CN111194695A - 一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)取美洲黑杨鲁林1号的枝条进行水培，以萌发的新茎段作为外植体，接种于茎段不定芽诱导培养基中；(2)待外植体长出不定芽后，将其接种至不定芽继代增殖培养基中，诱导不定芽的继代增殖；(3)以不定芽继代增殖所产生的不定芽叶片为材料，接种到叶片再生不定芽培养基中，进行不定芽的诱导；(4)待不定芽长到2.5‑3.5cm时，接种至生根培养基中；(5)将生根苗进行炼苗、移栽。利用本发明的方法繁殖美洲黑杨鲁林1号，可以降低污染率，提高美洲黑杨的生物产量，并且具有很强的工厂化生产能力，可在短时间内为美洲黑杨鲁林1号的遗传转化实验提供大量优质的实验材料。
Description
技术领域
本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体涉及一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法。
背景技术
黑杨是杨属五大派之一，树高可达30m。椭圆形宽阔树冠。小枝近圆形，淡黄色。树皮呈现暗灰色，老时有沟裂。树叶有菱形、菱状卵圆形或者三角形，先端渐尖，基部楔形或阔楔形，少有截形，叶缘具有圆锯齿，无缘毛，叶柄近等于或稍长于叶片，侧扁，无毛。雄花序长约5-6cm，淡褐色苞片膜质，顶端有线条状的尖锐裂片，花药紫红色，子房卵圆形。硕果卵圆形，花期4-5月，果期6月。
黑杨抗寒，喜光，但对干旱和盐碱的耐受程度不高，能在冲积沙质土上生长良好。黑杨木材常用于制作家具和建筑；树皮可提取单宁，并可作黄色染料；芽可药用。黑杨也是杨树育种的优良亲本之一。
鲁林1号(PopulusבLulin-1’)是山东省林业科学研究院姜岳忠等历时十余年，从美洲黑杨228-379优树上采集天然杂交种子选育而成，是以欧美杨107作为对照选育出的高产优质胶合板材和纸浆材新品种，为雌株。鲁林1号的一年生苗茎秆通直，茎表面有棱角和浅凹槽，未木质化的茎无毛，茎的中上部有较密的分布不均匀的圆形或者椭圆形的皮孔，有少量分枝。叶芽呈现锥形，长0.6-0.7cm，褐色，贴近茎干。叶三角形，叶长与叶宽基本相等，叶基截形，叶端宽尖，腺体多为2个。大树干形圆满通直，树皮光滑，尖削度小，顶端优势明显，树冠阔卵形，分枝数量多，分布均匀，侧枝较细，冠幅较宽，叶小，数量多。
鲁林1号已通过山东省林木新品种审定和国家林木新品种保护权审查。经过在鲁南、鲁中、鲁西和胶东西南部等地区引种示范，表现出适应性强、速生、易成活、抗病虫和干形优等优良性状，在鲁南、鲁中、鲁西和胶东西南部等地区生长良好，在比较干旱的造林地上也能适应，可望成为山东省杨树速生丰产林的首选品种。
杨树扦插繁殖具有成苗周期长、受季节的影响大和生长条件不宜控制等缺点，在短时间内难以繁殖出生长状态统一的苗木。而组织培养作为一种快速繁殖技术，可以有效解决这些问题，短时间内能繁殖大量优良树种。尽管杨树的组织培养技术日趋成熟，但杨树组织培养效果的提高仍然受多个因子的影响。
美洲黑杨鲁林1号，作为北方地区主栽的速生杨树品种之一，目前还未有关于建立其组织培养快速繁殖体系的报道。与其他杨树品种相比，在进行组织培养时对于各个阶段的培养基，激素比例以及激素的浓度而言存在较大差异，需要在实验过程中作出必要的调整，通过对各个因子的优化，才能获得最佳的培养效果。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法。利用本发明的方法繁殖美洲黑杨鲁林1号，可以提高美洲黑杨鲁林1号的生物产量。在短时间内为美洲黑杨鲁林1号的遗传转化实验提供大量优质的实验材料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)取美洲黑杨鲁林1号的枝条进行水培，得到萌发的新茎段；以萌发的新茎段作为外植体，对外植体进行消毒处理；将消毒处理后的外植体接种于茎段不定芽诱导培养基中，培养诱导茎段不定芽分化；
所述茎段不定芽诱导培养基为MS+6-BA0.3-0.7mg/L+NAA0.02-0.1mg/L+GA30.3mg/L；
(2)待外植体长出不定芽后，将不定芽接种至不定芽继代增殖培养基中，诱导不定芽的继代增殖；
所述不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA0.2-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+GA30.5mg/L；
(3)待步骤(2)中的不定芽生长到2.0-3.0cm时，取叶片面积为1.5-2.0cm2的不定芽叶片为材料，接种到叶片再生不定芽培养基中，进行不定芽的诱导；
所述叶片再生不定芽培养基为MS+6-BA0.2-0.3mg/L+NAA0.05-0.10mg/L+GA31.0mg/L；
(5)将步骤(2)中生长到2.0-3.0cm不定芽及步骤(3)中叶片诱导产生的生长到2.5-3.5cm的不定芽分别接种至生根培养基中，进行不定根诱导；
所述生根培养基为1/2MS+IBA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L；
(5)将步骤(4)获得的生根苗进行炼苗、移栽。
优选的，步骤(1)中，所述水培的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
优选的，步骤(1)中，外植体的消毒处理方法为：将外植体先用肥皂水漂洗15-20min,，然后冲洗干净；再用75％的酒精表面消毒30s，无菌水冲洗后，再用质量百分数为1％的升汞消毒9min，无菌水冲洗干净。
优选的，步骤(1)中，培养诱导茎段不定芽分化的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
优选的，步骤(2)中，诱导不定芽的继代增殖的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
优选的，步骤(3)中，不定芽的诱导条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
优选的，步骤(4)中，不定根诱导的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为14h。
优选的，步骤(5)中，所述炼苗、移栽具体为：将步骤(4)获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中；栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒；移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20-28℃，相对湿度为70-100％；最后除去无纺布保湿，进行正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，移栽到室外大田里。
本发明的有益效果：
本发明以美洲黑杨鲁林1号嫩茎段及诱导产生的不定芽的叶片为外植体，利用其专用培养基，成功地建立了一个有效的美洲黑杨鲁林1号离体培养再生体系，为木本植物大量组织培养快速繁殖提供了一个可参照的技术和方法。本发明方法具有以下优点：取材容易、变异率低、增殖倍数高的优点，培养4周增殖倍数达到10-12倍，组培苗生根率达到95％以上，炼苗成活率达到98％。利用本发明方法繁殖美洲黑杨鲁林1号，可以提高美洲黑杨的生物产量，具有很强的工厂化生产能力，同时为实现美洲黑杨鲁林1号的遗传转化实验提供了技术支撑为杨树基因工程的发展奠定了基础。
附图说明
图1：美洲黑杨鲁林1号茎段诱导不定芽产生。
图2：美洲黑杨鲁林1号不定芽继代增殖。
图3：美洲黑杨鲁林1号瓶苗叶片分化。
图4：美洲黑杨鲁林1号不定芽生根；其中，左图为不定芽在培养基中的照片；右图为将不定芽从培养基中取出洗净后的照片。
图5：美洲黑杨鲁林1号移栽苗。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，尽管杨树的组织培养技术日趋成熟，但杨树组织培养效果的提高仍然受多个因子的影响。
美洲黑杨鲁林1号作为北方地区优良速生的林木新品种之一，目前对于美洲黑杨鲁林1号的组培研究相对较少，为实现美洲黑杨鲁林1号的快速繁殖，以及为实现美洲黑杨鲁林1号的遗传转化实验提供技术支撑，本发明建立了美洲黑杨鲁林1号的离体培养再生体系，有效提高了美洲黑杨鲁林1号的生物产量，为杨树基因工程在杨树品种选育中的应用奠定了基础。
在本发明的一个实施方案中，所给出的美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法，包括如下步骤：
步骤1、将美洲黑杨鲁林1号的冬枝在温室内进行水培，得到萌发的新茎段；以萌发幼嫩茎段为外植体，在添加6-BA的浓度为0.3-0.7毫克/升、NAA的浓度为0.02-0.1毫克/升、GA3为0.3毫克/升的MS培养基中培养30天左右，以诱导茎段不定芽分化。
步骤2、待外植体长出不定芽后，将不定芽转接到不定芽继代增殖培养基中诱导不定芽的继代增殖。所述不定芽继代增殖培养基为以MS为基本培养基，添加6-BA浓度为0.2-0.3毫克/升，NAA浓度为0.05-0.15毫克/升，GA3为0.5毫克/升。
步骤3、待继代增殖的不定芽生长到2.0-3.0cm时，选取叶面积达到1.5-2.0cm2的叶片，以不定芽叶片为材料，在叶片再生不定芽培养基进行不定芽的诱导。所述叶片再生不定芽培养基为在MS培养基中添加NAA的浓度为0.05-0.1毫克/升、6-BA的浓度为0.2-0.3毫克/升、GA3的浓度为1.0毫克/升。
步骤4、将步骤(2)中生长到2.0-3.0cm不定芽及步骤(3)中叶片诱导产生的，生长到2.5-3.5cm的不定芽分别接种至生根培养基中，进行不定根诱导；所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加NAA浓度为0.1-0.5毫克/升、IBA浓度为0.1-0.5毫克/升。
步骤5、将步骤4获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中。栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒。移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20-28℃，相对湿度为70-100％。
步骤6、最后除去无纺布保湿，进行浇水等正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，即可移栽到室外大田里。
现有的杨树组织培养技术，多采用外植体诱导分化丛生成芽的方法，这种方法如果要获得数量较大的无菌苗，需要接入一大批外植体；而且直接用外植体诱导分化，其污染率较高。
在本发明的实施方案中，为提高美洲黑杨鲁林1号的产量，以及快速获得数量较多的无菌苗，为遗传转化实验提供大量的实验材料。本发明以不定芽的叶片为材料进行不定芽的诱导，诱导率较高，一片不定芽的叶片经诱导分化，可获得较大数量的无菌苗；而且，取完叶片的不定芽还可以继续转接至生根培养基中进行不定根的诱导，在增加无菌苗的数量的同时，还避免了不定芽材料的浪费。
对于不定芽的叶片选择而言，不定芽叶片的面积是非常关键的，如果不定芽叶片的面积过小，不定芽诱导率小，产生的不定芽少；如果不定芽叶片面积过大，则叶片活性不好，诱导不定芽产生的能力下降。经综合考察，发现不定芽的叶片面积为1.5-2.0cm2时诱导不定芽产生的效果最好。
另外，不同黑杨品种，其基因型不同，对于各个阶段培养基中激素的种类以及用量的要求不同。本发明在对美洲黑杨鲁林1号进行组织培养时，对各个培养阶段中的培养激素的种类以及各个激素的用量进行了优化考察，得到了最有利于美洲黑杨鲁林1号组织培养的各阶段的培养基组成。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：培养基的配置和灭菌
茎段不定芽诱导培养基：MS+6-BA(0.50毫克/升)+NAA(0.05毫克/升)+GA3(0.30毫克/升)。
不定芽继代增殖培养基：MS+6-BA(0.25毫克/升)+NAA(0.10毫克/升)+GA3(0.50毫克/升)。
叶片再生不定芽培养基：MS+6-BA(0.25毫克/升)+NAA0.07(毫克/升)+GA3(1.0毫克/升)。
生根培养基：1/2MS+NAA(0.30毫克/升)+IBA(0.10毫克/升)。
所用MS培养基均为固体MS培养基(即琼脂6-7克/升，蔗糖30克/升)。pH为5.8-6.0。
1/2MS培养基为大量元素减半，微量元素、琼脂和蔗糖都不变的固体MS培养基。
以上培养基采用121℃高压湿热灭菌20分钟。
实施例2：茎段外植体的培养、灭菌及不定芽诱导
取初春健壮的美洲黑杨鲁林1号的杨树枝条于温室中进行水培，七天左右长出新萌发的茎段，取新萌发的茎段做外植体，首先放入肥皂水中漂洗15min左右，然后用自来水冲洗3次。保证将残留的肥皂水冲洗干净。然后，在接种室用75％(体积百分含量)的酒精表面消毒30s，无菌水冲洗3次后，再用1％(质量百分数)的升汞(每升加3-4滴吐温80)消毒9min，无菌水冲洗4～5次，保证冲洗干净，之后将处理好的外植体接种于MS培养基上(空白激素培养基，即MS+蔗糖30克/升+琼脂7.0克/升)。
观察一段时间后没有污染，则将外植体从空白培养基转移到茎段不定芽诱导培养基中，每个培养基中外植体个数为3个，每个处理做5个培养基；将接种后的培养基置于培养室内培养，且培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复5个茎段。培养15天后统计不定芽萌发率(萌发的芽数/接种的芽数)，以长出幼叶为萌发标准(见表1及图1)。
表1：不同浓度的6-BA和NAA对鲁林1号茎段诱导不定芽的影响
实施例3：不定芽继代增殖诱导
以上述外植体诱导产生的不定芽剪切下来后，接种至不定芽增殖诱导培养基上，置于培养室内，培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复5个培养基，每个培养基接种3个不定芽。培养25d后，不定芽增殖倍数最高可达到14倍(见表2及图2)。
不定芽增殖倍数＝增殖不定芽总数/接种外植体数。
表2：不同浓度的6-BA、NAA和GA对鲁林1号不定芽增殖诱导的影响
实施例4：瓶苗叶片不定芽诱导
以上述诱导产生的无菌不定芽的健壮叶片为材料，接到叶片再生不定芽培养基上，置于培养室内，培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复8个培养基，每个培养基接种3个叶片，培养40天后，叶片伤口处增殖出系列小芽，根据分化率(％)＝[产生不定芽的外植体数/(接种外植体数-死亡外植体数)]×100％，统计分化率最高为88.3％(见表3及图3)。
表3:不同浓度的6-BA、NAA和GA对鲁林1号叶片增殖诱导的影响
| 处理 | 6-BA(mg·L<sup>-1</sup>) | NAA(mg·L<sup>-1</sup>) | GA<sub>3</sub>(mg·L<sup>-1</sup>) | 接种叶片数 | 分化率(％) | 再生不定芽数 |
| 1 | 0.20 | 0.10 | 1.0 | 15 | 6.70 | 1 |
| 2 | 0.20 | 0.05 | 1.0 | 15 | 37.00 | 6 |
| 3 | 0.20 | 0.07 | 1.0 | 15 | 31.7 | 4 |
| 4 | 0.25 | 0.05 | 1.0 | 15 | 82.00 | 13 |
| 5 | 0.25 | 0.07 | 1.0 | 15 | 88.30 | 16 |
| 6 | 0.25 | 0.10 | 1.0 | 15 | 68.50 | 10 |
| 7 | 0.30 | 0.07 | 1.0 | 15 | 59.00 | 9 |
| 8 | 0.30 | 0.10 | 1.0 | 15 | 47.8 | 8 |
| 9 | 0.30 | 0.05 | 1.0 | 15 | 30.0 | 4 |
实施例5：不定芽生根
选取上述实施例3中诱导产生的健壮、高度为2.0-3.0cm的不定芽，以及上述实施例4中叶片诱导产生的生长到2.5-3.5cm的不定芽分别转接到生根培养基上，置于培养室，培养室内温度设为25±2℃，光照时间为14小时。实验设3次重复，每次重复15株。培养20天后，小苗基部生出3-7条粗壮不定根，培养情况如图4所示，不定根诱导率最高为95％(表4及图4)。将生根苗在1/2MS培养基上再培养5d左右，使根和苗生长更加健壮，为下一步瓶苗叶片再生及出瓶炼苗提供材料。
表4:不同浓度的IBA和NAA对鲁林1号瓶苗生根的影响
实施例6：移栽炼苗
将实施例5获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的穴盘中。栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒。移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20-28℃，相对湿度为70-100％。实验设3次重复，每次重复100株。结果炼苗成活率(炼苗成活率＝营养钵中成活的株数/移栽的试管苗株数)达到93±5％(见图5)，之后，除去无纺布，进行浇水等正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，即可移栽到室外大田里。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种美洲黑杨鲁林1号的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取美洲黑杨鲁林1号的枝条进行水培，得到萌发的新茎段；以萌发的新茎段作为外植体，对外植体进行消毒处理；将消毒处理后的外植体接种于茎段不定芽诱导培养基中，培养诱导茎段不定芽分化；
所述茎段不定芽诱导培养基为MS+6-BA 0.3-0.7mg/L+NAA 0.02-0.1mg/L+GA30.3mg/L；
(2)待外植体长出不定芽后，将不定芽接种至不定芽继代增殖培养基中，诱导不定芽的继代增殖；
所述不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA 0.2-0.3mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L+GA30.5mg/L；
(3)待步骤(2)中的不定芽生长到2.0-3.0cm时，取叶片面积为1.5-2.0cm2的不定芽叶片为材料，接种到叶片再生不定芽培养基中，进行不定芽的诱导；
所述叶片再生不定芽培养基为MS+6-BA0.2-0.3mg/L+NAA0.05-0.10mg/L+GA3 1.0mg/L；
(4)将步骤(2)中生长到2.0-3.0cm不定芽及步骤(3)中叶片诱导产生的生长到2.5-3.5cm的不定芽分别接种至生根培养基中，进行不定根诱导；
所述生根培养基为1/2MS+IBA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L；
(5)将步骤(4)获得的生根苗进行炼苗、移栽。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水培的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
3.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，外植体的消毒处理方法为：将外植体先用肥皂水漂洗15-20min,，然后冲洗干净；再用75％的酒精表面消毒30s，无菌水冲洗后，再用质量百分数为1％的升汞消毒9min，无菌水冲洗干净。
4.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，培养诱导茎段不定芽分化的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
5.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)中，诱导不定芽的继代增殖的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
6.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)中，不定芽的诱导条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
7.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，不定根诱导的条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为14h。
8.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(5)中，所述炼苗、移栽具体为：将步骤(4)获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中；栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒；移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20-28℃，相对湿度为70-100％；最后除去无纺布保湿，进行正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，移栽到室外大田里。
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| CN101695279A (zh) * | 2009-09-11 | 2010-04-21 | 湖南茂源林业有限责任公司 | 一种美洲黑杨湘林101组织培养方法 |
| CN102246700A (zh) * | 2011-08-18 | 2011-11-23 | 西南林业大学 | 以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法 |
| WO2013097343A1 (zh) * | 2011-12-26 | 2013-07-04 | 北京林业大学 | 杨树单倍体培育方法 |
| CN110278874A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-09-27 | 山东农业大学 | 一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法 |
-
2020
- 2020-03-05 CN CN202010146771.7A patent/CN111194695A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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| CN112369331A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-02-19 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种以叶片为外植体建立彩红杨再生体系的方法 |
| CN112369331B (zh) * | 2020-12-18 | 2022-04-01 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种以叶片为外植体建立彩红杨再生体系的方法 |
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