CN115989791A - 一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法和获取白花泡桐组培苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法和获取白花泡桐组培苗的方法，属于组织培养技术领域。包括：将白花泡桐叶片叶柄接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.2～1mg/L噻苯隆+0.05～0.2mg/L吲哚‑3‑乙酸+20～30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂。利用此方法，光照培养40天，可显著提高不定芽诱导率及每个外植体诱导出的不定芽个数，不定芽诱导率可达82.22％，每个外植体平均诱导出的不定芽个数可达7.47个，所诱导出的不定芽健壮，叶片鲜绿。

Description

一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法和获取白花泡桐组培苗的方法

技术领域

本发明涉及组织培养领域，特别是涉及一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法和获取白花泡桐组培苗的方法。

背景技术

白花泡桐(Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.)为玄参科泡桐属高大乔木，是我国南方重要的乡土速生树种之一；其主干直、高可达30米，胸径可达2米；其在泡桐属中主干较高、材积量较大、木材质量较好；其具有根系深、生长快、适应性强、分布范围广、材质优良、用途广泛等特点。白花泡桐人工林一般种植5-6年即可成材，其作为用材林，材质轻软，易加工和干燥，很少变形和开裂，材质浅白，且具有独特的丝绢光泽，被广泛应用于航空、建筑、工业、车辆、造纸、家具和农副业等行业。同时，白花泡桐具有修复重金属污染、高碳汇量等生态用途。

然而泡桐属木材虽然有许多优良特性，但也有其不足之处。例如，泡桐木用于建筑行业常用来作檀条、椽子等，但不适用于作窗框和门框，因为其力学强度低，易于损坏；用于家具制作时，宜于作装板，不宜作为腿衬；作为板材使用时，由于硬度小及强度低等缺点，常用来制作成胶合板来增加其强度及硬度。因此，对其木材品质进行改良显得尤为重要。

目前通过基因工程手段对植物进行遗传改良已成为研究热点，针对泡桐属树种遗传改良研究的报道相对较少，原因是缺乏有效的遗传转化机制。目前对于植物而言，农杆菌介导的遗传转化方法是一种较为简便、有效的方法，而一种有效的不定芽诱导再生体系是农杆菌侵染及转基因植株再生的关键环节。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法和获取白花泡桐组培苗的方法，采用本发明提供的方法提高了花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的诱导率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：

将白花泡桐叶片叶柄接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；

所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.2～1mg/L噻苯隆+0.05～0.2mg/L吲哚-3-乙酸+20～30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。

优选的，所述白花泡桐叶片叶柄的获取方法包括：选取白花泡桐的叶片，从叶柄中间断后，叶片从中间部位横切剪断，得到具有半个叶柄和半个叶片的白花泡桐叶片叶柄。

优选的，所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.5mg/L噻苯隆+0.15mg/L吲哚-3-乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。

优选的，所述诱导培养的条件包括：所述诱导培养的时间为40d，所述诱导培养在光照下进行，所述光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。

本发明还提供了一种获取白花泡桐组培苗的方法，采用上述技术方案所述的方法得到不定芽，将所述不定芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到白花泡桐组培苗；

所述生根培养基的组分包括：1/2MS+0.1～0.3mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH 5.8。

优选的，所述生根培养的条件包括：所述生根培养的时间为15d，所述生根培养在光照下进行，所述的光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。

优选的，所述生根培养基的组分包括：1/2MS+0.2mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH 5.8。

优选的，将得到的白花泡桐组培苗移栽到基质中进行炼苗，再移栽到大田。

优选的，所述基质包括泥炭土和椰糠，所述泥炭土和椰糠的体积比为1:2。

优选的，所述炼苗的条件包括：所述炼苗的时间为30d，所述炼苗的温度为20～32℃，所述炼苗的遮阴度为60～80％。

有益效果：

以白花泡桐带叶柄的叶片为外植体，通过外植体剪切，利用不定芽诱导培养基诱导不定芽，不定芽诱导率(即诱导出不定芽的外植体个数/接种的外植体个数)为37.78～82.22％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为2.03～7.47；利用生根培养基对不定芽进行生根培养，生根率为92～95％，根系健壮；最终通过炼苗移栽能够得到完整的有诱导出的不定芽形成的完整植株。应用本发明方法，可以直接从白花泡桐叶柄及叶片部位诱导出不定芽，为利用农杆菌介导法实现外源基因在白花泡桐体内的表达提供再生体系，为白花泡桐遗传转化体系提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1不定芽诱导结果图；

图2为本发明实施例2不定芽诱导结果图；

图3为本发明实施例3不定芽诱导结果图；

图4为本发明实施例4不定芽诱导结果图；

图5为本发明实施例5不定芽诱导结果图；

图6为本发明实施例6不定芽诱导结果图；

图7为本发明实施例7不定芽诱导结果图；

图8为本发明实施例8不定芽诱导结果图；

图9为本发明实施例9不定芽诱导结果图；

图10为本发明对比例1不定芽诱导结果图；

图11为本发明对比例1不定芽诱导结果图；

图12为本发明对实施例1生根结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：将白花泡桐叶片叶柄接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.2～1mg/L噻苯隆+0.05～0.2mg/L吲哚-3-乙酸+20～30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。

在本发明中，所述白花泡桐叶片叶柄的获取方法优选包括：选取白花泡桐的叶片，从叶柄中间断后，叶片从中间部位横切剪断，得到具有半个叶柄和半个叶片的白花泡桐叶片叶柄，同时此外植体叶片沿主脉方向用消过毒的灭菌刀划3-4个伤口。全程无菌操作，在无菌工作台上完成。本发明优选将将处理好的白花泡桐叶片叶柄接种于不定芽诱导培养基中，诱导生成不定芽；所述的白花泡桐叶片叶柄接种时叶片远轴端朝上，近轴端接触培养基。在本发明中，所述不定芽诱导培养基的组分优选包括：MS+0.5mg/L噻苯隆+0.15mg/L吲哚-3-乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。在本发明中，所述诱导培养的条件优选包括：所述诱导培养的时间为40d，所述诱导培养在光照下进行，所述光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。照周期为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，光照温度为28±3℃。利用此方法，光照培养40天，可显著提高不定芽诱导率及每个外植体诱导出的不定芽个数，不定芽诱导率可达82.22％，每个外植体平均诱导出的不定芽个数可达7.47个，所诱导出的不定芽健壮，叶片鲜绿。

本发明提供了一种获取白花泡桐组培苗的方法，采用上述技术方案所述的方法得到不定芽，将所述不定芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到白花泡桐组培苗；所述生根培养基的组分包括：1/2MS+0.1～0.3mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH 5.8。

在本发明中，所述生根培养的条件优选包括：所述生根培养的时间为15d，所述生根培养在光照下进行，所述的光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。在本发明中，所述生根培养基的组分优选包括：1/2MS+0.2mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH5.8。利用此方法，光照培养15天，可得到白花泡桐生根苗，生根率可达95％，所得生根苗根系健壮、发达，有利于后期的移栽。

本发明优选将得到的白花泡桐组培苗移栽到基质中进行炼苗，再移栽到大田。在本发明中，所述基质优选包括泥炭土和椰糠，所述泥炭土和椰糠的体积比优选为1:2。在本发明中，所述炼苗的条件优选包括：所述炼苗的时间为30d，所述炼苗的温度为20～32℃，所述炼苗的遮阴度为60～80％

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)外植体处理：选取白花泡桐组培苗健康、嫩绿的叶片，从叶柄中间断后，叶片也从中间部位横切剪断，从而得到一个具有半个叶柄及半个叶片的外植体。同时此外植体叶片沿主脉方向用消过毒的灭菌刀划3-4个伤口。全程无菌操作，在无菌工作台上完成。

2)不定芽诱导：将上述外植体接种于不定芽诱导培养基中，叶片远轴端朝上，近轴端接触培养基，接种外植体个数30个，重复3次。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.5cm，诱导率(即诱导出不定芽的外植体个数/接种的外植体个数)为60％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为6.41个；所用的不定芽诱导培养基配方为：MS+TDZ(噻苯隆)1.0mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)生根培养：选取步骤2)中高度为1.5-2.5cm的不定芽，分株转入生根培养基中，光照培养15天，得到白花泡桐生根苗，生根数6-7条，根长1.5-3.0cm，苗高4-6cm，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率95％；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)将步骤3)中的生根苗根部洗净后，移栽于泥炭土和椰糠(体积比例：1:2)混合基质中，在遮阴度为60～80％的温室大棚中进行炼苗，30天后可移栽大田，移栽成活率90％。

实施例2

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)1.0mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.15mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.0cm，诱导率为71.11％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为7.11个。

将步骤3)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 0.1mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；光照培养15天，得到白花泡桐生根苗，生根数4-6条，根长1.5-2.5cm，苗高4-6cm，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率92％。

实施例3

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)1.0mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.0cm，诱导率为75.56％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为7.27个。

将步骤3)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；光照培养15天，得到白花泡桐生根苗，生根数4-7条，根长1.5-2.0cm，苗高3-6cm，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率93％。

实施例4

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.5mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.0cm，诱导率为71.11％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为6.41个。

实施例5

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.5mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.15mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.5cm，诱导率为82.22％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为7.47个。

实施例6

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.5mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.0cm，诱导率为61.11％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为6.5个。

实施例7

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.2mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.5cm，诱导率为42.22％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为2.21个。

实施例8

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.2mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.15mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-2.5cm，诱导率为40.0％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为2.2个。

实施例9

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.2mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，不定芽健壮，叶片鲜绿，芽高0.5-3.0cm，诱导率为37.78％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为2.03个。

对比例1

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)5.0mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位有不定芽形成，有部分不定芽玻璃化，芽高0.5-1.5cm，诱导率为21.11％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为0.23个。

将步骤3)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 0.01mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；光照培养15天，得到白花泡桐生根苗，生根数2-3条，根长1.5-3.0cm，苗高4-6cm，所得生根苗的根系较为纤细，经统计生根率82％。

对比例2

将步骤2)中不定芽诱导培养基配方修改为：MS+TDZ(噻苯隆)0.05mg·L^-1+IAA(吲哚-3-乙酸)0.01mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。光照培养40天，叶柄及叶片伤口部位几乎没有不定芽形成，芽高0.5-2.0cm，诱导率为8.8％，平均每个外植体诱导出的不定芽个数为0.2个。

将步骤3)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 1.0mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8；光照培养15天，得到白花泡桐生根苗，生根数2-3条，根长1.0-2.2cm，苗高3-5cm，所得生根苗的根系较为粗壮，经统计生根率75％。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种利用白花泡桐叶片叶柄诱导不定芽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将白花泡桐叶片叶柄接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；

所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.2～1mg/L噻苯隆+0.05～0.2mg/L吲哚-3-乙酸+20～30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白花泡桐叶片叶柄的获取方法包括：选取白花泡桐的叶片，从叶柄中间断后，叶片从中间部位横切剪断，得到具有半个叶柄和半个叶片的白花泡桐叶片叶柄。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基的组分包括：MS+0.5mg/L噻苯隆+0.15mg/L吲哚-3-乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH值为5.8。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件包括：所述诱导培养的时间为40d，所述诱导培养在光照下进行，所述光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。

5.一种获取白花泡桐组培苗的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的方法得到不定芽，将所述不定芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到白花泡桐组培苗；

所述生根培养基的组分包括：1/2MS+0.1～0.3mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH5.8。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根培养的条件包括：所述生根培养的时间为15d，所述生根培养在光照下进行，所述的光照的时间为12h/d，所述光照的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，所述光照的光照温度为28±3℃。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根培养基的组分包括：1/2MS+0.2mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH 5.8。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将得到的白花泡桐组培苗移栽到基质中进行炼苗，再移栽到大田。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基质包括泥炭土和椰糠，所述泥炭土和椰糠的体积比为1:2。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述炼苗的条件包括：所述炼苗的时间为30d，所述炼苗的温度为20～32℃，所述炼苗的遮阴度为60～80％。

Images