CN105028205A - 一种辣椒花药培养直接成苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种辣椒花药培养直接成苗方法，其步骤包括试材选定、选取花蕾、花蕾预处理、培养基制备与分装、花蕾消毒、剥取花药、花药培养与胚状体培养；其中，所述培养基分别由MS和SNGM两种基本培养基添加相同的外源物质所制得，外源物质为培养基重量3%的麦芽糖、0.8%的琼脂、0.25%的活性炭、4mg/L的NAA以及1～2mg/L的6-BA，所述的花药培养为两种培养基转移一次成苗法，并采用35℃高温刺激，连续暗培养，所述胚状体培养为弱光照培养。本发明对辣椒花药培养直接成苗所采取的方法步骤简单、实用，用时短，效率高，特别适用于辣椒育种工作，通过此方法成苗率高达6.5%。

Description

一种辣椒花药培养直接成苗的方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种辣椒花药培养直接诱导成苗的培养方法。

背景技术

辣椒（CapsicumannuumL.)是一种重要的蔬菜作物和调味品，属常异交植物，天然杂交率高，自然纯合速度慢。在辣椒育种工作中，自交系的选育需要进行隔离授粉，费工费时，通过自交分离选育纯系一般需要4～6代选择才能获得，且长期的自交易导致育种材料遗传退化。通过花药或小孢子离体培养获得单倍体途径是解决这一问题的方法之一。花药培养是人工产生单倍体的关键技术。通过花药培养单倍体途径加速亲本纯系的选育，提高亲本优异基因的聚合是目前辣椒育种的重要途径之一。由小孢子发育而来的再生植株只含有一套染色体，没有显性性状遮盖隐性性状的问题，可从表现型直接判断其基因型，是遗传分析的理想材料。单倍体基因组经染色体加倍，能在短时间产生完全纯合的二倍体应用于育种工作。

辣椒花药培养一般采用脱分化、再分化等愈伤组织诱导途径及生根壮苗等培养程序，步骤烦琐，诱导率低，再生成苗率低。经胚状体途径诱导产生单倍体植株的研究少有报道，并且从胚状体诱导产生单倍体植株的频率也并不乐观。因为许多胚状体不能正常的生长发育，或只产生根而不分化芽，成苗率低。

发明内容

本发明的目的在于，针对辣椒花药培养中难于通过胚状体途径获得单倍体植株的技术难题，提供一种辣椒花药培养通过胚状体直接成苗的培养方法，该方法能够快速稳定地获得大量单倍体植株。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种辣椒花药培养直接成苗方法，选取杂交一代辣椒品种，在开花盛期选取处于单核靠边期的花蕾，并装入自封袋中置于4℃环境中1～3d，然后对花蕾进行消毒并剥取花药，将所获得花药接种于培养基中进行花药培养形成胚状体，所述培养基是通过向基本培养基中添加外源物质所制得的，所述花药培养出现胚状体之后，进行胚状体培养，最终使其形成根叶芽俱全的再生植株；

其中，所述培养基的制作方法为：分别选择MS培养基和SNGM培养基作为两种基本培养基，其中以MS培养基为基本培养基制得M培养基，以SNGM培养基为基本培养基制得S培养基，M培养基和S培养基中添加的外源物质相同，均为各自培养基重量3%的麦芽糖、0.8%的琼脂、0.25%的活性炭、4mg/L的NAA以及1～2mg/L的6-BA，并且，M培养基和S培养基的pH均为6.0，再将M培养基和S培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60～70℃，对M培养基和S培养基分别进行分装，每100mL三角瓶中倒入30mL的M培养基或S培养基；

所述的花药接种与培养的方法为：

（1）花药接种：将所获得的花药接种在盛有M培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6枚花药，将三角瓶封口；

（2）花药培养：将上述接种后的三角瓶放在35℃的培养箱中暗培养，7d后，再将其进行光照培养，光照强度为2500Lx，温度为25℃，待三角瓶中的花药膨大后，将膨大的花药转接于S培养基中，然后置于25℃培养室中进行暗培养，至胚状体出现；

所述的胚状体培养方法为：对花药培养所产生的胚状体再进行弱光照培养，光照强度为2000Lx，每天光照10h，直至形成根叶芽俱全的再生植株。

进一步的，在选取单核靠边期花蕾时，每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。

其中，对所得花蕾进行消毒的方法为：先用流水冲洗花蕾30min，再用体积分数70%的酒精对花蕾表面消毒30s，之后用体积分数5%的次氯酸钠消毒12～15min，然后用无菌水冲洗4次，每次5min。

所述的剥取花药的方法为：在超净工作台上，在铺有无菌滤纸的消毒培养皿中用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第一，本发明对辣椒花药培养直接成苗所采取的方法步骤简单、实用，用时短，效率高，特别适用于辣椒育种工作，所采用的是两种培养基转移一次成苗法，并采用35℃高温刺激，连续暗培养，从而建立起一种辣椒花药培养直接成苗的新方法，通过此方法成苗率高达6.5%；

第二，本发明在两种培养基上完成花药膨大、不同时期胚状体的发育以及再生植株的获得，全程需要8周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程；

第三，先对花药进行35℃高温预培养，可以促使花药内离体小孢子完成从活体内配子体发育转向离体下的孢子体发育，即脱分化过程；

第四，选取膨大的花药从M培养基上转接到S培养基上，既保证了花药中小孢子的萌动，也保证了胚状体发育途径的顺利进行。

附图说明

图1是MS培养基组成成分一览表。

图2是SNGM培养基组成成分一览表。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明作进一步的说明。

实施例1：一种辣椒花药培养直接成苗方法，包括如下步骤：

（1）确定试材：取具有综合优良性状的杂交一代辣椒品种B19、B23作为试验材料；

（2）选取花蕾：在B19、B23开花盛期，通过小孢子发育时期与花器形态的相关性[引自张菊平，巩振辉，刘珂珂，黄炜，李大伟.辣椒小孢子发育时期与花器形态的相关性.西北农林科技大学学报，2007，35（3）：153-158]，选取花冠与花萼等长或花冠稍长于花萼的花蕾，花蕾直径5mm，长度7mm，并每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；

（3）花蕾预处理：将步骤（2）所选取的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理1～3d；

（4）制备培养基：所配培养基的基本培养基分别为MS培养基和SNGM培养基，其各自的配方见附图1和附图2，以MS培养基为基本培养基另加其他成分的培养基简称M培养基，以SNGM培养基为基本培养基另加其他成分的培养基简称S培养基，M培养基和S培养基所加的其他成分一样，即所用碳源为麦芽糖，其浓度为3%；凝固剂为琼脂，其浓度为0.8%；0.25%的活性炭；NAA（萘乙酸）浓度为4mg/L，6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）浓度为1～2mg/L；

M1培养基的组成成分为MS培养基+3%麦芽糖+0.8%琼脂+4mg/LNAA（萘乙酸）+1mg/L（6-苄氨基腺嘌呤）+0.25%活性炭，pH5.8；

M2培养基的组成成分为MS培养基+3%麦芽糖+0.8%琼脂+2mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+0.25%活性炭，pH5.8；

S1培养基的组成成分为S培养基+3%麦芽糖+0.8%琼脂+4mg/LNAA（萘乙酸）+1mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+0.25%活性炭，pH5.8；

S2培养基的组成成分为S培养基+3%麦芽糖+0.8%琼脂+2mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+0.25%活性炭，pH5.8；

（5）培养基的灭菌与分装：M1、M2培养基和S1、S2培养基均于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min，保证培养基的无菌状态；灭菌后待其温度降至60～70℃时，将其分别分装至100mL的三角瓶中，每个三角瓶分装一种培养基30mL；

（6）花蕾消毒：将步骤（3）处理的花蕾用流水冲洗30min，再用体积分数70%的酒精对其表面消毒30s，之后用体积分数5%的次氯酸钠消毒12～15min，然后用无菌水冲洗4次，每次5min；

（7）无菌剥取花药：在超净工作台上，在铺有无菌滤纸的消毒培养皿中用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净；

（8）花药接种：先把花药接种在盛有M培养基的三角瓶中（B19接种在M1培养基上，B23接种在M2培养基上），每瓶接入5～6枚花药，封口；

（9）花药培养：接种后随即把三角瓶放在35℃的培养箱中暗培养7d后，再转移至25℃、光强2500Lx条件下光照培养，光照培养4d后，选取膨大的花药转移于S培养基上（M1→S1，M2→S2），然后置于25℃恒温培养室中暗培养直至胚状体出现；

（10）胚状体培养：胚状体出现后进行弱光照培养，每天光照10h，光强约2000Lx，使其进一步发育下胚轴伸长，显现两片子叶，子叶“带帽”（实为花药壳），之后进行根系发育，形成具根叶芽俱全的再生植株，再生植株生长健壮，根系发达。

再生植株经细胞学和形态学鉴定确定为小孢子发育的植株，为单倍体植株，通过根尖压片法，此单倍体植株染色体数目为n=12。单倍体与二倍体相比，表现为叶片狭小，节间缩短，生活力弱，花蕾不结实。

实施例2：一种辣椒花药培养直接成苗方法，在实施例1的基础上对个别步骤中的参数进行调整，其中，步骤（4）制备培养基中所添加的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）浓度为1mg/L，步骤（6）花蕾消毒中，用体积分数5%的次氯酸钠消毒12min，其余步骤与实施例1相同。

实施例3：一种辣椒花药培养直接成苗方法，在实施例1的基础上对个别步骤中的参数进行调整，其中，步骤（4）制备培养基中所添加的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）浓度为2mg/L，步骤（6）花蕾消毒中，用体积分数5%的次氯酸钠消毒15min，其余步骤与实施例1相同。

需要说明的是，上述实施例选取杂交一代辣椒品种B19、B23作为试验材料，但并不局限于该材料，该方法对于其他优良性状的杂交一代辣椒品种可实现本发明的目的。

本发明在两种培养基上完成花药膨大、不同时期胚状体的发育以及再生植株的获得，全程需要8周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程。

Claims (4)

1.一种辣椒花药培养直接成苗方法，选取杂交一代辣椒品种，在开花盛期选取处于单核靠边期的花蕾，并装入自封袋中置于4℃环境中1～3d，然后对花蕾进行消毒并剥取花药，将所获得花药接种于培养基中进行花药培养形成胚状体，所述培养基是通过在基本培养基中添加外源物质所制得的，其特征在于：所述的培养基制作和花药接种、培养方法，并且，经花药培养出现胚状体之后，再进行胚状体培养，最终使其形成根叶芽俱全的再生植株；

其中，所述培养基的制作方法为：分别选择MS培养基和SNGM培养基作为两种基本培养基，其中以MS培养基为基本培养基制得M培养基，以SNGM培养基为基本培养基制得S培养基，M培养基和S培养基中添加的外源物质相同，均为各自培养基重量3%的麦芽糖、0.8%的琼脂、0.25%的活性炭、4mg/L的NAA以及1～2mg/L的6-BA，并且，M培养基和S培养基的pH均为6.0，再将M培养基和S培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60～70℃，对M培养基和S培养基分别进行分装，每100mL三角瓶中倒入30mL的M培养基或S培养基；

所述的花药接种与培养的方法为：

（1）花药接种：将所获得的花药接种在盛有M培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6枚花药，将三角瓶封口；

（2）花药培养：将上述接种后的三角瓶放在35℃的培养箱中暗培养，7d后，再将其进行光照培养，光照强度为2500Lx，温度为25℃，待三角瓶中的花药膨大后，将膨大的花药转接于S培养基中，然后置于25℃培养室中进行暗培养，至胚状体出现；

所述的胚状体培养方法为：对花药培养所产生的胚状体再进行弱光照培养，光照强度为2000Lx，每天光照10h，直至形成根叶芽俱全的再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种辣椒花药培养直接成苗方法，其特征在于：在选取单核靠边期花蕾时，每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。

3.根据权利要求1所述的一种辣椒花药培养直接成苗方法，其特征在于：对所得花蕾进行消毒的方法为：先用流水冲洗花蕾30min，再用体积分数70%的酒精对花蕾表面消毒30s，之后用体积分数5%的次氯酸钠消毒12～15min，然后用无菌水冲洗4次，每次5min。

4.根据权利要求1所述的一种辣椒花药培养直接成苗方法，其特征在于：剥取花药的方法为：在超净工作台上，在铺有无菌滤纸的消毒培养皿中用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。