～100ml，更优选为50ml；所述组培瓶的规格优选为250ml；所述组织培养的方式优选为光照培养；所述组织培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为23～27℃，更优选为25℃；所述生长培养的湿度优选为40～60％，更优选为50～60％。
本发明还提供了一种快速繁殖深山含笑的方法，包括：采用上述技术方案所述组培方法得到组培苗；将所述组培苗进行移栽培养，得深山含笑苗。在本发明中，所述移栽培养前优选还包括将组培苗上的植物凝胶在自来水下清洗干净。在本发明中，所述组培苗的挑选标准优选为根长度＞5cm、须根数量＞2条的组培苗。在本发明中，所述移栽时所用栽培基质包括腐殖土和草炭；所述栽培基质中腐殖土和草炭的体积比优选为1:1～3，更优选为1：1；所述栽培基质的灭菌方式优选为高温湿热灭菌；所述灭菌优选在灭菌锅中进行；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为15～25min，更优选为20min。
在本发明中，所述移栽培养优选包括育苗盘培养和育苗袋培养；所述育苗盘培养的方式优选为将冲洗干净的组培苗置于装有栽培基质的育苗盘中盖上盖子培养，得驯化苗；所述育苗盘的规格优选为80mm×560mm的32孔；所述育苗盘培养优选在玻璃温室中进行；所述育苗盘培养的温度优选为20～30℃，更优选为25℃±2℃；所述育苗盘培养的光周期优选为自然光照；所述育苗盘培养的时间优选为2～5周，更优选为3周；在本发明中，所述育苗袋培养优选为将长有3片以上新叶的驯化苗转入装有栽培基质的育苗袋中进行培养，更优选为4片；所述育苗袋的规格优选为16×16cm；所述育苗袋培养优选在玻璃温室中进行；所述育苗袋培养的温度优选为20～28℃，更优选为25±2℃；所述育苗袋培养的光周期优选为自然光照；所述育苗袋培养的时间优选为2～4月，更有选为3月。采用本发明提供的移栽培养可以提高深山含笑组培苗的移栽成活率，成活率可达90％以上。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种深山含笑的组培方法，由以下步骤组成：
1)深山含笑种子的获取
在7月份，从深山含笑健壮植株上，采集红色的成熟深山含笑果实，剥开果实取出种子。用纱布包裹种子，放置在不锈钢筛网上搓掉红色外种皮，并用自来水冲洗干净(流水冲洗30min)。
2)深山含笑种子的表面消毒
将步骤1清洗后的种子浸泡在NaDCC溶液(1g/L)中处理2h。处理结束后，转入超净工作台内，将60粒种子用镊子转到灭菌的250ml组培瓶中，加入50ml75％(v/v)酒精处理5min。处理结束时倒掉酒精，加入100ml的5g/LNaDCC溶液，处理25min，处理中需要晃动三角瓶。处理结束时，倒掉NaDCC溶液，用无菌水清洗三次，每次100ml蒸馏水，每次3min。清洗完毕，将种子放置于9cm玻璃培养皿中用无菌滤纸吸干种子表面水分。
3)深山含笑合子胚的剥取
在体视显微镜下，用镊子和手术刀切开深山含笑种子的种皮。用手术刀小心的切开胚乳的顶端，可看见合子胚深陷于胚乳中，用手术刀将合子胚切出。获取过程图如图1和图2所述。
4)合子胚诱导胚性愈伤组织
将剥取的深山含笑合子胚接种于诱导培养基上培养。所述诱导培养基以WPM培养基(木本植物培养基)为基本培养基，还只含有以下含量组分：2,4-D2mg/L、6-BA 0.25mg/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖40g/L和植物凝胶3g/L；所述诱导培养的培养基的pH为5.8。培养条件为25℃恒温暗培养。将外植体每隔1个月转到新的诱导培养基上，直至诱导出深山含笑胚性愈伤组织。诱导过程如图3所示。
5)深山含笑胚性愈伤组织的纯化和增殖
刚诱导出的胚性愈伤组织，分化能力较强，但通常与非胚性愈伤组织混杂在一起，并且容易褐化。
在体视显微镜下选择淡黄色(呈颗粒状，松散且质地较硬的细胞团)、生长良好、未分化和未褐化的胚性细胞团转入纯化培养基培养，每2周纯化一次；所述纯化培养基以WPM培养基为基本培养基，还只含有以下组分：2,4-D 1mg/L、6-BA0.5mg/L、活性炭1g/L、PVP1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述纯化培养的培养基的pH为5.8；
每个培养皿中，纯化培养基的用量为25ml，湿度为45％。通过3轮的纯化培养挑选，可以得到生长旺盛，状态良好的深山含笑胚性细胞系；
将深山含笑胚性细胞系转到继代增殖培养基上进行扩繁，3周继代一次，10团/皿，每一皿胚性细胞经过两周增殖可以继代2皿。所述继代增殖培养基，以WPM培养基为基本培养基，还只含有以下组分：2,4-D 2mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述继代增殖培养的培养基的pH为5.8，每个培养皿中，继代增殖培养基的用量为25ml，湿度为45％，深山含笑胚性细胞系纯化与分化过程如图4所示，图4表现了整个分化、萌发、成苗的过程，采用本发明提供的方式很少的胚性细胞就能产生大量的体细胞胚，而且体细胞胚能转化为完整的植株。
6)深山含笑胚性愈伤组织分化体细胞胚，与体细胞胚分化为植株
将继代培养2周的深山含笑胚性细胞团转入体细胞胚分化培养基上进行分化培养。所述分化培养基，以WPM培养基为基本培养基，还只含有以下组分：活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述分化培养基的pH为5.8。培养条件为恒温25℃暗培养。经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚。
7)深山含笑组培苗的形成
在体细胞胚根伸出，子叶发育展开时，转入装有50ml WPM基础培养基的250ml组培瓶中上继续培养。经过2个月的培养可以得到具有良好根系的深山含笑组培苗。
实施例2
一种快速繁殖深山含笑的方法，由以下步骤组成：
将实施例1培育的生根(根长度＞5cm、须根数量＞2条的组培苗)的深山含笑组培苗从组培瓶中取出。用自来水将附着在组培苗上的植物凝胶清洗干净，转入栽培基质中。栽培基质为腐殖土和草炭以1：1的体积比混合，并于灭菌锅中121℃高温湿热灭菌20min。灭菌后的栽培基质装入到规格为80mm×560mm的32孔育苗盘中。在玻璃温室中，温度25℃，自然光照条件下，将组培苗移栽到穴盘中，盖上盖子保持相对湿度75％以上，培养3周后揭掉盖子，直至长出4片新叶。将4片新叶的驯化苗转入装有栽培基质的16×16cm育苗袋中，25±2℃，露天培养，每周浇水一次，6个月后，得到株高15～30cm深山含笑苗。深山含笑组培苗的移栽驯化如图5所示。
由图5可知，可见采用本发明提供的方式能够成功将红花木莲组培苗的移栽驯化，并且具有移植成活率稿、体细胞形成的苗无变异、成苗率高的优势。
实施例3
一种与实施例1相似的组培方法，唯一区别在于，深山含笑种子为未成熟的种子。
实施例4
一种与实施例1相似的组培方法，唯一区别在于，所述纯化培养基以WPM培养基为基本培养基，还只含有以下组分：2,4-D 2mg/L、6-BA 0.25mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH1g/L、蔗糖40g/L和植物凝胶3g/L；所述纯化培养的培养基的pH为5.7～5.8；所述继代增殖培养基中2,4-D 1mg/L。
对比例1
一种与实施例1相似的组培方法，唯一区别在于，将深山含笑替换为馨香木兰，做4次实验，每次300个外植体，均未诱导出胚性愈伤组织，诱导率为0。
对比例2
一种与实施例1相似的组培方法，唯一区别在于，将深山含笑替换为峨眉含笑，每次用60个合子胚做外植体，三次共用外植体实验180个，诱导率为0。
应用例1
测定实施例1中步骤7)培养后的生根率，挑选的体细胞胚转入组培瓶中培养的生根率为100％，组培苗测试超1000株，暂未发现不能生根的组培苗。
测定实施例2中组培苗移植成活率，1次96株，3盘育苗盘，每次重复中统计三盘成活率的标准差，重复三次实验，均值为三次重复288株组培苗9盘育苗盘成活率的均值和标准差。结果见图6。
由图6可知，采用本发明提供的移栽培养可以提高深山含笑组培苗的移栽成活率，成活率可达90％以上。
育苗周期：本发明提供的方法由合子胚分化为体细胞胚为1月，体细胞胚转化为组培苗为3月，移植后6月株高约15～30cm；比起种子育苗，需要开花，受精，到种子成熟，到第二年萌发，约缩短半年的时间。
由实施例1、对比例1和对比例2的结果可知，本发明提供的方法可以有效将深山含笑合子胚诱导出胚性愈伤组织，但对于同为木兰科的馨香木兰和木兰科含笑属峨眉含笑诱导率为0。
另外，本发明提供的方法生根率达到100％，且组培苗移栽后的成活率可达90％以上。
综上所述，发明提供的方法将胚性愈伤组织转化为体细胞胚、体细胞胚转化为植株的效率极高，可以进行规模化、批量化的深山含笑组培苗生产。本发明的相比现有报道的深山含笑组培技术，具有高效、快速，成苗率高和技术实用性高的技术特点。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种深山含笑的组培方法，其特征在于，包括以下步骤：
将深山含笑合子胚进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；所述深山含笑合子胚的制备方法包括：将深山含笑种子切开，得到深山含笑合子胚；
所述深山含笑种子为成熟果实的种子；
所述诱导培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还仅含有以下含量组分：2,4-D2mg/L、6-BA 0.25mg/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖40g/L和植物凝胶3g/L；所述诱导培养的培养基的pH为5.7~5.8；
将所述胚性愈伤组织进行纯化培养和继代增殖培养，得胚性细胞系；
所述纯化培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还仅含有以下组分：2,4-D 1mg/L、6-BA 0.5mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；
所述继代增殖培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还仅含有以下组分：2,4-D2mg/L、活性炭1g/L、PVP 1g/L、CH 1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；
所述纯化培养和继代增殖培养的培养基的pH分别为5.7~5.8；
将所述胚性细胞系中的胚性细胞团进行分化培养，得体细胞胚；所述分化培养的培养基，以WPM培养基为基本培养基，还仅含有以下组分：活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述分化培养的培养基的pH为5.7~5.8；
将所述体细胞胚进行萌发培养和生长培养，得组培苗；所述萌发培养的培养基以WPM培养基为基本培养基，还仅含有以下组分：活性炭1g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L；所述萌发培养的培养基的pH为5.7~5.8；所述生长培养的培养基为WPM培养基。
2.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于，所述萌发培养的条件包括：温度为22~28℃，光周期为12~16h/8~12h，湿度为40~60%，光照强度为50~80μmol m-2s-1。
3.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于，所述诱导培养的条件包括：暗培养，温度为22~28℃，湿度为40~60%。
4.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于，所述纯化培养和继代增殖培养的条件分别包括：暗培养，温度为22~28℃，湿度为40~60%。
5.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于，所述分化培养的条件包括：暗培养，温度为22~28℃，时间为14~42天，湿度为40~60%。
6.一种快速繁殖深山含笑的方法，其特征在于，包括：采用权利要求1~5任一项所述组培方法得到组培苗；将所述组培苗进行移栽培养，得深山含笑苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述移栽时所用栽培基质包括腐殖土和草炭；所述栽培基质中腐殖土和草炭的体积比为1:1~3。
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