CN110278874A

CN110278874A - 一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法

Info

Publication number: CN110278874A
Application number: CN201910646506.2A
Authority: CN
Inventors: 李际红; 邢世岩; 桑亚林; 国浩平; 侯丽丽; 王宝锐; 周文玲
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2019-09-27

Abstract

本发明公开了一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法，采用窄冠黑杨11号春枝温室水培得到外植体，在添加6‑BA 0.5‑1.5mg/L、NAA 0.02‑0.1mg/L的MS培养基中，通过器官再生方式获得窄冠黑杨11号无菌瓶苗。取瓶苗叶片在添加6‑BA 0.2‑0.3mg/L、NAA 0.03‑0.07mg/L、GA 0.1mg/L的MS培养基中诱导叶片分化，在添加6‑BA 0.1‑0.5mg/L、NAA 0.07‑0.35mg/L、GA 0.5‑1.0mg/L的MS培养基中诱导不定芽增殖，无根苗在添加NAA 0‑0.3mg/L、IBA 0‑0.3mg/L的1/2MS培养基中完成不定根的诱导。

Description

一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种植物的快速繁殖，具体地说，涉及一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法。

背景技术

黑杨是一种乔木，树高达30米；树冠阔椭圆形。树皮暗灰色，老时沟裂。小枝圆形，淡黄色，无毛。芽长卵形，富粘质，赤褐色，花芽先端向外弯曲。叶在长短枝上同形，薄革质，菱形、菱状卵圆形或三角形，长5-10厘米，宽4-8厘米，先端长渐尖，基部楔形或阔楔形，稀截形，边缘具圆锯齿，有半透明边，无缘毛，上面绿色，下面淡绿色；叶柄略等于或长于叶片，侧扁，无毛。雄花序长5-6厘米，花序轴无毛，苞片膜质，淡褐色，长3-4毫米，顶端有线条状的尖锐裂片；雄蕊15-30，花药紫红色；子房卵圆形，有柄，无毛，柱头2枚。果序长5-10厘米，果序轴无毛，蒴果卵圆形，有柄，长5-7毫米，宽3-4毫米，2瓣裂。花期4-5月，果期6月。

黑杨天然生长在河岸、河湾，少在沿岸沙丘。常成带状或片林。抗寒，喜光，不耐盐碱，不耐干旱，在冲积沙质土上生长良好。边材白色，心材淡赤褐色，边材宽于心材，材质轻软，比重0.4-0.6。木材供家具和建筑用；皮可提取单宁，并可作黄色染料；芽药用。黑杨也是杨树育种的优良亲本之一。在北疆一些地区，用于城镇绿化。

窄冠黑杨11号,母本为I-69/55，父本为山海关杨×塔形小叶杨(即窄冠黑青杨Lu6、Lu31及Lu69杨3个无性系的混合花粉)的杂交种，为雄株。由山东农业大学庞金宣等人，通过杂交选育出的杨树优良品种。该品种树冠窄、冠幅比一般大冠杨树小1/2—1/3。生长快，在一般条件下，窄冠黑杨11号5年生胸径可达20cm，树高16m，单株材积0.2m³。材质好。窄冠黑杨11号耐盐碱能力较强，在内陆土壤含盐量0.3％、PH8.0-8.2的中轻度盐碱农田中生长良好；在滨海盐碱地土壤含盐量0.1％、PH8.2-8.5的条件下能正常生长。该品种树冠窄，适于农田林网复合经营，与农作物争水肥的矛盾小。在山东各地及华北大部分地区均表现良好。对其开展组培快繁一方面可以提高窄冠黑杨的生物产量，提供其工厂化生产能力；另一方面可以加速杨树基因工程育种的步伐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法。该方法可以提高窄冠黑杨的生物产量。

其具体技术方案为：

一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法，包括以下步骤：

步骤1、是将窄冠黑杨11号冬枝在温室内进行水培，得到萌发的新茎段；以萌发嫩茎段为外植体在添加有6-BA的浓度为0.5-1.5毫克/升、NAA的浓度为0.02-0.1毫克/升、GA的浓度为0.1毫克/升的MS培养基中诱导不定芽产生。

步骤2、待不定芽叶片的叶面积达到2.0平方厘米后，以不定芽叶片为材料，在叶片分化培养基进行不定芽的诱导。所述不定芽诱导培养基为在MS培养基中添加NAA的浓度为0.03-0.07毫克/升、6-BA的浓度为0.2-0.3毫克/升、GA的浓度为0.1毫克/升。

步骤3、待叶片长出不定芽后，将不定芽转接到增殖培养基上所述增殖培养基为在MS培养基中添加NAA的浓度为0.07-0.10毫克/升、6-BA的浓度为0.1-0.5毫克/升、GA的浓度为0.5-0.1毫克/升。

步骤4、待不定芽长到2.5-3.5厘米，将苗接种至生根培养集中进行不定根诱导，所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加NAA浓度为0.0-0.3毫克/升、IBA浓度为0.0-0.3毫克/升。

步骤5、将步骤4获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中。栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒。移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20—28℃，相对湿度为70—100％。

步骤6、最后除去无纺布保湿，进行浇水等正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，即可移栽到室外大田里。

进一步，所述步骤1、2、3、4的环境条件如下：温室水培的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；茎段、叶片分化及继代增殖的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；不定根诱导的培养条件为在25±2℃，光照时间为14小时。以上光照条件均为2000-3000lx。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明以窄冠黑杨11号嫩茎段为外植体，利用其专用培养基，成功地建立了一个有效的窄冠黑杨11号离体培养再生体系，为木本植物大量组织培养快速繁殖提供了一个可参照的技术和方法。本发明方法具有以下优点：取材容易、变异率低、增值系数高的优点，培养4周增值倍数达到12倍，组培苗生根率达到98％，炼苗成活率达到97％。利用本发明方法繁殖窄冠黑杨11号，可以提高窄冠黑杨的生物产量，具有很强的工厂化生产能力。

附图说明

图1为窄冠黑杨11号茎段诱导不定芽产生；

图2为窄冠黑杨11号生根培养；

图3为窄冠黑杨11号瓶苗叶片分化；

图4为窄冠黑杨11号不定芽增殖；

图5为窄冠黑杨11号组培苗炼苗。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明涉及的遗传资源窄冠黑杨11号,母本为I-69/55，父本为山海关杨×塔形小叶杨均采集于中国山东省滨州市。窄冠黑杨11号为现有技术中的品种。

下述实施例中所用培养基均为固体MS基本培养基(含有30g/L蔗糖)。PH为5.8-6.0。

实施例1、组织培养繁殖窄冠黑杨11号培养基的配置和灭菌

培养基的配置和灭菌

茎段不定芽诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA1.0mg/L。

瓶苗叶片再生不定芽培养基：MS+6-BA0.25mg/L+NAA0.07mg/L+GA0.1mg/L。

不定芽增殖培养基：MS+6-BA0.25mg/L+NAA0.07mg/L+GA1.0mg/L。

生根培养基：1/2MS+IBA0.15mg/L+NAA0.15mg/L。

以上培养基采用121℃高压湿热灭菌20分钟。

实施例2、组织培养繁殖窄冠黑杨11号茎段外植体的培养、灭菌及不定芽诱导

取健康初春枝条于温室中水培，七天后有嫩芽萌发，取新萌发茎段做外植体，首先用肥皂清洗3-5次，然后，在接种室用75％(体积百分含量)的酒精表面消毒20秒，无菌水冲洗3次后，再用0.1％(质量百分数)的升汞(加吐温20或吐温80)消毒10分钟，无菌水冲洗5次。最后，将处理好的外植体接种于茎段不定芽诱导培养基中，每个培养基中外植体个数为3个，每个处理做3个培养基；将接种后的培养基置于培养室内培养，且培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复8个茎段。培养3周后统计不定芽萌发率80±2％(萌发的芽数/接种的芽数)，以长出幼叶为萌发标准(见图1及表1)。

表1不同浓度的6-BA和NAA对窄冠黑杨11号茎段诱导不定芽的影响

实施例3、组织培养繁殖窄冠黑杨11号瓶苗叶片不定芽诱导

以上述诱导产生的无菌不定芽的健壮叶片为材料，接到叶片再生不定芽培养基上，置于培养室内，培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复8个培养基，每个培养基接种3个叶片，培养40天后，叶片伤口处增殖出系列小芽，培养情况如图3所示，根据分化率(％)＝[产生不定芽的外植体数/(接种外植体数一死亡外植体数)]x100％，统计分化率为86±2％(见表2)。

表2不同浓度的6-BA和NAA对窄冠黑杨11号瓶苗叶片诱导不定芽的影响

实施例4、组织培养繁殖窄冠黑杨11号不定芽增殖诱导

以上述叶片诱导产生的不定芽分割后，接种至不定芽增殖诱导培养基上，置于培养室内，培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复8个培养基，每个培养基接种3个不定芽，培养20天后，不定芽增殖倍数最高可达到12倍(见图4及表3)。

表3不同浓度的6-BA、NAA和GA对窄冠黑杨11号不定芽增殖诱导的影响

实施例5、组织培养繁殖窄冠黑杨11号不定芽生根

将上述诱导产生的健壮、高度为1.5-3.0cm的无根苗转接到生根培养基上，置于培养室，培养室内温度设为25±2℃，光照时间12小时。实验设3次重复，每次重复100株。培养10天后，小苗基部生出3-7条粗壮不定根，培养情况如图2所示，不定根诱导率为98±2％(见表4)。将生根苗在1/2MS培养基上再培养10天，使根和苗生长更加健壮，为下一步瓶苗叶片再生及出瓶炼苗提供材料。

表4不同浓度的IBA和NAA对窄冠黑杨11号瓶苗生根的影响

实施例6、组织培养繁殖窄冠黑杨11号移栽炼苗

将步骤4获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中。栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒。移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20—28℃，相对湿度为70—100％。实验设3次重复，每次重复100株。结果炼苗成活率(炼苗成活率＝营养钵中成活的株数/移栽的试管苗株数)达到94±3％(见图5)，之后，除去无纺布，进行浇水等正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15—20cm时，即可移栽到室外大田里。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种窄冠黑杨11号的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、是将窄冠黑杨11号冬枝在温室内进行水培，得到萌发的新茎段；以萌发嫩茎段为外植体在添加有6-BA的浓度为0.5-1.5毫克/升、NAA的浓度为0.02-0.1毫克/升、GA的浓度为0.1毫克/升的MS培养基中诱导不定芽产生；

步骤2、待不定芽叶片的叶面积达到3平方厘米后，以不定芽叶片为材料，在叶片分化培养基进行不定芽的诱导；所述不定芽诱导培养基为在MS培养基中添加NAA的浓度为0.03-0.07毫克/升、6-BA的浓度为0.2-0.3毫克/升、GA的浓度为0.1毫克/升；

步骤3、待叶片长出不定芽后，将不定芽转接到增殖培养基上所述增殖培养基为在MS培养基中添加NAA的浓度为0.07-0.10毫克/升、6-BA的浓度为0.1-0.5毫克/升、GA的浓度为0.5-0.1毫克/升；

步骤4、待不定芽长到2.5-3.5厘米，将苗接种至生根培养集中进行不定根诱导，所述生根培养基为在1/2MS培养基中添加NAA浓度为0.0-0.3毫克/升、IBA浓度为0.0-0.3毫克/升；

步骤5、将步骤4获得的生根苗先在温室大棚内的苗床上炼苗3-5天，后开盖锻炼2-3天，然后从培养瓶中取出瓶苗，洗净根部的培养基，移栽到温室中的营养钵或穴盘中；栽培介质为1：1体积比混合的草炭土和蛭石，装钵前用浓度为0.1％的50％的可湿性多菌灵对栽培基质进行消毒；移栽后的前3-5天覆盖无纺布保湿，保持温室的温度为20—28℃，相对湿度为70—100％；

步骤6、最后除去无纺布保湿，进行浇水的正常管理，经过2-3周长出新根和新梢，当苗高达到15-20cm时，移栽到室外大田里。

2.根据权利要求1所述的窄冠黑杨11号的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤1、2、3、4的环境条件如下：温室水培的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；茎段、叶片分化及继代增殖的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；不定根诱导的培养条件为在25±2℃，光照时间为14小时；以上光照条件均为2000-3000lx。

3.根据权利要求1所述的窄冠黑杨11号的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤1、2、3、4的环境条件如下：温室水培的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；叶片分化及继代增殖的培养条件为25±2℃，光照时间为12小时；不定根诱导的培养条件为在25±2℃，光照时间为14小时；以上光照条件均为2000—3000lx。

4.根据权利要求1所述的窄冠黑杨11号的组培快繁方法，其特征在于，通过器官再生方式获得窄冠黑杨11号无菌瓶苗；取瓶苗叶片在添加6-BA 0.2-0.3mg/L、NAA 0.03-0.07mg/L、GA 0.1mg/L的MS培养基中诱导叶片分化，其分化率达到86±2％，再生不定芽数达到13个；在添加6-BA 0.1-0.5mg/L、NAA 0.07-0.35mg/L、GA 0.5-1.0mg/L的MS培养基中诱导不定芽增殖；无根苗在添加NAA 0-0.3mg/L、IBA 0-0.3mg/L的1/2MS培养基中完成不定根的诱导，其不定根诱导率达到98±2％。