CN103814823B - 白芷花药诱导成苗培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物的花药培养方法，尤其是涉及白芷花药诱导成苗培养方法，属于植物组织培养技术领域。白芷花药诱导成苗培养方法包括花药的采集、温度预处理、消毒灭菌、接种、壮苗、生根培养、炼苗移栽七个步骤。本发明通过花药培养技术诱导白芷花药形成单倍体苗，诱导愈伤率高，一步成苗。相对已有的白芷花药培养方法而言，接种40-60天可直接出苗，在诱导愈伤组织的同时无需再添加任何重金属、其他添加剂或改变植物生长激素即可成苗，通过壮苗生根可发挥快繁的优势，短时期内获得大量花药培养植株；具有诱发时间短、出苗快、苗产量高、苗健壮易成活的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的花药培养方法，具体为白芷花药诱导成苗培养方法。
背景技术
白芷为伞形科当归属植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan，叶互生，根粗长，圆锥形，有浓烈香气。基生叶一回羽状分裂，有长柄，叶柄下部有管状抱茎、边缘膜质的叶鞘；株高可达2.5m，复伞形花序顶生或腋生，伞幅18～40cm，花白色。花期7～8月，果期8～9月，主要以种子繁殖。其干燥根性辛，温，归胃、大肠、肺经，列为中品。具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓。作为常用大宗类药材，其入药历史悠久，至少已有2000多年。
利用花药培养诱导产生单倍体，经染色体加倍可获得纯合二倍体，从而获得一些优良的纯合自交系，进而利用杂种优势可选育出具有更多优良性状的白芷新品种(组合)。此育种方法能快速获得纯合正常植株，能明显缩短育种年限。
目前已报道的白芷花药培养方法中，需要在白芷花药培养形成愈伤组织后，进一步添加硝酸银等，才有少量的出芽率，这种添加硝酸银的方法不但有重金属残留，而且出苗数量极少、苗弱不易成活；其适用的白芷品种也有限，如我们利用其方法培养白芷新品种“川芷2号”的花药，发现其愈伤组织即使添加硝酸银也完全不能再分化形成完整植株，生产上急需更适宜的白芷花药培养技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有白芷花药培养技术存在的缺陷，得到一种能够通过白芷花药培养成苗的组培方法，为白芷花药培养提供了一种效率高、成活率高的方法，在短期内迅速获得大量健壮、安全、生活力强的白芷花药植株。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现，白芷花药诱导成苗培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)花药采集
白芷开花初期，采集花粉生长在单核靠边期的白芷花序；
(2)温度预处理
采集到的白芷花序，进行温度预处理；
(3)消毒灭菌
取温度预处理过的白芷花序流水冲洗30-40min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡10-15min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗5次，每次4-5min，用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；
(4)诱导愈伤及成苗
在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取花药接种到愈伤组织诱导培养基上，暗培养到愈伤组织形成，接着光培养至分化开始形成丛生芽；
(5)壮苗
将上一步所得的白芷丛生芽、带芽点的愈伤组织在无菌条件下转接到壮苗培养基上进行培养成独立的健壮植株；
(6)生根培养
将上一步所得无菌苗转移到生根培养基中进行生根培养，直至形成完整植株；
(7)炼苗与移栽
将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍的MS微量元素4-5次，5-6天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25±1℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素3-4次，足月后移栽到大田。
其中，第(1)步骤花药采集，是在晴朗天气的上午8点至10点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花蕾，通过镜检观察，确认花粉处于小孢子单核靠边期时对应的花蕾和花药外部形态，采集大量具该花蕾和花药外部形态的花序。
第(2)步骤温度预处理，处理条件为32℃热激处理0-5天，或者，处理条件为4℃低温预处理时间0-7天，遮光保存。温度预处理条件优选为：32℃热激处理12h，或4℃低温预处理5天。
关于培养基，其中愈伤组织诱导培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA1.5-2.5mg/L+α-萘乙酸NAA 1-2mg/L+3％蔗糖；愈伤组织诱导培养基成分优选为：MS+苄基腺嘌呤6-BA 1.5mg/L+α-萘乙酸NAA 1mg/L+3％蔗糖；
壮苗培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA 0.5-2mg/L+α-萘乙酸NAA0.5-2mg/L+5-20mg/L矮壮素+3％蔗糖；壮苗培养基成分优选为：MS+苄基腺嘌呤6-BA 2mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5mg/L+5mg/L矮壮素+3％蔗糖；
生根培养基包括：1/2MS+吲哚丁酸IBA/α-萘乙酸NAA 0.5-1.5mg/L+1.5％蔗糖。生根培养基成分优选为：1/2MS+吲哚丁酸IBA 1mg/L+1.5％蔗糖。
上述各培养基pH值为5.8±0.2，培养温度为24±2℃，光照强度为1200lx，光照时间12h/d。
与现有技术相比，本发明通过花药培养技术诱导白芷花药成苗，诱导愈伤率高达44.44％，高于原有白芷花药培养最高诱导率6.05个百分点。突破了现有白芷花药培养技术在“川芷2号”白芷品种中应用的瓶颈，能成功诱导“川芷2号”新品种白芷花药愈伤组织并形成再生植株；在诱导愈伤组织的同时无需再添加任何重金属、其他添加剂或改变植物生长激素即可一步成苗，通过壮苗生根可发挥快繁的优势，短时期内获得大量健壮易成活的白芷花药培养植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)花药采集
于白芷开花初期，在晴朗天气的上午10点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花序，镜检观察确定花粉处于小孢子单核靠边期的白芷花蕾和花药外部特征，即花药的外部形态为花瓣微张，花药为黄绿色；
(2)温度预处理
采集花瓣微张，花药为黄绿色的白芷花序，不进行温度预处理，即，温度预处理为0天，直接进行下一步消毒处理；
(3)消毒灭菌
取白芷花序流水冲洗30min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡10min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗5次，每次5min，然后用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；
(4)诱导愈伤及成苗
诱导白芷花药的愈伤组织诱导培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 1.5mg/L+α-萘乙酸NAA 1mg/L+3％蔗糖，pH值为5.8；在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取黄绿色花药接种到诱导培养基上，25℃暗培养20-30天后，可见愈伤组织形成并呈球体不断膨大，接着以1200lx光照强度、12h/d的光照时间培养30-60天，可见愈伤组织再分化长出芽点，部分形成丛生芽；
(5)壮苗
壮苗培养阶段的壮苗培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 2mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5mg/L+5mg/L矮壮素+3％蔗糖，pH值为5.8；将上一步所得的白芷小苗在无菌条件下转接到人工配置的壮苗培养基上，培养温度为24℃，光照强度1200lx，光照时间12h/d；经过30-40天培养的小苗出叶3-5片，叶片变厚变绿，茎壮，形成独立的健壮植株并不断长高，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上；
(6)生根培养
白芷生根阶段的生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸IBA 1mg/L+1.5％蔗糖，pH值为5.8；将上一步所得高于3cm的无菌苗转移到生根培养基中，培养温度为26℃，光照强度为1200lx，12h/d。经过10天培养即生出虚根4-19条，培养30d后根长达到6.1-13.3cm，形成完整植株，最多根数为28条；最终生根率高达100％；
(7)炼苗与移栽
将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍MS微量元素5次，5天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素3次，一个月后移栽到大田，存活率为94％。
实施例2
(1)花药采集
于白芷开花初期，在晴朗天气的上午9点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花序，镜检观察确定花粉处于小孢子单核靠边期的白芷花蕾和花药外部特征，即花药的外部形态为花瓣微张，花药为黄绿色；
(2)温度预处理
采集花瓣微张，花药为黄绿色的白芷花序，置于湿润的滤纸上4℃避光保存5天，保持滤纸湿润；
(3)消毒灭菌
取出白芷花序流水冲洗35min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡11min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗4次，每次5min，然后用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；
(4)诱导愈伤及成苗
诱导白芷花药愈伤组织诱导培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 2mg/L+α-萘乙酸NAA 1mg/L+3％蔗糖，pH值为5.8；在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取黄绿色花药接种到诱导培养基上，25℃暗培养30天后，可见愈伤组织形成并呈球体不断膨大，接着光培养，光照强度1200lx，光照时间为12h/d，35-60天可见愈伤组织再分化长出芽点，进而形成丛生芽；
(5)壮苗
白芷花药丛生芽壮苗培养阶段壮苗培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 1mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5mg/L+5mg/L矮壮素+3％蔗糖，pH值为5.8；将上一步所得的白芷小苗在无菌条件下转接到人工配置的壮苗培养基上，培养温度为25℃，光照强度1200lx，光照时间12h/d；经过30-40天培养的小苗出叶4-5片，形成独立的健壮植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上；
(6)生根培养
白芷生根阶段的生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸IBA 0.5mg/L+1.5％蔗糖，pH值为5.8。将上一步所得高于3cm的无菌苗转移到生根培养基中，培养温度为25℃，光照强度为1200lx，12h/d。经过20天培养即出根1-8条，培养30天后根长达到1-9.7cm，形成完整植株；最终生根率为81.6％；
(7)炼苗与移栽
将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍MS微量元素5次，6天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素4次，32天后移栽到大田，存活率为90％。
实施例3
(1)花药采集
于白芷开花初期，在晴朗天气的上午9点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花蕾，镜检观察花粉处于小孢子单核靠边期的白芷花蕾和花药外部特征，即花药的外部形态为花瓣微张，花药为黄绿色；
(2)温度预处理
采集花瓣微张，花药为黄绿色的白芷花序，置于湿润的滤纸上32℃避光保存12h，保持滤纸湿润；
(3)消毒灭菌
取出白芷小花序流水冲洗35min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡10min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗5次，每次5min，然后用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；
(4)诱导愈伤及成苗
诱导白芷花药愈伤组织诱导培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 2.5mg/L+α-萘乙酸NAA 1mg/L+3％蔗糖，pH值为5.8；在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取黄绿色花药接种到诱导培养基上，25℃暗培养25天后，可见愈伤组织形成并呈球体不断膨大，接着光培养，光照强度1200lx，光照时间为12h/d，45天可见愈伤组织再分化长出芽点，进而形成丛生芽；
(5)壮苗
白芷花药丛生芽壮苗培养阶段壮苗培养基为MS+苄基腺嘌呤6-BA 2mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5mg/L+5mg/L矮壮素+3％蔗糖，pH值为5.8；将上一步所得的白芷小苗在无菌条件下转接到人工配置的壮苗培养基上，培养温度为25℃，光照强度1200lx，光照时间12h/d；经过35天培养的小苗出叶4-5片，形成独立的健壮植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上；
(6)生根培养
白芷生根阶段的生根培养基为1/2MS+α-萘乙酸NAA 1mg/L+1.5％蔗糖，pH值为5.8。将上一步所得高于3cm的无菌苗转移到生根培养基中，培养温度为25℃，光照强度为1200lx，12h/d。经过25天培养即出根1-9条，培养30天后根长达到5.1-10.8cm，形成完整植株；最终生根率高达95.8％。
(7)炼苗与移栽
将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍的MS微量元素5次，6天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素4次，32天后移栽到大田，存活率为92％。
对实施例中的培养基使用情况进行分析：
观察愈伤组织诱导培养基中，添加了1.5、2、2.5mg/L 6-BA+1mg/L NAA的激素配比下的花药诱导培养。白芷在1.5mg/L 6-BA+1mg/L NAA的配比下诱导率最高，为32.67％。
表1愈伤组织诱导培养基不同激素配比对白芷花药愈伤组织诱导率的影响
观察在添加了2mg/L 6-BA+2mg/L NAA愈伤组织诱导培养基中，不同温度预处理的白芷花药诱导愈伤率。其中32℃高温预处理12h的诱导率最高，为44.44％。
表2不同温度预处理对白芷花药愈伤组织诱导率的影响
| 序号 | 温度预处理 | 温度(℃) | 处理时间 | 愈伤组织诱导率(％) |
| 实施例3 | 高温 | 32 | 12h | 44.44 |
| 实施例2 | 低温 | 4 | 5d | 42.59 |
| 实施例1 | --- | --- | --- | 30.27 |
观察在添加了不同浓度IBA、NAA的1/2MS生根培养基中无菌苗生根情况。在1mg/L IBA的1/2MS培养基中，无菌苗生根情况最好，生根数较多，根长也较长。
表3不同温度处理对白芷再生植株生根的影响
| 序号 | 激素 | 浓度(mg/L) | 平均根长 | 平均根数 | 成活率 |
| 实施例3 | NAA | 1 | 8.5 | 9.6 | 92％ |
| 实施例2 | IBA | 0.5 | 8.8 | 8.75 | 90％ |
| 实施例1 | IBA | 1 | 11 | 10.5 | 94％ |
Claims (1)
1.白芷花药诱导成苗培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)花药采集
白芷开花初期，采集花粉生长在单核靠边期的白芷花序；
(2)温度预处理
采集到的白芷花序，进行温度预处理；
(3)消毒灭菌
取温度预处理过的白芷花序流水冲洗30-40min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡10-15min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗5次，每次4-5min，用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；
(4)诱导愈伤及成苗
在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取花药接种到愈伤组织诱导培养基上，暗培养到愈伤组织形成，接着光培养至分化开始形成丛生芽；
(5)壮苗
将上一步所得的白芷丛生芽、带芽点的愈伤组织在无菌条件下转接到壮苗培养基上进行培养成独立的健壮植株；
(6)生根培养
将上一步所得无菌苗转移到生根培养基中进行生根培养，直至形成完整植株；
(7)炼苗与移栽
将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍的MS微量元素4-5次，5-6天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25+1℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素3-4次，足月后移栽到大田；
第(1)步骤花药采集，是在晴朗天气的上午8点至10点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花蕾，通过镜检观察，确认花粉处于小孢子单核靠边期时对应的花蕾和花药外部形态，采集大量具该花蕾和花药外部形态的花序；
第(2)步骤温度预处理，处理条件为32℃热激处理1-5天；或者处理条件为4℃低温预处理时间0-7天，遮光保存；
所述的愈伤组织诱导培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA 1.5-2.5mg/L+α-萘乙酸NAA 1-2mg/L+3％蔗糖；
所述的壮苗培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA 0.5-2mg/L+α-萘乙酸NAA0.5-2mg/L+5-20mg/L矮壮素+3％蔗糖；
所述的生根培养基包括：1/2MS+吲哚丁酸IBA/α-萘乙酸NAA0.5-1.5mg/L+1.5％蔗糖。
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