CN104054577B - 一种白花杜鹃组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白花杜鹃的组织培养方法，所述的方法包括：1)外植体的选取，2)外植体消毒，3)初始诱导培养，4)增殖培养，5)生根培养，6)炼苗和移栽。采用本方法繁育白花杜鹃，可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是白花杜鹃组织培养技术领域。
背景技术
白花杜鹃(Rhododendron mucronatum(Bl.)G.Don)，为杜鹃花科植物，半常绿灌木，高1—3米；幼枝开展，分枝密，密被灰褐色开展的长柔毛，混生少数腺毛。幼枝、叶、花柄，子房被褐色粗伏毛或有腺毛。叶二型，叶椭圆形至椭圆状披针形，长3—5厘米，宽1—2厘米，顶端钝而有小而短尖头，基部楔形；叶上表面深绿色，疏被灰褐色贴生长糙伏毛，混生短腺毛，中脉、侧脉及细脉在上面凹陷，在下面凸出或明显可见；叶柄长2-4毫米，密被灰褐色扁平长糙伏毛和短腺毛。花1—3朵，顶生，有芳香；萼片披针形，长约1.5厘米，有腺毛，宿存；花冠纯白色，有时有淡蔷薇色或有条纹，宽钟状或宽漏斗形，长3.5—5厘米，5裂，裂片卵状椭圆形；雄蕊10，有时8，近基部有腺毛。蒴果长约l厘米，短于花萼。花期4—5月。
本种分布于华东及日本，在日本经长期栽培后已部分引入中国；半常绿灌木。暖地为常绿。
白花杜鹃枝干优美，花期长，为优良的园林绿化植物。
白花杜鹃还具有较大的经济价值，常常被作为药物使用。
目前，白花杜鹃多采用嫁接繁育来进行生产栽培，这繁育技术提高品种的纯度，保持了品种特性，但成活率较低及繁殖速度较慢，制约了白花杜鹃产业的发展。而组织培养育苗技术既可以保持种的纯度和特性，也可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
现有技术中，尚无白花杜鹃的组织培养方法的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种白花杜鹃组织培养的方法，可实现白花杜鹃快速大量繁殖。
为了解决上述技术问题，本发明提出下列技术方案：
一种白花杜鹃组织培养的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的白花杜鹃枝条为外植体，剪去叶片后剪成2-3cm的茎段；
2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min；随后在超净工作台上以70-75％的酒精消毒25-35秒，0.1％升汞溶液中处理5-7分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养6-8d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12-18d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.3-0.6mg/L+NAA0.1-0.3mg/L；
4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃；培养20d后，至新芽长出并伸长到1cm以上；所述的培养基组成MS+6-BA0.4-0.6mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+IBA0.8-1.2mg/L+KT0.8-1.2mg/L。
5)生根培养：将步骤4)的新芽剪下，转接到生根培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃；培养15d后，生出新根；生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.2-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
6)炼苗和移栽：将有生根的白花杜鹃幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度70％-80％，适当遮荫即可；
所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO31900mg/L，硝酸铵NH4NO31650mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L；微量元素：碘化钾KI0.83mg/L，硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH为5.7；
所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO3950mg/L，硝酸铵NH4NO3825mg/L，磷酸二氢钾KH2PO385mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L；余同上述MS培养基；
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；
所述的NAA为α-萘乙酸；
所述的IBA为吲哚-3-丁酸；
所述的KT为激动素；
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
优选的，所述步骤3)中初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。
优选的，所述步骤4中分化和增殖培养用培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+IBA1.0mg/L+KT1.0mg/L。
优选的，所述步骤6)中生根用培养基为：1/2MS+IBA0.4mg/L+PVP8mg/L。
采用本发明繁殖白花杜鹃，可实现白花杜鹃组培苗的大量组织培养，为白花杜鹃生产栽培和品种改良奠定基础。
为了更好的阐述技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明所要求的保护范围不限于下列实施例。
具体实施方式
实施例1
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的白花杜鹃枝条为外植体，剪去叶片后剪成2-3cm的茎段；
2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗中保持温度30℃处理30min，然后以自来水冲洗10min；随后在超净工作台上以70％的酒精消毒25秒，0.1％升汞溶液中处理5分钟，然后以无菌水冲洗4遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养8d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养18d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L；
4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃；培养20d后，至新芽长出并伸长到1cm以上；所述的培养基组成MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.8mg/L+KT0.8mg/L。
5)生根培养：将步骤4)的新芽剪下，转接到生根培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃；培养15d后，生出新根；生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP5mg/L；
6)炼苗和移栽：将有生根的白花杜鹃幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度70％-80％，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为82.3％。
实施例2
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的白花杜鹃枝条为外植体，剪去叶片后剪成2-3cm的茎段；
2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗中保持温度35℃处理45min，然后以自来水冲洗20min；随后在超净工作台上以75％的酒精消毒35秒，0.1％升汞溶液中处理7分钟，然后以无菌水冲洗5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.3mg/L；
4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃；培养20d后，至新芽长出并伸长到1cm以上；所述的培养基组成MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+IBA1.2mg/L+KT1.2mg/L。
5)生根培养：将步骤4)的新芽剪下，转接到生根培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃；培养15d后，生出新根；生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.5mg/L+PVP10mg/L；
6)炼苗和移栽：将有生根的白花杜鹃幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度70％-80％，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为81.6％。
实施例3
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的白花杜鹃枝条为外植体，剪去叶片后剪成2-3cm的茎段；
2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗中保持温度35℃处理35min，然后以自来水冲洗15min；随后在超净工作台上以75％的酒精消毒35秒，0.1％升汞溶液中处理7分钟，然后以无菌水冲洗5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养7d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养15d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；
4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃；培养20d后，至新芽长出并伸长到1cm以上；所述的培养基组成MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+IBA1.0mg/L+KT1.0mg/L。
5)生根培养：将步骤4)的新芽剪下，转接到生根培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃；培养15d后，生出新根；生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.4mg/L+PVP8mg/L；
6)炼苗和移栽：将有生根的白花杜鹃幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度70％-80％，适当遮荫即可。
经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为85.3％。
Claims (4)
1.一种白花杜鹃组织培养的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
1)外植体的选取：取当年生直径2-5mm的白花杜鹃枝条为外植体，剪去叶片后剪成2-3cm的茎段；
2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗机中保持温度30-35℃处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min；随后在超净工作台上以70-75％的酒精消毒25-35秒，0.1％升汞溶液中处理5-7分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养皿备用；
3)初始诱导培养：将灭菌后的外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10-14h/d,温度25℃±2℃；培养6-8d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12-18d至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.3-0.6mg/L+NAA0.1-0.3mg/L；
4)增殖培养：将步骤3)培养出的新芽剪下并转接到新芽伸长和增殖培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期10h/d,温度25℃±2℃；培养20d后，至新芽长出并伸长到1cm以上；所述的新芽伸长和增殖培养基组成为MS+6-BA0.4-0.6mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+IBA0.8-1.2mg/L+KT0.8-1.2mg/L；
5)生根培养：将步骤4)的培养出的新芽剪下，转接到生根培养基中，培养条件为光强2500-3000Lx、光周期12h/d,温度25℃±2℃；培养15d后，生出新根；生根培养基的配方为1/2MS+IBA0.2-0.5mg/L+PVP5-10mg/L；
6)炼苗和移栽：将有生根的白花杜鹃幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽至装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度70％-80％，适当遮荫即可；
所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO31900mg/L，硝酸铵NH4NO31650mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L；微量元素：碘化钾KI0.83mg/L，硼酸H3BO36.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25mg/L,硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.85mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH为5.7；
所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KNO3950mg/L，硝酸铵 NH4NO3825mg/L，磷酸二氢钾KH2PO385mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L；余同上述MS培养基；
所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；
所述的NAA为α-萘乙酸；
所述的IBA为吲哚-3-丁酸；
所述的KT为激动素；
所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述一种白花杜鹃组织培养的方法，其特征在于所述步骤3)中初始诱导培养基组成为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。
3.根据权利要求1所述一种白花杜鹃组织培养的方法，其特征在于所述步骤4)中新芽伸长和增殖培养用培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+IBA1.0mg/L+KT1.0mg/L。
4.根据权利要求1所述一种白花杜鹃组织培养的方法，其特征在于所述步骤5)中生根培养基为：1/2MS+IBA0.4mg/L+PVP8mg/L。
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