KR101531308B1

KR101531308B1 - 조직배양을 이용한 오동나무의 번식방법

Info

Publication number: KR101531308B1
Application number: KR1020130073662A
Authority: KR
Inventors: 문흥규; 김용욱; 김지아; 강길남
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2015-06-24
Also published as: KR20150001053A

Abstract

본 발명은 오동나무의 액아배양을 통해 줄기를 유도하고 기내배양 조건의 적정화를 통해 다경 줄기(multiple shoot) 유도, 발근유도 및 상토이식을 통해 묘목을 생산하는 미세번식(micropropagation)의 방법으로 식물을 재생시키는 무성번식(vegetative propagation) 방법에 관한 것이다.

Description

조직배양을 이용한 오동나무의 번식방법{Method of propagating Paulownia coreana using tissue culture}

본 발명은 조직배양을 이용한 오동나무의 번식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오동나무의 액아배양을 통해 줄기를 유도하고 기내배양 조건의 적정화를 통해 다경줄기(multiple shoot) 유도, 발근유도 및 상토이식을 통해 묘목을 생산하는 미세번식(micropropagation)의 방법으로 식물을 재생시키는 무성번식(vegetative propagation) 방법에 관한 것이다.

국내외에서 발표된 오동나무류 미세번식의 결과를 살펴보면 다음과 같다.

소웅영(1976)은 오동나무의 유근을 세 종류의 길이별로 나누고 두 종류의 BA를 처리하여 부정아 유도가 가능하다는 결과를 얻었으며, 전관배와 소웅영(1978)은 참오동나무의 어린뿌리를 이용하여 부정아를 통한 줄기의 형성과정을 관찰하여, 세포분열은 주로 체관부 유조직(phloem parenchyma)에서 발생하고, 그것의 분열조직에서 부정줄기가 발달함을 관찰하였다.

Jagannathan L.과 Marcotrigiano M (1986)은 Paulownia tomentosa의 배축(hypocotyl)을 절편으로 줄기유도 및 식물을 재생하였다. 재생된 식물의 형태적 변이와 배수성(ploidy level)을 조사하여 일부 개체에서 조기개화 되는 것을 발견하였다.

Rao 등(1993)은 Paulownia fortunei에서 기내식물의 엽병 및 잎을 절편으로 다경줄기를 유도하였는데, 최적조건은 MS 배지에 4NAA 및 20BA를 처리한 조건이었다. 배양 7일 후 주로 엽병의 절단면 끝에서 부정아가 발생하여 절편의 80% 이상에서 줄기 눈(bud)이 유도되었다. 2주마다 새로운 배지로의 계대배양(subculture)으로 줄기의 생장을 촉진하였다. 절편 당 43개의 줄기를 얻었으며 발근이 잘되어 peat 혼합토양에 성공적으로 이식하였다.

Bergmann 과 Moon(1997)은 오동나무류 3수종을 재료로 엽병 및 엽신을 재료로 부정아 유도를 통한 식물체 재생을 시험하였다. 10 클론을 비교하여 클론간 재분화능을 조사하였으며, 적정배지는 MS 배지에 0.2~0.mg/L NAA와 5.0~7.0mg/L BA를 처리한 조건이었다.

Ipekci와 Gozukirmizi(2004)는 Paulownia elongata에서 잎 및 절간조직을 절편으로 여러 가지 생장조절제 배형성(somatic embryogenesis)을 시험했다. MS 배지에 TDZ, KN처리로 54.1%의 캘러스를 유도하였고, 100mg의 배발생 조직에서 평균 50.7개의 체세포배를 얻었다. 체세포배는 MS 기본배지에서 80% 발아되어 식물체로 발달하였다. 식물체는 peat와 perlite를 3:1로 섞은 혼합토로 옮겨서 70~80% 생존되었으며 형태적으로 모본과 차이가 없었고 정상 생장하였다.

Corredoira 등(2008)은 Paulownia tomentosa 성숙목을 재료로 두 가지 종류의 절편을 사용하여 TDZ와 IAA 처리로 부정아 유도를 통한 식물체 재생을 시험하였다. 재생빈도는 85~87%로 나타났으며 유도된 줄기 수는 절편 당 17.6개 이었다. 유전자형에 따라 반응 차이가 있었고, 기내 줄기는 1주 정도 IBA 처리로 90% 발근이 가능했고, 온실에서 8주간 순화 후 성공적으로 활착되었다.

이상의 예에서 보여준 것처럼 오동나무류는 기내배양을 통해 효과적인 번식이 가능함을 보여 주고 있다. 그러나 우리나라 오동나무(Paulownia coreana)를 재료로한 미세번식과 특히 휴면지 뿌리를 이용한 근삽목의 무성번식법은 아직까지 개발되지 못하고 있다. 미세번식 기술 중 액아(axillary bud) 등 눈(bud) 조직을 이용한 기술은 재생된 식물체의 변이가 적어 대량번식의 효율적인 수단이 될 수 있으며, 성삼문오동나무와 같은 역사성이 있어 보존가치가 있는 나무의 증식 보존에 적용하기에 유리한 장점이 있다.

[참고문헌]

전관배, 소웅영. 1978. 참오동나무 기관분화의 기원에 관한 연구. 한국식물조직배양학회지 5(1): 25-30

소웅영. 1976. 오동나무 유근으로부터의 기관분화와 유근증식법에 관한 연구. 한국식물조직배양학회지 4(1): 4-8

Bergmann BA and Moon HK. 1997. In vitro adventitious shoot production in Paulownia. Plant Cell Rep. 16: 315-319

Corredoira E., Ballester A., Vieitez AM. 2008. Thidiazuron-induced high frequency plant regeneration from leaf explants of Paulownia tomentosa mature trees. Plant Cell Tiss Org Cult. 95: 197-208

Jagannathan L., Marcotrigiano M. 1986. Phenotype and ploidy status of Paulownia tomentosa trees regenerated from cultured hypocotyls. Plant Cell Tiss Org Cult 7: 227-236

Ipekci A and Gozukirmizi N. 2004. Indirect somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf and internode ezplants of Paulownia elongata. Plant Cell Tiss Org Cult. 79: 341-345

Lloyd G and McCown BH. 1980. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot tip culture. Proc Intl Plant Pro Soc 30: 421-427

Murashige T and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-497

Rao CD, Goh CJ and Kumar PP. 1993. High frequency plant regeneration from excised leaves of Paulownia Fortunei. In Vitro Cell Dev Biol 29P: 72-76

현재까지 ‘성삼문오동나무’의 미세번식과 근삽목 번식기술의 선행 연구결과는 없다. 본 발명에서는 효율적인 미세번식을 위한 배지선정 등 배양 조건의 최적화 조건을 구명하고, 뿌리를 이용한 근삽목의 가능성을 조사하였다. 따라서 미세번식 배양을 위한 표면살균법, 액아 유래 줄기유도 및 증식을 위한 배지선정, 생장조절제 조건 구명, 발근유도 및 토양이식 순화 조건을 구명하였으며, 뿌리를 이용한 근삽목의 조건을 구명하였으며 본 발명이 해결하고자 하는 사항은 다음과 같다.

① 표면살균 조건

② 줄기유도 및 증식 적정화

③ 발근유도

④ 토양이식 순화

⑤ 뿌리 근삽 식물체 유도

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 오동나무(Paulownia coreana )의 줄기액아 절편을 표면살균하는 단계; 상기 표면살균된 절편을 초대배양하여 줄기를 유도하는 단계; 상기 유도된 줄기를 증식하는 단계; 상기 증식된 줄기에서 발근을 유도하는 단계; 및 상기 발근이 유도된 개체를 배양토에 이식하여 순화시키는 단계를 포함하는 오동나무의 번식방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 오동나무(Paulownia coreana) 모본의 뿌리를 10월 중순에 절취하여 2~4℃로 유지되는 냉장고에서 습윤 저장하는 단계; 및 상기 저장된 뿌리를 이듬해 봄에 모래상토에 삽목하여 묘목을 생산하는 단계를 포함하는 오동나무(Paulownia coreana )의 번식방법을 제공한다.

본 발명에 의한 번식방법은 액아로부터의 줄기유도 및 식물체 분화기술은 여러 수종의 활엽수종 기내번식에 적용이 가능하며, 특히 노령목의 어린조직을 재료로 재유령화(rejuvenation) 과정을 통해 증식시킬 수 있는 장점이 있다.

또한 성삼문오동나무와 같이 근맹아가 나오는 수종에 대해서는 뿌리를 절편으로 근삽목의 방법으로 묘목을 만들 수 있어 역사성이 있는 향토수종의 보존 및 복원사업에 활용이 가능한 장점이 있다.

도 1은 초대배양을 통해 액아로부터 유도된 줄기이다. 초대배양 후 오염이 안된 절편을 증식에 사용하였다.
도 2는 증식배지에서 유도된 다경줄기의 생장모습이다. 적정화된 조건에서 매월 3~6배의 증식이 가능하였다.
도 3은 유리 배양병에서 대량증식중인 기내묘이다.. 성삼문오동나무의 기내증식은 본 발명 조건의 배양병에서 증식이 효과적이었다.
도 4는 기내발근된 개체의 뿌리 형태이다. 발근 후 2주 안에 인공상토로 옮겨 순화를 도모하였다.
도 5는 인공상토에 이식하여 순화중인 묘목이다. 이식 후 처음 1주간 공중습도를 높게 유지함이 생존에 중요 요인으로 나타났다.
도 6은 순화 후 3주간 생장된 묘목이다. 순화된 묘목은 잎이 급속하게 커지고 빠르게 생장하는 것으로 나타났다.
도 7은 큰 화분에서 생육중인 묘목이다. 1개월에 30cm 이상 생장하였다.
도 8은 모래에서 뿌리 근삽으로 발생한 줄기이다. 하나의 뿌리에서 다수의 줄기가 발생하였으며, 4~6주 후에는 포기나누기를 통해 묘목으로 육성하였다.

본 발명은 (a) 오동나무(Paulownia coreana )의 줄기액아 절편을 표면살균하는 단계; (b) 상기 표면살균된 절편을 초대배양하여 줄기를 유도하는 단계; (c) 상기 유도된 줄기를 증식하는 단계; (d) 상기 증식된 줄기에서 발근을 유도하는 단계; 및 (e) 상기 발근이 유도된 개체를 배양토에 이식하여 순화시키는 단계를 포함하는 오동나무의 번식방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 표면살균은 절편의 수돗물세척, Tween 20액을 몇 방울 첨가하여 거품을 낸 다음 세척, 무균상(clean bench) 에서 70% 에탄올(EtOH)에 30초~1분처리, 2% 차아염소산나트륨(NaClO)에 8분~15분처리 후 멸균증류수로 4회 이상 세척한 다음, 배지에 치상하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 (b) 단계는 표면살균된 절편을 액아가 하나씩 붙도록 해부용 칼로 절단한 다음, WPM 기본배지에 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검(gellan gum)이 첨가된 고형 배지에서 액아 줄기를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 (c) 단계는 WPM 기본배지에 벤질 아데닌(BA) 0.2~1.0 ㎎/L, 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검이 첨가된 배지에서 줄기를 증식하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 (d) 단계는 2cm 이상 자란 줄기로 1/2WPM 기본배지 또는 1/2WPM 기본배지에 0.2~0.5mg/L 인돌 부틸산(IBA)을 처리하여 발근을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 (e) 단계는 발근된 어린 식물체를 원예용 인공상토에 이식시키고, 공중 습도를 90% 이상 유지한 상태에서 1~2주간 순화시켜 토양활착시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 인공상토는 피트모스(peatmos), 퍼라이트(perlite) 및 버미큘라이트(vermiculite)의 부피비가 1:1:1인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 오동나무는 성삼문오동나무(Sung Sam Mun Paulownia coreana)일 수 있다.

또한, 본 발명은 오동나무(Paulownia coreana) 모본의 뿌리를 10월 중순에 절취하여 2~4℃로 유지되는 냉장고에서 습윤 저장하는 단계; 및 상기 저장된 뿌리를 이듬해 봄에 모래상토에 삽목하여 묘목을 생산하는 단계를 포함하는 오동나무(Paulownia coreana )의 번식방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 묘목은 모래상토에 삽목된 뿌리를 20~25℃로 유지되는 순화온실에서 배양하여 생산되는 것을 특징으로 하는 오동나무의 번식방법.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시태양인 성삼문오동나무를 예로 들면, 액아배양 및 뿌리 근삽목의 방법으로 묘목을 생산하는 최적의 조건은 다음과 같다.

① 표면살균(surface disinfection)

절편(explants)을 tween 20액을 몇 방울 첨가시켜 거품을 내어 수돗물로 세척하고 무균상에서 70% 에탄올(EtOH)에 30초~1분 처리, 2% 차아염소산나트륨(NaClO)에 8분~15분 처리 후 멸균증류수로 4회 이상 세척 시 90% 이상 오염제거가 가능하다.

② 초대배양(primary culture) 줄기유도

표면살균된 절편을 액아가 하나씩 붙도록 해부용 칼로 절단한 다음 WPM (Llyod and McCown 1980) 배지에 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검으로 고형화된 배지에서 배양 시 70% 이상의 절편에서 액아유래의 줄기발생이 이루어진다.

③ 줄기증식(shoot multiplication)

초대배양으로 얻은 줄기를 재료로 WPM 배지에 BA 0.2~1.0 ㎎/L, 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검 처리로 다경 줄기를 유도할 경우 농도에 큰 차이 없이 절편 당 3~6개의 다경줄기가 유도되었으며, 다경유도된 줄기를 생장호르몬이 무첨가된 기본배지로 계대배양(subculture) 할 경우 하나의 우세 줄기로 생장된다.

④ 발근유도(root induction)

기내증식된 줄기 중에서 2cm 이상 자란 것을 1/2WPM 기본배지 혹은 1/2WPM 기본배지에 0.2~0.5mg/L IBA 처리하여 발근 유도시켰을 때, 기본배지에서는 70% 이상, IBA 처리된 배지에서는 농도에 관계없이 98% 이상 발근된다.

⑤ 토양이식 순화(acclimatization)

기내발근된 어린식물체는 뿌리에 뭍은 아가(agar)를 수돗물로 제거하고, ㅍ피트모스, 퍼라이트 및 버미큘라이트를 혼합한 상토에 이식시켜 공중습도 90% 이상, 온도 20~25℃로 유지되는 순화온실에서 배양하였을 때 94% 이상 활착된다.

⑥ 뿌리 근삽목 (root cutting)

성삼문오동나무 모본의 뿌리를 10월 하순에 굴취하여 2~4℃로 유지되는 냉장고에서 약 4개월간 습윤 저장시킨 다음 이듬해 봄 3월에 직경 0.5cm 이상 되는 것을 재료로 모래상토에 수평으로 삽목시키고 온도 20~25℃로 유지되는 순화온실에서 배양시킬 경우 98% 이상 줄기가 발생되어 묘목생산이 가능하였다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 설명하지만, 본 발명의 공시재료와 유사한 오동나무 수종의 액아배양 및 근삽목의 권리범위는 이하에서 설명한 실시예에로 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 표면 살균

성삼문오동나무의 신초줄기 액아를 4~5월에 채취하여 4℃로 유지되는 냉장고에 보관하면서 표면살균을 실시하였다.

절편은 잎을 제거하고 액아가 2~4개씩 붙도록 조제하여 계면활성제로 tween 20을 몇 방울 첨가하고 흔들어 거품을 내어 수돗물에 수회 세척하였다.

그 후, 무균상(clean bench)에서 70% 에탄올에 30초~1분, 2% 차아염소산나트륨(NaClO)으로 5~8분 각각 살균한 다음, 멸균 증류수로 5회 이상 세척 후 배양하였다.

<실시예 2> 줄기유도 및 증식

배지는 MS (Murashige and Skoog, 1962) 및 WPM (Lloyd and McCown, 1981) 기본배지에 2% 슈크로즈 처리, 0.3% 피타겔(phytagel)로 경화하여 15x2.5cm 유리 시험관에 8ml 의 배지를 넣어 초대배양 하였다.

초대배양으로 유도된 기내 줄기를 재료로 WPM 배지에 BA 0.2~1.0mg/L, 3% 슈크로즈, 0.3% phytagel 배지를 13x7.5cm 유리 배양병에 60ml씩 넣어 줄기를 증식하였다.

배양환경은 온도 24±2℃, 조도는 1일 16시간 40μmol m^-2s^-1의 냉백색 형광등의 조명으로 유지되는 배양실에서 실시하였다. 약 3~4 주마다 새로운 배지로 계대하여 증식하였다.

이하의 배양환경은 본 실시예의 조건과 동일하게 실시하였다.

<실시예 3> 발근 유도

WPM 배지 염류를 1/2로 낮춘 1/2WPM 배지에 0.5~1.0mg/L IBA, 2% 슈크로즈, 0.7% agar 처리하거나 혹은 1/2WPM 기본배지(2% 슈크로즈, 0.7% agar) 에서 발근유도하였다.

1주 후부터 발근이 관찰되었으며, 배양 3~4주 후에 발근된 개체를 인공상토에 옮겨 순화하였다.

<실시예 4> 토양이식 순화

기내발근된 개체는 조심스럽게 꺼내어 아기를 수돗물로 제거하고, 피트모스퍼라이트 및 버미큘라이트를 등량 용적비(1:1:1 v/v/v)로 섞은 배양토에 이식하고, 충분히 관수한 다음 공중습도를 90% 이상 높게 유지시켰다.

매일 1~2회 환기를 시키고, 건조하지 않도록 주기적으로 관수하여 순화된 묘목을 보다 큰 용기로 옮겨 육성하였다.

<실시예 5> 근 삽목

10월 하순에 성삼문오동나무의 근주 뿌리를 일부 굴취하여 건조하지 않도록 젖은 모래와 섞은 다음, 2~4℃로 유지되는 냉장고에 암저장하였다.

이듬해 봄 3월 하순에 저장된 직경 0.5cm 뿌리를 10cm 내외로 절단하여 온실에서 강모래를 상토로 수평으로 근삽을 실시하였다. 삽목 후 충분히 관수하고 삽목상이 마르지 않도록 주기적으로 관수하였다.

3주 후부터는 싹이 올라왔으며 4~6 주후에는 줄기 나누기의 형태로 묘목을 육성하였다.

Claims

(a) 오동나무(Paulownia coreana) 노령목의 줄기액아 절편을 표면살균하는 단계;
(b) 상기 표면살균된 절편을 초대배양하여 줄기를 유도하는 단계;
(c) 상기 유도된 줄기를 증식하는 단계;
(d) 상기 증식된 줄기에서 발근을 유도하는 단계; 및
(e) 상기 발근이 유도된 개체를 배양토에 이식하여 순화시키는 단계를 포함하는 오동나무의 번식방법에 있어서,
상기 (b) 단계는 표면살균된 절편을 액아가 하나씩 붙도록 해부용 칼로 절단한 다음, WPM 기본배지에 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검이 첨가된 고형 배지에서 액아 줄기를 유도하고,
상기 (c) 단계는 WPM 기본배지에 벤질 아데닌(BA) 0.2~1.0 ㎎/L, 2.0% 슈크로즈, 0.2% 젤란검이 첨가된 배지에서 줄기를 증식하며,
상기 (d) 단계는 2cm 이상 자란 줄기로 1/2WPM 기본배지에 0.2~0.5mg/L의 인돌 부틸산(IBA)을 처리하여 발근을 유도하는 것을 특징으로 하는 오동나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 표면살균은 절편의 수돗물세척, 트윈 20액을 몇 방울 첨가하여 거품을 낸 다음 세척, 무균상(clean bench) 에서 70% 에탄올(EtOH)에 30초~1분처리, 2% 차아염소산나트륨(NaClO)에 8분~15분처리 후 멸균증류수로 4회 이상 세척한 다음, 배지에 치상하는 것을 특징으로 하는 번식방법.
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제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 발근된 어린 식물체를 원예용 인공상토에 이식시키고, 공중 습도를 90% 이상 유지한 상태에서 1~2주간 순화시켜 토양활착시키는 것을 특징으로 하는 번식방법.
제6항에 있어서, 상기 인공상토는 피트모스, 퍼라이트 및 버미큘라이트의 부피비가 1:1:1인 것을 특징으로 하는 번식방법.
제1항 내지 제2항 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오동나무가 성삼문오동나무(Sung Sam Mun Paulownia coreana)인 것을 특징으로 하는 번식방법.
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