CN104041414B - 一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法 - Google Patents

一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种辣椒花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业技术领域。包括选取花蕾，花蕾消毒，花药接种，预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行辣椒花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。本发明可快速获得单倍体再生植株，出苗率高，为新品种选育提供有力的手段。

Description

一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法
技术领域：
本发明属农业领域，具体涉及一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法。
技术背景：
辣椒是重要的蔬菜作物之一，栽培普遍而广泛。辣椒杂种优势十分显著，目前多采用常规育种手段选育新品种，育种周期长，进展缓慢，未被利用的辣椒种质材料日益减少，种质资源匮乏。
花药培养是在单细胞水平上获得纯系的有效方法，是重要的育种辅助手段。花药培养能够快速固定和保存有利基因，可用于远缘杂交新类型的培育和稳定，以及选择特异性状，作为育种基础材料；花药培养，可快速实现高度遗传纯合性，缩短育种年限，提高育种效率，加快育种进程。
辣椒花药培养受材料基因型、花药发育时期、预处理、培养基成分和培养条件等因素的影响，导致辣椒花药培养的诱导率低，获得单倍体非常困难，生产上应用极少。
发明内容：
本发明目的在于针对背景技术提出的辣椒花药培养效率低问题，提供一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
(1)取花粉发育处于单核中后期的花药；
(2)接种至预处理培养基上，预处理；
(3)将预处理后的花药，在24℃～28℃条件下暗培养6～7d至花药顶端出现黄白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养20～30d获得愈伤组织；
(4)将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下分化培养至愈伤组织直径为1～2cm，然后转接至MS分化培养基继续培育获得再生植株；
(5)移栽。
所述的预处理培养基为MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6培养基。
所述预处理的过程为：置于4℃暗处理45～50h，再移至36℃处理120～150h。
所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
所述1/2MS分化培养基为1/2MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC(维生素C)+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；所述的MS分化培养基为MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L-1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L-1～10.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
本发明所述培养基中蔗糖和琼脂的浓度单位为质量百分比。
步骤(5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩(体积比2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30～35d后定植于棚室。
步骤(1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00～11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；然后依次用70％(体积百分比)乙醇溶液浸0.5min，6.0％次氯酸钠溶液(取市售次氯酸钠分析纯6.0ml加水定容至100ml)消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
本发明方法的最优选技术方案为：
(1)取花粉发育处于单核中后期的花药
取样：植株盛花期于晴天上午9:00～11:00采集花蕾。醋酸洋红染色法镜检鉴定花粉发育时期，选取花粉发育处于单核中后期的花蕾。
花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；超净工作台内，花蕾70％乙醇溶液浸0.5min，然后用6.0％的次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次，每次5min。无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
(2)接种至预处理培养基上，预处理
将取出的花药接种于预处理培养基上，Parafilm封口膜封口。花药壁组织与小孢子共培养，能提高愈伤组织的诱导频率。
所述的预处理培养基为MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6培养基。
预处理：接种后，置于4℃暗处理45～50h，再移至36℃处理120～150h。通过预处理可显著提高愈伤组织诱导频率。
(3)愈伤组织诱导：预处理后移至24℃～28℃组织培养室中暗培养。6～7d后花药顶端现黄白色组织，转接至愈伤组织诱导培养基上，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养获得愈伤组织。花药壁组织与小孢子共培养，能提高愈伤组织的诱导频率。
所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
(4)植株再生：培养20～30d后，将愈伤组织接种到1/2MS分化培养基上，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下培养。培养18～24d后，愈伤组织直径1～2cm，接种于MS分化培养基上进行培养；8～12d后愈伤组织周围可见黄绿色小点，并逐渐发育成小苗。
所述1/2MS分化培养基为1/2MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6；
所述的MS分化培养基为MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L-1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L-1～10.0mg·L-1VC+2％～3％蔗糖+0.6％～0.8％琼脂，pH5.8～6。
(5)移栽：移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩(体积比2:1)的穴盘；穴盘置于育苗棚内驯化，30～35d后定植于棚室。
染色体鉴定：采用染色体计数直接鉴定法，显微镜下观察统计根尖细胞中期染色体，进行再生植株染色体倍性检测。
本发明所述的方法，通过培养成分和培养条件的调节，降低愈伤组织褐化的发生，提高诱导频率。
本发明方法通过优化培养条件和培养基配方，显著提高了愈伤组织诱导率和植株再生的频率。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种辣椒花药培养技术，利用辣椒花药培养获得了单倍体再生植株。采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。
本发明中花药接种于培养基中进行预处理，花药壁组织与小孢子共培养，提高愈伤组织的诱导频率；愈伤诱导及分化培养基成分和培养条件的调节，降低了愈伤组织褐化的发生，提高了愈伤组织诱导和植株再生的频率。通过本发明的方法培育辣椒单倍体植株，其愈伤诱导率达到60％以上，出苗率达到80％以上，本发明可快速获得单倍体再生植株，出苗率高，为辣椒新品种选育提供更有效的手段。本发明的辣椒花药培养技术获得再生单倍体，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。
具体实施方式：
本实例以综合优良性状的杂交一代辣椒组合P1302、P1212作为试验材料，采用本发明方法获取了单倍体植株。实施过程如下：
一、取材
5月上旬，试材盛花期，于晴天上午10:00采集花蕾。醋酸洋红染色压片法镜检花药发育时期，选取处于单核中后期、蕾长5.5～6.5mm、花冠稍长于花萼的花蕾；适宜生长环境条件下，花芽分化后23～25d，即开花前6～8d花蕾。
二、消毒
(1)培养基灭菌与分装：60mm培养皿、三角瓶、固体培养基等121℃、1.1Mpa灭菌20min。超净工作台内分装，每一培养皿8ml培养基。
(2)花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗30min；超净工作台内，冲洗后的花蕾用70％(体积百分比)乙醇溶液浸0.5min，然后用6.0％次氯酸钠溶液(取市售次氯酸钠分析纯6.0ml加水定容至100ml)消毒15min，最后用无菌水冲洗4次，每次5min。无菌条件下，将花药从消毒的花蕾中完整剥离、取出，去除花丝。
三、预处理
将取出的花药接种于预处理培养基：MS+0.15mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1KT+3％(质量百分比)蔗糖+0.75％(质量百分比)琼脂，pH5.8；每一培养皿放入20枚花药，Parafilm封口膜封口。将接种后的花药培养皿置于4℃暗处理2d；然后移至36℃处理6d。
四、愈伤组织诱导
将预处理后的花药移至25℃组织培养室，暗培养；6d后花药顶端现黄白色愈伤组织约2mm时，接种于愈伤组织诱导培养基：MS+0.25mg·L-12,4-D+2.0mg·L-1KT+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000LX、光周期14h·d-1条件下培养，四周后愈伤组织0.3～0.5cm。
五、植株再生
将愈伤组织接种到1/2MS分化培养基：1/2MS+0.01mg·L-1NAA+5.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1VC(维生素C)+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，每瓶接入3～4个愈伤组织，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照4000LX、光周期16h·d-1条件下培养。三周后愈伤组织直径1～2cm，并可见白色根系，接种于MS分化培养基：MS+0.01mg·L-1NAA+7.0mg·L-1KT+10mg·L- 1VC+3％蔗糖+0.75％琼脂，pH5.8，置于昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照4000LX、光周期16h·d-1条件下培养；10d后愈伤组织周围可见黄绿色小点，并逐渐发育成小苗。
六、移栽：
移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50％多菌灵可湿性粉剂(市售)1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石、珍珠岩(体积比为2:1)的穴盘；穴盘置于育苗棚内驯化，30～35d后定植于棚室。
七、染色体鉴定：
对再生植株采用根尖压片法进行细胞染色体计数，检测再生植株染色体倍性；显微镜下根尖细胞中期染色体数目为n＝12，表明花药培养再生植株为单倍体。
该方法中，愈伤诱导率达到60％以上，出苗率达到80％以上。

Claims (4)

1.一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取花粉发育处于单核中后期的花药；
（2）接种至预处理培养基上，预处理；
（3）将预处理后的花药，在24℃～28℃条件下暗培养6~7d至花药顶端出现黄白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d-1条件下培养20~30d获得愈伤组织；
（4）将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d-1条件下分化培养至愈伤组织直径为1~2cm，然后转接至MS分化培养基继续培育获得再生植株；
（5）移栽；
所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.1mg·L-1～0.25mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1～3.0mg·L-1KT+2%～3%蔗糖+0.6%～0.8%琼脂，pH5.8～6；
所述1/2MS分化培养基为1/2MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+4.0mg·L-1～6.0mg·L-1KT+1.0mg·L-1～5.0mg·L-1VC+2%～3%蔗糖+0.6%～0.8%琼脂，pH5.8～6；所述的MS分化培养基为MS+0.01mg·L-1～0.02mg·L-1NAA+6.0mg·L-1～8.0mg·L-1KT+5.0mg·L-1～10.0mg·L-1VC+2%～3%蔗糖+0.6%～0.8%琼脂，pH5.8～6；
所述的预处理培养基为MS+0.1mg·L-1～0.2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1～1.0mg·L-1KT+2%～3%蔗糖+0.6%～0.8%琼脂，pH5.8～6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述预处理的过程为：置于4℃暗处理45～50h，再移至36℃处理120～150h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有体积比为2:1的灭菌蛭石和珍珠岩的穴盘；置于育苗棚内驯化30～35d后定植于棚室。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述单核中后期的花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00～11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20～30min；然后依次用70％乙醇溶液浸0.5min，6.0%次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3～4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
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