CN103651144A - 一种杨梅快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杨梅快速繁殖的方法,包括以下步骤:1)外植体的选取;2)外植体消毒;3)初始诱导培养;4)愈伤组织诱导;5)分化和增殖培养;6)生根培养。按上述方法繁殖杨梅既有效解决杨梅组织培养中外植体污染率高的问题,又可实现杨梅组培苗的大量快速繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及植物快速繁殖技术领域,尤其是杨梅快速繁殖技术领域。
背景技术
目前,杨梅多采用嫁接繁育来进行生产栽培,这繁育技术提高品种的纯度,保持了品种特性,但成活率较低及繁殖速度较慢,制约了杨梅产业的发展。而组织培养育苗技术既可以保持种的纯度和特性,也可以降低生产成本,提高繁殖速度和成活率。杨梅的组织培养目前很少有人报道,究其原因主要还是由于杨梅外植体培养时,灭菌不易,愈伤组织诱导容易褐化,特别是叶片、茎等部位均含有多种次生代谢产物,抑制其分化及愈伤组织诱导,因此,组织培养很难取得成功。
中国专利ZL201010603448.4涉及到一种以芽苗途径获得杨梅再生植株的方法:以杨梅茎为外植体,诱导产生芽,在此基础上伸长后诱导生根,但这一方法诱导周期长,繁殖量小。
现有技术中尚无经愈伤组织途径获得杨梅再生植株的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杨梅快速繁殖的方法,经愈伤组织途径获得杨梅丛生芽,诱导生根,既有效解决杨梅组织培养中外植体污染率高的问题,又可实现杨梅组培苗的大量快速繁殖。
为了解决上述技术问题,本发明提出下列技术方案:
一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述的方法包括以下步骤:
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理30-45min,然后以自来水冲洗10-20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒,0.1%升汞溶液中处理5-7分钟,然后以无菌水冲洗4-5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;培养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12-18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15-20d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗3-5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可;
所述的WPM培养基配方为:大量元素:硝酸铵NH4NO3400mg/L,硫酸钾K2SO4900mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L;四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L;微量元素:硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;
所述的MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO31900mg/L,硝酸铵NH4NO31650mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L;微量元素:碘化钾KI0.83mg/L,硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L,氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素0.5mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;蔗糖30g/L,琼脂粉7g/L,pH为5.7;
所述的1/2MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO3950mg/L,硝酸铵NH4NO3825mg/L,磷酸二氢钾KH2PO385mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O220mg/L;
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤;
所述的NAA为α-萘乙酸;
所述的IBA为吲哚-3-丁酸;
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
步骤3)中初始诱导培养基为:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
步骤4)中愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
步骤5)中分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
步骤6)中生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
采用本发明繁殖杨梅,既有效解决杨梅组织培养中外植体污染率高的问题,又可实现杨梅组培苗的大量快速繁殖,为杨梅生产栽培和品种改良奠定基础。
试验表明,采用愈伤组织途径所得杨梅试管苗的移栽成活率明显高于采用芽苗途径者,其效果可以通过下列试验证明。
试验1不同途径所得试管苗的移栽成活率比较
一、材料和方法
1、材料:
愈伤组织苗(简称SM),按实施例3制备;
芽苗(简称YM),按下列方法制备:
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的20KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理30-45min,然后以自来水冲洗10-20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒,0.1%升汞溶液中处理5-7分钟,然后以无菌水冲洗4-5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;培养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12-18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+PVP5mg/L;
4)新芽伸长培养:将长出新芽的外植体茎段剪去发黑端部后转插入新芽伸长和增殖培养基中,培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;培养21d后,新芽伸长到≥0.5cm。新芽伸长和增殖培养基组成为:WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+GA30.4mg/L+PVP800mg/L。
5)增殖培养:将步骤4)新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中,培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;培养30d后,至新芽长出并伸长到1cm以上。培养基组成同步骤4)。
6)生根培养:将步骤5)的新芽剪下,转接到生根培养基中,培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;培养20d后,生出新根。生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L。
2、方法
将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗3-5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可,2周后考察试管苗在苗床上的成活率。
愈伤组织苗(SM)、芽苗(YM)平行试验;
共试验三次。
3、结果
试验结果见表1,结果表明,SM的存活率明显高于YM。表明采用愈伤组织培养而得的试管苗比采用新芽培养而得的试管苗更易被驯化。现有技术中,并没有类似的启示,本发明取得了预料不到的技术效果。
表1不同途径所得试管苗的移栽成活率比较
为了更好的阐述技术方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明,但本发明所要求的保护范围不限于下列实施例。
具体实施方式
实施例1
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的20KHZ超声波清洗中保持温度30℃处理30min,然后以自来水冲洗10min;随后在超净工作台上以70%的酒精消毒25秒,0.1%升汞溶液中处理5分钟,然后以无菌水冲洗4遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强2500Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃;培养4d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+PVP5mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+PVP5mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+PVP5mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15d后生根,培养条件为光强1800Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1mg/L+PVP5mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗3d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
实施例2
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的25KHZ超声波清洗中保持温度35℃处理45min,然后以自来水冲洗20min;随后在超净工作台上以75%的酒精消毒35秒,0.1%升汞溶液中处理7分钟,然后以无菌水冲洗5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强3500Lx、光周期14h/d,温度25℃±2℃;培养6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+PVP10mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+PVP10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强2500Lx、光周期14h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+PVP10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养20d后生根,培养条件为光强2500Lx、光周期14h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L+PVP10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
实施例3
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理45min,然后以自来水冲洗15min;随后在超净工作台上以75%的酒精消毒35秒,0.1%升汞溶液中处理6分钟,然后以无菌水冲洗5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;培养5d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养16d至新芽长出;所述的初始诱导培养基为:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养18d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养22d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强2000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养18d后生根,培养条件为光强2000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗4d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可。
Claims (5)
1.一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述的方法包括以下步骤:
1)外植体的选取:取当年生直径2-5mm的杨梅枝条为外植体,剪去叶片后剪成2-3cm的茎段;
2)外植体消毒:将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗中保持温度30-35℃处理30-45min,然后以自来水冲洗10-20min;随后在超净工作台上以70-75%的酒精消毒25-35秒,0.1%升汞溶液中处理5-7分钟,然后以无菌水冲洗4-5遍,置于无菌培养皿备用;
3)初始诱导培养:将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm,茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养,培养条件为光强2500-3500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;培养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中,并继续培养12-18d至新芽长出;所述的初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L;
4)愈伤组织诱导:取初始诱导培养中的芽,放入愈伤组织诱导培养基中培养15-20d,条件为暗培养,温度20℃±2℃;所述愈伤组织培养基为:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
5)分化和增殖培养:将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d,增殖产生大量丛生苗,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;所述分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
6)生根培养:将5)步骤中的丛生苗切割成单个,转移至生根培养基中培养15-20d后生根,培养条件为光强1800-2500Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃;所述生根用培养基为:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L;
7)炼苗和移栽:将有生根的杨梅幼苗的培养基瓶盖打开,室温下炼苗3-5d后,取出幼苗,洗去根部培养基,移栽装有河沙基质的苗床上,保持温度20-25℃,湿度85%-95%,适当遮荫即可;
所述的WPM培养基配方为:大量元素:硝酸铵NH4NO3400mg/L,硫酸钾K2SO4900mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O96mg/L;四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O556mg/L;微量元素:硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.5mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.3mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;
所述的MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO31900mg/L,硝酸铵NH4NO31650mg/L,磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L;钙盐:氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L;微量元素:碘化钾KI0.83mg/L,硼酸H3BO36.2mg/L,硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L,硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L,钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L,氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L;铁盐:乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L;有机酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素0.5mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L;蔗糖30g/L,琼脂粉7g/L,pH为5.7;
所述的1/2MS培养基配方为:大量元素:硝酸钾KNO3950mg/L,硝酸铵NH4NO3825mg/L,磷酸二氢钾KH2PO385mg/L,硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L;余同上述MS培养基;
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤;
所述的NAA为α-萘乙酸;
所述的IBA为吲哚-3-丁酸;
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤3)中初始诱导培养基组成为:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
3.根据权利要求1所述一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤4)中愈伤组织培养基为:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
4.根据权利要求1所述一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤5)中分化和增殖培养用培养基为:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
5.根据权利要求1所述一种杨梅快速繁殖的方法,其特征在于所述步骤6)中生根用培养基为:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
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