CN107278891B

CN107278891B - 一种杏梅组织培养快速繁殖方法

Info

Publication number: CN107278891B
Application number: CN201710482433.9A
Authority: CN
Inventors: 郑唐春; 张启翔; 卓孝康; 孙丽丹; 袁存权; 程堂仁; 王佳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2037-06-22
Also published as: CN107278891A

Abstract

本发明涉及一种杏梅组织培养快速繁殖方法，包括：以当年生杏梅种子为外植体，经消毒、冷藏、启动培养后，将无菌苗子叶和/或嫩茎接种在分化培养基上，培养3‑4周；获得不定芽后，将不定芽转移至抽茎培养基上，继续培养2‑3周；待丛生苗长至3‑4cm长时，将丛生苗转接入生根培养基上，培养2‑3周；然后将生根苗移栽、罩炼苗后，正常培养。本发明不定芽诱导数量达10.6，丛生苗茎高达3.56cm，丛生苗增值系数达5.5，生根率达95％。本发明实现了杏梅组培快繁，为梅花遗传转化及分子育种提供了技术支持。

Description

一种杏梅组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种杏梅组织培养快速繁殖方法。

背景技术

梅花(Prunus mume)是中国传统十大名花之一，花色绚丽多彩，枝型变异丰富，是重要的观赏花木与果树。梅花的栽培范围，2000多年来一直局限在长江及淮河流域，为了将这一传统名花扩大栽培地区范围，尤其是将梅花推广应用到三北地区，在半世纪前就已开展抗寒梅花育种工作。早期通过将真梅系品种与杏等近缘种进行种间杂交，培育出具有抗寒能力的杏梅梅花品种，丰富了北方早春的植物景观。

为了保持梅花品种的优良性状，生产上常采取嫁接和扦插等无性繁殖手段扩繁植株，但存在着扩繁系数小、受季节限制、周期长等问题。传统梅花品种改良和新品种选育一般采用杂交育种及实生苗选择育种等方法，由于梅花从开花授粉到果实成熟，需要2-3个月的时间，收获的种子必须经过沙藏处理后才能萌发，梅花传统育种存在育种周期长，选择局限性等限制因素。随着植物基因工程技术的发展，利用植物遗传转化体系可以客服传统育种技术的局限性，加快育种进程并促进梅花新优奇特种质创制。

梅花的离体快繁工作是建立梅花遗传转化体系的前提，无性系的建立以及试管苗的获得可以为下一步的转基因育种工作提供重要的试材。

公开号为CN102550404A的发明公开了一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法，该方法以真梅系梅花品种‘淡寒红’种子实生苗叶片为外植体，在愈伤诱导培养基MS+蔗糖(20-40g/L)+2,4-D(0.25-2.0)mg/L，pH＝5.8-6.0的固体培养基，能够高效诱导愈伤组织。

吕英民(吕英民，曹亮，张启翔.梅花品种‘美人’叶片离体再生体系的建立[J].分子植物育种，2006，4(6):887--894.)等以樱李梅品种‘美人梅’叶片材料为外植体，以愈伤诱导培养基1/2WPM+2,4-D(5mg/L)获得愈伤组织后，再转入1/2WPM+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+AgNO₃(8mg/L)+水解乳蛋白(100mg/L)培养基，最终获得生根苗。

杨洁(杨洁，闻娟，晏晓兰，包满珠，张俊卫.‘雪梅’未成熟合子胚体胚发生与植株再生[J].北京林业大学学报,2013,v.35(s1):21-24.)等以梅花‘雪梅’未成熟合子胚为外植体，在胚诱导培养基1/2MS+2,4-D(1.0mg/L)+6-BA(0.2mg/L)上获得体胚，体胚在增殖培养基1/2MS+6-BA(0.1mg/L)+NAA(0.05mg/L)中产生次生体胚，在1/2MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+GA3(0.5mg/L)培养基上长出不定芽。

上述通过叶片、胚培养等器官发生途径和体细胞胚发生途径虽然获得了再生植株，但还存在着离体组织培养分化慢、丛生茎少、生根困难等问题，不能满足实际生产需求及梅花遗传转化操作。

发明内容

本发明的目的是针对现用技术的局限性提供一种繁殖速度快，操作简便的杏梅离体快繁方法。利用该方法，可以快速、大量的获得无菌组培苗，用于规范化生产扩繁与科学研究中的遗传转化。

为了实现上述目的，本发明提供了一种杏梅组织培养快速繁殖方法，包括：以当年生杏梅种子为外植体，经消毒、冷藏、启动培养后，将无菌苗子叶和/或嫩茎接种在分化培养基上，培养3-4周；获得不定芽后，将不定芽转移至抽茎培养基上，继续培养2-3周；待丛生苗长至3-4cm长时，将丛生苗转接入生根培养基上，培养2-3周；然后将生根苗移栽(出瓶)、(罩瓶)炼苗(一般1周后)，正常培养。

进一步地，所述获取无菌苗嫩茎及子叶的方法包括：采集杏梅成熟果实，破碎果核后，对种子进行消毒；将消毒后的种子接种于冷藏培养基中，在4℃冰箱黑暗处理培养3-4周；然后将种子转移至分化培养基，在光照下继续培养2-3周直到种子萌发；待萌发苗长至2-3cm时候，即可切取子叶和/或嫩茎。然后可进行后续操作(转移至分化培养基上)。

进一步地，本发明还对外植体消毒方法进行改进，采用预处理除菌加延时消毒相结合的方法，不仅有效保护外植体，还可以彻底杀除微生物，有效解决污染问题。所述杏梅种子外植体消毒包括：选用完整杏梅种子为外植体，室内流水冲洗30min后，在无菌条件下，利用2％次氯酸钠(含0.03％Tween-20)消毒30min，再利用无菌水清洗3-4遍，铺于无菌滤纸上晾干。

进一步地，所用种子冷藏处理方法包括：将消毒后的种子转接入冷藏培养基中，一个组培容器中放置6-7枚，种子与种子之间间隔1-2cm，并用封口膜封口；将组培容器放置于4℃冰箱黑暗处理培养3-4周。

进一步地，所用启动培养方法包括：将冷藏处理后的种子转移至新鲜的启动培养基中，在组织培养室中培养2-3周，直到种子萌发。培养环境如下：温度23±2℃，16h光照/8h黑暗，光照强度2500lux-3000lux。

进一步地，所用分化培养方法包括：将萌发的无菌苗的上部子叶和/或嫩茎接种至分化培养基上，诱导形成不定芽。

进一步地，所用抽茎培养方法包括：将形成的不定芽团剪切后，接种于抽茎培养基，进行丛生抽茎培养。

进一步地，所用生根培养方法包括：将形成的丛生芽，剪切接种至生根培养基中，进行生根培养。

进一步地，所用移栽与炼苗方法包括将获得的生根苗，移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，罩瓶炼苗1周后，正常培养。

更进一步地，本发明还对移栽与炼苗方式进行改进，采用移栽后模拟组培环境的方法，有效提高了组培苗的移栽成活率并缩短了缓苗期。所述移栽与炼苗包括：生根培养后2-3周，将生根苗移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，将组培瓶倒扣至移栽苗上，罩瓶培养1周后，保持空气湿度为60％-70％，去瓶正常培养。本发明所述一种杏梅组织培养快速繁殖方法，具体包括以下步骤：

(1)种子消毒处理：每年6-7月，收集杏梅成熟果实，利用夹核器破碎果核，收集完整种子。利用流水冲洗30min后，在超净工作台中，利用2％次氯酸钠(含0.03％Tween-20)消毒25min，转移消毒后的种子至无菌水中清洗3-4遍；

(2)种子冷藏处理：将步骤(1)中消毒后的种子转接入冷藏培养基中，一个组培容器中放置6-7枚，种子与种子之间间隔1-2cm，并用封口膜封口。将组培容器放置于4℃冰箱黑暗处理培养3-4周；

(3)启动培养：将步骤(2)中冷藏处理后的种子转移至新鲜的启动培养基中，在组织培养室中培养2-3周，直到种子萌发。培养环境如下：温度23±2℃，16h光照/8h黑暗，光照强度2500lux-3000lux；

(4)分化培养：将步骤(3)中萌发的无菌苗的上部子叶和/或嫩茎等接种至分化培养基上，诱导形成不定芽；

(5)抽茎培养：将步骤(4)中形成的不定芽团剪切后，接种于抽茎培养基，进行丛生抽茎培养；

(6)生根培养：将步骤(5)中形成的丛生芽，剪切接种至生根培养基中，进行生根培养。

(7)移栽与炼苗：将步骤(6)中获得的生根苗，移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，罩瓶炼苗1周后，正常培养。

本发明还提供用于杏梅组培快繁的种子冷藏培养基，所述种子冷藏培养基为：1/2MS培养基+蔗糖(10-20g/L)+琼脂适量(一般5.5-6.2g/L)，pH值5.8-6.0；优选为1/2MS培养基+蔗糖(10g/L)+琼脂适量(一般5.8g/L)，pH值5.8-6.0。

本发明还提供用于杏梅组培快繁的启动培养基，所述启动培养基为：MS培养基+蔗糖(20-25g/L)+6-BA(0.10-0.30mg/L)+NAA(0.05-0.25mg/L)+琼脂适量(一般5.5-6.2g/L)，pH值5.8-6.0；优选为MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.05mg/L)+琼脂适量(一般5.8g/L)，pH值5.8-6.0。

本发明还提供用于杏梅组培快繁的分化培养基(或称不定芽诱导培养基)，所述分化培养基为：QL培养基+蔗糖(20-30g/L)+6-BA(0.25-0.50mg/L)+NAA(0.05-0.10mg/L)+IBA(0.05-0.10mg/L)+琼脂适量(一般5.5-6.2g/L)，pH值5.8-6.0；优选为QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂适量(一般5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

本发明还提供用于杏梅组培快繁的抽茎培养基(或称丛生培养基)，所述抽茎培养基为：QL培养基+蔗糖(20-25g/L)+6-BA(0.10-0.20mg/L)+NAA(0.05-0.10mg/L)+琼脂适量(一般5.5-6.2g/L)，pH值5.8-6.0；优选为QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.20mg/L)+NAA(0.10mg/L)+琼脂适量(一般5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

本发明还提供用于杏梅组培快繁的生根培养基，所述生根培养基为：1/2MS培养基+蔗糖(20-25g/L)+IBA(0.15-0.30mg/L)+琼脂适量(一般5.5-6.2g/L)，pH值5.8-6.0；优选为1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+IBA(0.30mg/L)+琼脂适量(一般5.8g/L)，pH值5.8-6.0。

进一步地，本发明所用杏梅种子为杏梅品种‘淡丰后’自交授粉所结果实。

本发明方法不定芽诱导数量达10.6，丛生苗茎高达3.56cm，丛生苗增值系数达5.5，生根率达95％。并且本发明对种子消毒方法进行了改进，采用2％次氯酸钠(含表面活性剂)延时消毒方法，不仅操作简单，还可以彻底杀除微生物，有效解决了污染问题。本发明还对组培苗炼苗方式进行改进，采取移栽后罩瓶的处理方式，不仅简便易行，还增加移栽成活率。本发明实现了杏梅组培快繁，为梅花遗传转化及分子育种提供了技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中杏梅启动培养基上的种子；

图2为本发明实施例1中杏梅启动培养基上的无菌苗；

图3为本发明实施例1中杏梅分化培养基上形成愈伤组织；

图4为本发明实施例1中杏梅分化培养基上形成不定芽；

图5为本发明实施例1中杏梅丛生培养基上形成丛生茎；

图6为本发明实施例1中杏梅生根培养基上形成不定根；

图7为本发明实施例1中杏梅完整组培苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是示范性的，不限制本发明的范围。若无特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规操作手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例所用实验材料：

1.杏梅种子

实施例中所用杏梅种子采自北京林业大学鹫峰国际梅园，为杏梅品种‘淡丰后’自交授粉所结果实。

2.植物激素

所用植物激素采用美国Sigma公司的NAA(萘乙酸)、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)。

3.植物培养基

所用植物培养基采用美国Caisson公司的MS培养基(Murashige&Skoog Medium)、1/2MS培养基(1/2Murashige&Skoog Medium)、QL培养基(Quoirin&Lepoivre Basal SaltMixture)。

实施例1

杏梅组织培养快速繁殖方法，具体如下：

一、实验方法

1.种子消毒处理：利用夹核器破碎杏梅成熟果实果核，收集完整种子。分别进行如下3种方法消毒：

(1)利用75％酒精消毒30s，在超净工作台中，转入3％次氯酸钠消毒20min；

(2)利用流水冲洗30min后，在超净工作台中，转入2％次氯酸钠消毒30min；

(3)利用流水冲洗30min后，在超净工作台中，利用2％次氯酸钠(含0.03％Tween-20)消毒30min。3种方法消毒后的种子均用无菌水中清洗3-4遍；

2.种子冷藏处理：将消毒后的种子转接入冷藏培养基中，每个组培容器中放置6-7枚，种子与种子之间间隔1-2cm，并用封口膜封口。将组培容器放置于4℃冰箱黑暗处理培养3-4周；

3.启动培养：将冷藏处理后的种子转移至新鲜的启动培养基中，启动培养基为：MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.05mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0；在组织培养室中培养2-3周，直到种子萌发。培养环境如下：温度23±2℃，16h光照/8h黑暗，光照强度2500lux-3000lux；

4.分化培养：将萌发后无菌苗的上部嫩茎、子叶等分别接种至下列分化培养基上，诱导形成不定芽。分别采用如下分化培养基：

(1)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.05mg/L)+IBA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(2)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.05mg/L)+IBA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(3)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(4)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(5)MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.05mg/L)+IBA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(6)MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.05mg/L)+IBA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(7)MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(8)MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

5.抽茎培养：将形成的不定芽团剪切后，接种于下列抽茎培养基，进行丛生抽茎培养。分别采用如下培养基：

(1)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.10mg/L)+NAA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(2)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.10mg/L)+NAA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(3)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.20mg/L)+NAA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0；

(4)QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.20mg/L)+NAA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

6.生根培养：将形成的丛生芽，剪切接种至生根培养基中，进行生根培养。分别采用如下培养基：

(1)1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+IBA(0.15mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0；

(2)1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+IBA(0.30mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0；

(3)1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+NAA(0.15mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0；

(4)1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+NAA(0.30mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0。

7.移栽与炼苗：将获得的生根苗，分别进行如下炼苗处理：

(1)在弱光下开盖处理3天，移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，将透明组培瓶罩瓶炼苗1周后，去瓶正常培养；

(2)在弱光下开盖处理5天，移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，将透明组培瓶罩瓶炼苗1周后，去瓶正常培养；

(3)将组培苗直接移栽至草炭土基质(含10％珍珠岩)中，将透明组培瓶罩瓶炼苗1周后，去瓶正常培养。

二、实验结果

1.不同消毒方式对种子萌发的影响

不同消毒方式对种子萌发的影响见表1。在冷藏培养基中，经过3-4周培养后，编号3的消毒方式：利用流水清洗30min后，利用2％次氯酸钠(含0.03％Tween-20)消毒30min的处理方式，污染率为零，无污染，种皮保持淡黄色。将冷藏后的种子转移入新鲜的启动培养基中进行种子的启动培养(图1)。经过2-3周的启动培养，绝大多数种子均能正常萌发，长出根、茎及叶等组织(图2)。本发明优选的启动培养基为：MS培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.25mg/L)+NAA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

表1不同消毒方式对种子萌发的影响

2.不同外植体及培养基对不定芽诱导的影响

将萌发后无菌苗的上部嫩茎、子叶等接种至下列分化培养基上，诱导形成愈伤组织和不定芽，结果见表2。在外植体选择上，子叶比嫩茎具有更高的不定芽诱导率，且QL培养基比MS培养基更适合作为杏梅的培养基，QL培养基形成的不定芽颜色绿色，长势良好(图3，图4)。本发明优选的分化培养基(或称不定芽诱导培养基)为：QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.50mg/L)+NAA(0.10mg/L)+IBA(0.05mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

表2不同培养基对不定芽诱导的影响

注:小写字母表示0.05水平上差异显著，下同。

3.不同培养基对抽茎培养的影响

将形成的不定芽团剪切后，接种于下列抽茎培养基，进行丛生抽茎培养，结果见表3。在培养基种类上只选择了更合适李属植物分化的QL培养基，当NAA浓度为0.10mg/L时，不定芽能获得最多的丛生茎，且抽茎速度快，增殖倍数达到最大化(图5)。本发明优选的抽茎培养基为：QL培养基+蔗糖(25g/L)+6-BA(0.20mg/L)+NAA(0.10mg/L)+琼脂(5.5g/L)，pH值5.8-6.0。

表3不同培养基对抽茎培养的影响

4.不同培养基对生根培养的影响

将形成的丛生芽，剪切长度在2-3cm的茎段接种至生根培养基中，进行生根培养，生根情况见表4。处理发现，不同生长素对诱导生根具有不同效果，生根处理2周后，0.30mg/L IBA诱导茎段产生细、长(3.0-5.0cm)的不定根，数量较少(3-5条)(图6，图7)，而0.30mg/LNAA能诱导茎段产生短(0.5-1.0cm)、粗的不定根，且数量众多(5-10条)，但NAA诱导形成的粗壮不定根极易在移栽过程中脱落，影响组培苗的移栽成活率。本发明优选的生根培养基为：1/2MS培养基+蔗糖(20g/L)+IBA(0.30mg/L)+琼脂(5.8g/L)，pH值5.8-6.0。

表4不同培养基诱导生根情况

5.不同炼苗方式对移栽成活率的影响

将生根培养3周后的组培苗，移栽至育苗盆中。随着开盖处理时间的延长，培养基内水分含量降低，培养基硬化，在移栽过程中容易造成根系脱落与断裂，此外，还增加了真菌污染率，最终不同时间开盖炼苗处理下的成活率仅为60-70％。而本发明的罩瓶处理，不仅操作简单，而且组培苗成活率达95％以上。

以上实施例的说明仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域技术人员来说，实验细节及形式的适当修改或替换是可操作的，但值得注意的是，在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或替换，均应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种杏梅组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括：以当年生杏梅种子为外植体，经消毒、冷藏、启动培养后，将无菌苗子叶和/或嫩茎接种在分化培养基上，培养3-4周；获得不定芽后，将不定芽转移至抽茎培养基上，继续培养2-3周；待丛生苗长至3-4cm长时，将丛生苗转接入生根培养基上，培养2-3周；然后将生根苗移栽、炼苗后，正常培养；

种子冷藏处理方法包括：将消毒后的种子转接入冷藏培养基中，一个组培容器中放置6-7枚，种子与种子之间间隔1-2cm，并用封口膜封口；将组培容器放置于4℃冰箱黑暗处理培养3-4周；启动培养方法包括：将冷藏处理后的种子转移至新鲜的启动培养基中，在组织培养室中培养2-3周，直到种子萌发；培养环境如下：温度23±2℃，16h光照/8h黑暗，光照强度2500lux-3000lux；

所用冷藏培养基为：1/2 MS培养基+蔗糖10-20g/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；

所用启动培养基为：MS培养基+蔗糖20-25g/L+6-BA 0.10-0.30mg/L+NAA 0.05-0.25mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；

所述分化培养基为：QL培养基+蔗糖20-30g/L+6-BA 0.25-0.50mg/L+NAA 0.05-0.10mg/L+IBA 0.05-0.10mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；

所述抽茎培养基为：QL培养基+蔗糖20-25g/L+6-BA 0.10-0.20mg/L+NAA 0.05-0.10mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+蔗糖20-25g/L+IBA 0.15-0.30mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述外植体进行消毒的步骤：选用完整杏梅种子为外植体，室内流水冲洗30min后，在无菌条件下，利用含0.03％Tween-20的2％次氯酸钠消毒30min，再利用无菌水清洗3-4遍，铺于无菌滤纸上晾干。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用移栽、炼苗方法包括将获得的生根苗，移栽至含10％珍珠岩的草炭土基质中，罩瓶炼苗1周后，正常培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述移栽与炼苗方法包括：生根培养2-3周后，将生根苗移栽至含10％珍珠岩的草炭土基质中，将组培瓶倒扣至移栽苗上，罩瓶培养1周后，保持空气湿度为60％-70％，去瓶正常培养。

5.根据权利要求1-2、4任一项所述的方法，其特征在于，所用冷藏培养基为：1/2MS培养基+蔗糖10g/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；和/或，

所用启动培养基为：MS培养基+蔗糖25g/L+6-BA0.25mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂5.8g/L，pH值5.8-6.0；和/或，

所述分化培养基为：QL培养基+蔗糖25g/L+6-BA 0.50mg/L+NAA 0.10mg/L+IBA0.05mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；和/或，

所述抽茎培养基为：QL培养基+蔗糖25g/L+6-BA 0.20mg/L+NAA 0.10mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0；和/或，

所述生根培养基为：1/2MS培养基+蔗糖20g/L+IBA 0.30mg/L+琼脂适量，pH值5.8-6.0。

6.根据权利要求1-2、4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子消毒处理：每年6-7月，收集杏梅成熟果实，利用夹核器破碎果核，收集完整种子；利用流水冲洗30min后，在超净工作台中，利用含0.03％Tween-20的2％次氯酸钠消毒30min，转移消毒后的种子至无菌水中清洗3-4遍；

(2)种子冷藏处理：将步骤(1)中消毒后的种子转接入冷藏培养基中，一个组培容器中放置6-7枚，种子与种子之间间隔1-2cm，并用封口膜封口；将组培容器放置于4℃冰箱黑暗处理培养3-4周；

(3)启动培养：将步骤(2)中冷藏处理后的种子转移至新鲜的启动培养基中，在组织培养室中培养2-3周，直到种子萌发；培养环境如下：温度23±2℃，16h光照/8h黑暗，光照强度2500lux-3000lux；

(4)分化培养：将步骤(3)中萌发的无菌苗的上部子叶和/或嫩茎接种至分化培养基上，诱导形成不定芽；

(6)生根培养：将步骤(5)中形成的丛生芽，剪切接种至生根培养基中，进行生根培养；

(7)移栽与炼苗：将步骤(6)中获得的生根苗，移栽至含10％珍珠岩的草炭土基质中，罩瓶炼苗1周后，正常培养。

7.根据权利要求1-2、4任一项所述的方法，其特征在于，所用杏梅种子来源于杏梅品种‘淡丰后’自交授粉所结果实。