CN102657095A - 一种人参高效组织培养和再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为生物技术，特别是涉及一种使人参经过长时间多次继代培养后仍能保持分化再生能力技术的方法。是以人参的特定组织为外植体，其中特别以茎节为外植体产生的愈伤组织效率最高，在经过优化的以MS培养基为主的培养体系中，经过诱导产生愈伤组织，这种愈伤组织可以在继代培养基上长期旺盛生长，继代。这种愈伤组织大量产生可供制药使用的多种人参次生代谢产物——人参皂甙、甾醇、多糖等。而且经过长期继代培养之后的愈伤组织，在转换培养条件为再生培养基时，仍能保持高效率的芽和根再生能力，并产生大量完整再生植株，可以在到土壤中继续栽种。
Description
技术领域
[0001]
本发明为生物技术，特别是涉及一种人参高效组织培养和再生的方法。
背景技术
植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论，在近几十年来发展起来的一项无性繁殖新技术。植物的组织培养又称为离体培养，是指从植物体分离出符合需要的组织、器官、细胞或原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其它产品的技术，也指在培养过程中从各种器官脱分化产生愈伤组织，愈伤组织经过再分化形成再生植物的过程。
自从1958年，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部细胞进行培养，最终获得了完整的可育再生植株，从而证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言，已有大量植物已经可以通过组织培养技术获得再生植株。
植物组织培养技术，需要以植物体的某种组织或细胞为材料，在合适的培养基（诱导培养基）上进行培养，培养的组织或细胞一般脱分化形成愈伤组织，经过继代培养，在合适的培养基（分化培养基）上，分化出芽、根等器官，进而形成可以脱离培养基独立生活的完整再生植株。某些植物组织在组织培养过程中，在合适的培养条件下，可以不经过愈伤组织诱导阶段，直接形成体细胞胚胎，随后分化形成完整的再生植株。
不同植物的组织培养，以及同种植物组织培养的不同阶段，需要不同种类的基本培养基及激素。基本培养基中含有各种大量元素、微量元素、有机物质（维生素、氨基酸等）、碳源等，常用的基本培养基有MS、B5、N6等。激素包括植物生长素类[如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等]、细胞分裂素[如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）]以及赤霉素[赤霉酸（GA3）]。
MS培养基是一种常用的植物组织培养基，可广泛适用于多种植物的组织培养，其基本组成为：
硝酸钾(KNO3) 1900mg/L，硝酸铵(NH4NO3) 1650mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)
170mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)
370mg/L，氯化钙(CaCl2•2H2O) 440mg/L，硫酸锰(MnSO4•4H2O)
22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO4•4H2O)
8.6mg/L，硼酸(H3BO3)
6.2mg/L，碘化钾(KI) 0. 83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4•2H2O) 0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4•5H2O) 0. 025mg/L，氯化钴(CoCl2•6H2O) 0. 025mg/L，硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)
27.8mg/L，Na2-EDTA
37.3mg/L，甘氨酸
2mg/L，盐酸硫胺素(Thiamine HCl)
0.1mg/L，盐酸吡哆醇(Pyridoxine HCl) 0. 5mg/L，烟酸(Nicotinic acid) 0. 5mg/L，肌醇(Inositol) 100mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂8000mg/L。
发明内容
发明内容
本发明提供了一种人参(Panax
ginseng)高效组织培养、再生的方法。是以人参植株的任何组织为外植体，其中特别以茎节为外植体产生的愈伤组织效率最高，经过诱导产生愈伤组织，这种愈伤组织可以在继代培养基上长期旺盛生长，至少能够继代、扩大培养100次以上，这种愈伤组织大量产生可供制药使用的多种人参次生代谢产物——人参皂甙、甾醇、多糖等。而且经过长期继代培养之后的愈伤组织，在转换培养条件为再生培养基时，仍能保持高效率的芽和根再生能力，并产生大量完整再生植株，可以在到土壤中继续栽种。
采用组织培养方法，从人参成株取材，经过组织培养产生愈伤组织，可以长期继代产生大量愈伤组织；此种愈伤组织依次在适当的再生、生根培养基上培养后，可以产生大量再生植株，作为种苗在土壤中栽种。
取人参成株的任意组织（其中以茎节的愈伤组织诱导和植株再生效率最高）作为外植体，经过灭菌、接种到诱导培养基，一周后可以得到愈伤组织；此后每三周进行一次转接到继代培养基的继代培养，使愈伤组织的产量不断扩大。应用本发明的培养方法，可以使愈伤组织在多次继代后，仍能保持旺盛的愈伤组织形成能力，以及较高的再生能力，当把愈伤组织转移到诱导培养基上后，经过一段时间的诱导，可以从愈伤组织上产生大量绿点，随后从绿点上分化出不定芽，形成芽丛，待芽丛生长到展开1厘米以上的幼叶时，将带有幼叶的愈伤组织块从诱导培养基上转接到生根培养基，培养后从幼叶基部的愈伤组织中长出根，形成再生植株；在生根培养基中生长到合适大小的幼苗，可以经过炼苗后移栽到土壤中，成为可以独立生活的植株。
所用的愈伤组织诱导培养体系为：MS基本培养基+CH
(5-500mg/L) + 2,4-D(0.1-20mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA(0.1-5mg/L)；所用的继代培养体系为MS基本培养基 + CH(5-500mg/L)
+ 2,4-D(0.1-10mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA (0.1-5mg/L)+KT(0.1-1mg/L)；分化培养体系为1/4MS基本培养基 + CH(5-500mg/L)
+ NAA (0.5-10mg/L) + 6-BA (0.1-5mg/L) + KT (0.1-1mg/L)。
有益效果：
本发明提供了一种利用组织培养技术，大量、长期生产人参愈伤组织的方法，可用于从愈伤组织中提取人参活性物质作为制药原料，以及珍稀人参种质的保藏。采用本发明方法培养人参获得的愈伤组织，可以长期保持其再分化能力（达10年以上），当把这种愈伤组织转移到再生培养基上时，还能有较强的再生能力，可以形成大量与原始取材植株性状一致的再生植株，用做人参栽培种苗。
附图说明
图1 为人参愈伤组织。以人参的任意组织为外植体，经过诱导培养后约10天后即可产生愈伤组织，其后经过两次继代培养（每次间隔21天），产生大量乳黄色、致密的颗粒状愈伤组织。
图2 为完整人参再生植株：将再生芽生长到1厘米以上的幼苗，转移到生根培养基中，约7天后可见在长出幼苗的基部与培养基交接处出现根组织，再过约30天的生根培养，即可长成如图所示根长度1厘米以上的完整再生植株，这种幼苗可以移栽到土壤中继续生长。
图3 为移栽到土中成活的人参再生植株。在生根培养基上的幼苗，生长到具有2片以上叶片、至少5条长度3厘米以上的根时，可以再经过炼苗7-10天，然后移栽到土壤中，成为可以独立生活的植株。
具体实施方式
采用组织培养方法， 取人参成株的任意组织（其中以茎节的愈伤组织诱导和植株再生效率最高）作为外植体，经过灭菌、接种到诱导培养基，得到愈伤组织；此后多次转接到继代培养基中进行继代培养，使愈伤组织的产量不断扩大。应用本发明培养方法产生的愈伤组织，在多次继代后，仍能保持旺盛的愈伤组织形成能力和较高的再生能力，在需要产生人参再生植株时，把愈伤组织转移到诱导培养基上培养，从愈伤组织上产生大量绿点，然后形成不定芽丛，将带有芽丛的愈伤组织块转接到生根培养基，在幼叶基部的愈伤组织中长出根，即形成再生植株；在生根培养基中生长到合适大小的再生植株，经过炼苗后移栽到土壤中，成为可以独立生活的植株。
具体步骤如下：
愈伤组织的诱导及继代：取人参的任意组织，在超净台中用锋利刀片切成3-5毫米大小的组织块，放入50毫升三角瓶中，用70%酒精浸泡30秒、0.1%升汞灭菌10分钟，然后用无菌蒸馏水彻底漂洗5-6遍。用无菌镊子将组织块转移到成有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，置于25℃培养箱中暗培养。每3周进行一次继代培养，在超净台中用无菌镊子将生长旺盛的愈伤组织从原瓶中转移到有新鲜继代培养基的三角瓶中，然后继续25℃暗培养。
植株再生：在愈伤组织继代培养2次之后的任何时候，可以取愈伤组织进行分化，本发明目前所用的愈伤组织于10年前诱导出、已经继代超过100代，仍能保持较高的完整植株再生频率。在超净台中用无菌镊子将愈伤组织块从继代培养基上取出，转移到含有分化培养基（芽再生培养基）的三角瓶中，在培养箱中25℃光培养（光周期16小时光照+8小时黑暗，光照强度3000Lux）。约10天以后，可见愈伤组织部分突起处出现绿色芽点，此后芽点不断生长、延长，约2-3周后变成幼芽。将幼芽在无菌条件下转移到含有生根培养基的三角瓶中，继续光培养，约7天后可见幼苗的基部与培养基交接处出现根组织，再过约30天的生根培养，即可长成根长度1厘米以上的完整再生植株。
炼苗及移栽：打开三角瓶的封口膜，将三角瓶连同里面的幼苗在培养箱中放置3天，然后将它们放入即将栽种幼苗的温室中3天炼苗。将幼苗完整地从培养基中取出，小心地除去附着在上面的愈伤组织和培养基碎块，并用蒸馏水反复冲洗干净，然后将幼苗栽入灭菌营养土中，注意保持环境湿度和洁净度，2-3周后幼苗即可成活。
材料：
组织培养所用的人参外植体可以为人参的任意组织，其中以茎节的诱导、再生效果最好。
所用的愈伤组织诱导培养体系为：MS基本培养基+CH (5-500mg/L)
+ 2,4-D(0.1-20mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA(0.1-5mg/L)；所用的继代培养体系为MS基本培养基 + CH(5-500mg/L)
+ 2,4-D(0.1-10mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA (0.1-5mg/L)+KT(0.1-1mg/L)；分化培养体系为1/4MS基本培养基 + CH(5-500mg/L)
+ NAA (0.5-10mg/L) + 6-BA (0.1-5mg/L) + KT (0.1-1mg/L)。
[0014]
植物组织基本培养基配制：按照下表中的各种元素含量配制MS基本培养基
| 大量元素 | 使用浓度 (mg/L) |
| 硝酸钾 KNO3 | 1900 |
| 硝酸铵 NH4NO3 | 1650 |
| 磷酸二氢钾 KH2PO4 | 170 |
| 硫酸镁 MgSO4·7H2O | 370 |
| 氯化钙 CaCl2·2H2O | 440 |
| 微量元素 | |
| 碘化钾 KI | 0.83 |
| 硼酸 H3BO3 | 6.2 |
| 硫酸锰 MnSO4·4H2O | 22.3 |
| 硫酸锌 ZnSO4·7H2O | 8.6 |
| 钼酸钠 Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| 硫酸铜 CuSO4·5H2O | 0.025 |
| 氯化钴 CoCl2·6H2O | 0.025 |
| 铁盐 | |
| 乙二胺四乙酸二钠 Na2·EDTA | 37.25 |
| 硫酸亚铁 FeSO4·7H2O | 27.85 |
| 有机成分 | |
| 肌醇 | 100 |
| 甘氨酸 | 2 |
| 盐酸硫胺素 VB1 | 0.1 |
| 盐酸吡哆醇 VB6 | 0.5 |
| 烟酸 VB5 或 VPP | 0.5 |
| 蔗糖 sucrose | 30g/L |
| 琼脂 agar | 8g/L |
愈伤组织诱导培养基的配制：在MS基本培养基中，添加以下成分2,4-D(0.1-20mg/L)、6-BA(0.1-5mg/L)以及NAA(0.1-5mg/L)。
继代培养基的配制：在MS基本培养基中，添加以下成分CH(5-500mg/L)、 2,4-D(0.1-10mg/L)、6-BA(0.1-5mg/L)、NAA (0.1-5mg/L)及KT(0.1-1mg/L)。
芽再生培养基的配制：在1/4 MS基本培养基中，添加以下成分CH(5-500mg/L)、NAA (0.5-10mg/L) 、6-BA
(0.1-5mg/L)及KT (0.1-1mg/L)。
生根培养基的配制：在1/4MS基本培养基中加入CH(5-500mg/L)、NAA (0.1-5mg/L)、6-BA
(0.1-5mg/L)及KT (0.1-1mg/L)。
Claims (5)
1. 一种人参高效组织培养和再生的方法，其特征是具体步骤如下：
1）.愈伤组织的诱导及继代：取人参的任意组织，在超净台中用锋利刀片切成3-5毫米大小的组织块，放入三角瓶中，用70%酒精浸泡、0.1%升汞灭菌，然后用无菌蒸馏水彻底漂洗5-6遍。
2.将组织块转移到成有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，置于25℃培养箱中暗培养，每3周进行一次继代培养，在超净台中生长旺盛的愈伤组织从原瓶中转移到有新鲜继代培养基的三角瓶中，然后继续25℃暗培养；
2).植株再生：在愈伤组织继代培养2次之后的任何时候，可以取愈伤组织进行分化，在超净台中将愈伤组织块从继代培养基上取出，转移到含有分化培养基即芽再生培养基的三角瓶中，在培养箱中25℃光培养，即光周期16小时光照+8小时黑暗，光照强度为3000Lux，10天以后，可见愈伤组织部分突起处出现绿色芽点，约2-3周后变成幼芽，将幼芽在无菌条件下转移到含有生根培养基的三角瓶中，继续光培养， 7天后可见幼苗的基部与培养基交接处出现根组织，再过约30天的生根培养，即可长成根长度1厘米以上的完整再生植株。
3. 3）.炼苗及移栽：打开三角瓶的封口膜，将三角瓶连同里面的幼苗在培养箱中放置3天，然后将它们放入即将栽种幼苗的温室中3天炼苗，将幼苗完整地从培养基中取出，小心地除去附着在上面的愈伤组织和培养基碎块，并用蒸馏水反复冲洗干净，然后将幼苗栽入灭菌营养土中，保持环境湿度和洁净度，2-3周后幼苗即可成活；
组织培养所用的人参外植体为人参的任意组织，其中以茎节的诱导、再生效果好。
4.所用的愈伤组织诱导培养体系为：MS基本培养基+CH (5-500mg/L) +
2,4-D(0.1-20mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA(0.1-5mg/L)；所用的继代培养体系为MS基本培养基 + CH(5-500mg/L) +
2,4-D(0.1-10mg/L)+6-BA(0.1-5mg/L)+NAA (0.1-5mg/L)+KT(0.1-1mg/L)；分化培养体系为1/4MS基本培养基 + CH(5-500mg/L) + NAA
(0.5-10mg/L) + 6-BA (0.1-5mg/L) + KT (0.1-1mg/L)。
5. 植物组织基本培养基配制：按照下表中的各种元素含量配制MS基本培养基
愈伤组织诱导培养基的配制：在MS基本培养基中，添加以下成分2,4-D(0.1-20mg/L)、6-BA(0.1-5mg/L)以及NAA(0.1-5mg/L)；
继代培养基的配制：在MS基本培养基中，添加以下成分CH(5-500mg/L)、 2,4-D(0.1-10mg/L)、6-BA(0.1-5mg/L)、NAA (0.1-5mg/L)及KT(0.1-1mg/L)；
芽再生培养基的配制：在1/4 MS基本培养基中，添加以下成分CH(5-500mg/L)、NAA (0.5-10mg/L) 、6-BA (0.1-5mg/L)及KT (0.1-1mg/L)；
生根培养基的配制：在1/4MS基本培养基中加入CH(5-500mg/L)、NAA (0.1-5mg/L)、6-BA (0.1-5mg/L)及KT (0.1-1mg/L)。
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| PB01 | Publication | ||
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Granted publication date: 20140115 Termination date: 20170525 |