CN106106173B - 一种双相组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双相组织培养方法，包括以下步骤：(1)选无病虫害的植株，取枝条中部的茎干；(2)步骤(1)所得茎干在流水里冲洗后，消毒灭菌，待接种；(3)双相培养基配制：下层为固体培养基，上层为液体培养；下层采用1/2MS+2‑iP4mg/L+IBA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，上层不加琼脂，其他成分和下层一样；配制时先配制下层，在下层凝固时，将配制好的上层液体培养基在无菌条件下倒入培养瓶中；(4)培养条件：将步骤(2)所得茎干接种于培养瓶内，在环境温度20℃下，光照4000lx、每天16小时光照条件下进行培养。相对于现有技术，本发明方法可以显著缩短组培时间，提高发芽率和增殖率，有效扩大繁殖系数，并且可持续性增强。

Description

一种双相组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种双相组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
组织培养法是现在最基本的快速扩繁方法，可以在短时间内生产出几十万或几百万株苗木。但现有的方法培养基基本上是单层的，植株吸收的养分或激素也只能是单一层面上的，并且扩繁系数低，增殖率不高，可持续性不强。
目前，现有技术中也有双相组织培养方法的研究，但是仍然存在一定缺陷，如生根效果不够理想，增殖率差，并且工艺复杂，需要单层加双相多步骤培养，时间长，成本高。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种双相组织培养方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供了一种双相组织培养方法，包括以下步骤：
(1)在晴天选无病虫害的植株，取枝条中部的茎干，每段茎干带一个芽，节上下各留1cm，洗净灰尘，再用自来水冲洗；
(2)步骤(1)所得茎干在流水里冲洗后，再用70％酒精浸泡30s，用无菌水洗，然后用0.1％的升汞灭菌6min，再用无菌水洗，待接种；
(3)双相培养基配制：下层为固体培养基，上层为液体培养；下层采用1/2MS+2-iP(2-异戊烯腺嘌呤)4mg/L+IBA(吲哚丁酸)1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，上层不加琼脂，其他成分和下层一样；配制时先配制下层，在下层凝固时，将配制好的上层液体培养基在无菌条件下倒入培养瓶中；
(4)培养条件：将步骤(2)所得茎干接种于培养瓶内，在环境温度20℃下，光照4000lx、每天16小时光照条件下进行培养。
作为优选，步骤(1)中所述植株为四季杜鹃、月季、微型月季、八仙花、蓝莓等。
作为另一种优选，步骤(2)中所述各无菌水洗的次数为3次。
作为另一种优选，步骤(2)中所述流水里冲洗的时间为30min。
作为另一种优选，步骤(3)中所述上层液体培养基的高度小于等于1cm。
作为另一种优选，步骤(3)中所述培养瓶为玻璃管状的培养瓶。
本发明双相组培法是将培养基分上下两层，下层是固态培养基，上层是液态培养基，外殖体在下层有琼脂的培养基中，芽的分化较少，生长速度较慢，茎叶展开来后生伸长较缓，此时在上层的液体培养基中，新的腋芽发生，并接连依次分化；两层培养基里的成分可以进行调节，从而最大限度的提高植物的增殖率。有效扩大繁殖系数，使规模化、工厂化生产更加容易。此外，本发明方法只进行双相培养步骤，工序简单，节约时间。
技术效果：相对于现有技术，本发明方法具有以下优势：
1、缩短组培时间，使原来组培要一年出苗的可以6个月即可发根出苗；
2、在单层培养基基础上增殖率提高约12倍以上；
3、技术难度和以前一样，不会变得更复杂；
4、使组培可持续性增强，不用在外殖体没长到一定程度就换培养基。
附图说明
图1：本发明双相培养基示意图；
图2：本发明双相培养四季杜鹃生长情况；
图3：常规单层培养四季杜鹃生长情况。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体试验结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
实施例1
以四季杜鹃为例：
1、在晴天选无病虫害的植株，取枝条中部的茎干，每段茎干带一个芽，节上下各留1cm，用洗洁净洗净灰尘，再用自来水冲洗3次；
2、茎干在流水里冲洗30min后，再用70％酒精浸泡30s，再用无菌水洗3次，用0.1％的升汞灭菌6min，再用无菌水洗3次，待接种；
3、双相培养基配制：芽增殖培养基：下层采用1/2MS+2-iP 4mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，上层不加琼脂，其中激素、糖成分和下层一样；配制时先配制下层，下层和一般培养基一样方法配制，在下层凝固时，将配制好的液态培养基在无菌条件下倒入培养瓶中，上层的量不可过多，一般不超过1cm高。
4、培养条件：在环境温度20℃下，光照4000lx、每天16小时光照条件下进行培养。实施例2
与实施例1基本相同，不同之处采用的植株为月季植株。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处采用的植株为微型月季植株。
实施例4
与实施例1基本相同，不同之处采用的植株为八仙花植株。
实施例5
与实施例1基本相同，不同之处采用的植株为蓝莓植株植株。
实验例
按照本发明上述方法进行组织培养，在25d和60d时观察，对培养基的状况和茎叶的生长表现，观察培养过程中持续性的影响。
考察结果见下表1和表2。
单层培养为按照本发明实施例1方法，培养基为仅有所述下层固体培养基的单层培养基；
对照1组为按照本发明实施例1方法，不同之处为培养基中去掉2-iP；
对照1组为按照本发明实施例1方法，不同之处为培养基中去掉IBA；
表1各方法培养60d后发芽情况
组别 发芽率(％) 未发芽率(％) 死亡污染率(％)
单层培养 53.3 33.3 13.3
对照1组 51.7 23.3 25.0
对照2组 55.0 25.0 20.0
实施例1 85.0 11.7 3.3
实施例2 86.7 10.0 3.3
实施例3 85.0 13.3 1.7
由表1可见，与单层培养方法以及两个对照组相比较，本发明组织培养方法，能够显著提高植株的发芽率，降低未发芽率和死亡污染率。
表2各方法培养过程中状况观察
由上表2结果可得，单层培养基易干脱水，造成培养基和瓶壁容易脱离，所以一定时期后就要转到新培养基里继续让其生长，这样就会使外殖体增加受污染的机会，从而影响组培效率；而双相培养基由于上层是液态培养基，解决了单层培养基所带来的问题，使得组培变得更有可持续性。

Claims (4)

1.一种双相组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在晴天选无病虫害的植株，取枝条中部的茎干，每段茎干带一个芽，节上下各留1cm，洗净灰尘，再用自来水冲洗；所述植株为四季杜鹃；
(2)步骤(1)所得茎干在流水里冲洗后，再用70％酒精浸泡30s，用无菌水洗，然后用0.1％的升汞灭菌6min，再用无菌水洗，待接种；
(3)双相培养基配制：下层为固相培养基，上层为液相培养基；下层采用1/2MS+2-iP4mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，上层不加琼脂，其他成分和下层一样；配制时先配制下层，在下层凝固时，将配制好的上层液体培养基在无菌条件下倒入培养瓶中；所述上层液体培养基的高度小于等于1cm；
(4)培养条件：将步骤(2)所得茎干接种于培养瓶内，在环境温度20℃下，光照4000lx、每天16小时光照条件下进行培养。
2.根据权利要求1所述的双相组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述无菌水洗的次数均为3次。
3.根据权利要求1所述的双相组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述流水里冲洗的时间为30min。
4.根据权利要求1所述的双相组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养瓶为玻璃管状的培养瓶。
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