CN103416304A - 一种节水抗旱稻花药的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物组织培养方法，具体地说，涉及到一种节水抗旱稻的花药培养方法，属于植物生物技术领域,本发明采用的技术方案是,所述方法包含的步骤有：外植体的选择,外植体的消毒与接种,愈伤组织诱导与增殖,愈伤组织分化，组培苗生根培养与移栽。本发明方法应用于节水抗旱稻遗传育种中，提高了节水抗旱稻，特别是籼型节水抗旱稻品种的花药培养效率，缩短了育种周期，为加速节水抗旱稻优良品种的选育提供有力的技术支持。

Description

一种节水抗旱稻花药的培养方法

技术领域

 本发明涉及一种植物组织培养的方法，具体地说，尤其涉及到一种节水抗旱稻的花药培养方法，属于植物生物技术制种栽培领域。

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物之一。为进一步提高水稻品种的产量潜力, 20 世纪90年代中期我国启动了以利用亚种间杂种优势的超高产育种计划，后又称之为超级稻计划，但是，尽管超级稻在良好的栽培条件下表现较大的增产潜力, 但难以在大面积生产中得以实现。其主要原因是我国65%以上的稻田为中低产田, 稻田质量难以满足现有超级稻品种的生长需求，其中干旱是最主要的限制因子之一。20 世纪90年代以来, 我国每年平均受旱面积达2.667×107 hm²，造成粮食减产7×1010~8×1010 kg。另一方面, 我国又是贫水大国，人均水资源占有量仅2200 m³, 仅为世界平均水平的1/4, 而水稻又是用水大户, 我国农业用水占用水总量的70.4%，其中水稻生产用水占农业用水的70%。水资源已成为本世纪我国粮食安全的瓶颈，节约水稻用水必然成为农业节水的一条主要途径与措施。因此, 培育和推广节水抗旱的水稻品种, 对于稳定和提高中低产田的产量水平, 建设我国新型节水环保农业具有重要的意义。

节水抗旱稻是指既具有水稻高产优质特性又具有旱稻节水抗旱特性的一种新的栽培稻品种类型。它是在水稻高产优质研究的基础上, 引进旱稻的节水抗旱特性而育成的新品种。在灌溉条件下, 节水抗旱稻的产量、米质与水稻基本持平, 但可节水50%以上; 在望天田, 具有较好的抵抗干旱的能力(或基本具有旱稻品种的抗旱能力)。在栽培上, 节水抗旱稻简单易行、投入低、节能低碳环保。近年来，上海市农业生物基因中心积极致力于旱稻种质资源的收集筛选评价与创新研究，建立科学的节水抗旱性评价体系，系统收集保存节水抗旱核心基因资源，进行稻种资源的抗旱性鉴定，利用极端环境采用常规杂交育种方法培育了籼型常规品种“沪旱15”，籼型杂交组合“沪优2号”，粳型杂交组合“旱优8号”等一批节水抗旱稻品种。

水稻花药培养是水稻育种中较成熟的一种技术手段，它是指把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种到人工培养基上，改变花药内花粉粒的正常发育途径（即形成成熟花粉最后产生精子的途径），转而形成愈伤组织或胚状体，最终分化成单倍体植株的过程。在花药培养过程中，单倍体植株经染色体自然或人工加倍得到纯合二倍体，这种染色体加倍产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离。

运用花药培养技术可以高效聚合育种，先以单交杂种材料诱导花粉植株，从中选优良株系进行复交、回交、或反复回交，继续进行花药培养，可免除显隐性的干扰，克服常规复合杂交的盲目性，有目的地进行定向培育。水稻花药培养在育种上利用的高效性还体现在极早稳定分离后代，快速获得纯系，缩短育种年限，提高选择效率。常规杂交后F1 代通过花药培养在 H2代即可筛选稳定品系，而常规育种需要 F5代以上，复交组合需要代数更多，因此花培育种可比常规杂交育种年限缩短 3-5 年，甚至更多。花培作为一种有效的技术手段已广泛应用于水稻育种中，在创造原始材料，选育新品种、新不育系、新恢复系，提纯不育系和恢复系等方面都起到了作用并取得了一定的成效.

　　花药培养的关键，一是提高花药愈伤的诱导率，二是提高绿苗分化率。这样才有可能获得育种所需要的优异类型。粳稻花药培养技术已逐步成熟，其发展的重点在于迅速应用该技术进行粳稻花培种质的创新和花培品种的进一步推广种植。同粳稻花培育种相比，籼稻花培育种难度仍然很大。主要由于籼稻花培受基因型的影响，培养力较低，平均培养力只有0.5%左右，最高不过1%，有些材料很难诱导出愈伤组织或者难于得到花粉植株。自20世纪70年代中国进行水稻花药培养育种以来，共有5个花培籼稻品种先后通过审定。同粳稻花培育种相比，一是选育品种少，二是推广面积小。籼稻花培育种研究的核心在于提高籼稻花药培养力，大幅度提高籼稻花培效率。

中国专利公开文献CN101766121A一种小报春的花药培养方法披露了小报春花药的培养方法，以及CN101554136B公开了一种小麦花药进一步成苗培养方法，目前未检索到关于水稻花药的培养方法，由于水稻的生存环境不同于小麦和报春花，所以其花药的培养方法也不同于小麦和报春花，本发明是根据现未有水稻花药的培养方法而进行研究的。

发明内容

本发明的目的是创建一套节水抗旱稻的花药培养技术体系，缩短节水抗旱稻育种进程，尽快将优异的节水抗旱稻资源纯化稳定，为节水抗旱稻育种提供一种更快捷有效的途径。在本发明中提到的水稻为节水抗旱稻。

本发明提供一种节水抗旱稻花药的培养方法,其步骤包括外植体的选择,外植体的消毒与接种,愈伤组织诱导与增殖,愈伤组织分化，组培苗生根培养与移栽。

具体的方法为：选取花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，7-9℃低温预处理7-9天后，用次氯酸钠和双氧水灭菌，在超净工作台用剪颖倒花药法接入愈伤诱导培养基，先在30℃黑暗条件下热激培养24hr，再转到25℃条件暗培养20-30天，将生长出的愈伤转入分化培养基，25℃条件光照培养30-40天，最后将分化出的绿苗进行生根培养7-10天即可。

外植体的选择为田间取材：选择在晴天早晨露水未干时或傍晚取穗．以尽量减少幼穗水分的散失，穗子处于苞内大约2/3处，穗子不破口；剥出穗子，中段颖壳淡绿色；剥开小穗，花药颜色淡黄。田间取穗后应立即放入装有清水的桶中，以避免穗子失水。在实验室内用70%酒精棉球擦拭叶片和叶鞘，擦拭叶片时不要太湿，再按株系将穗子捆扎在一起，保留前1-2张叶片，然后用潮湿而不滴水为宜的纱布和塑料薄膜依次包好。包好的穗子放在7-9℃冰箱中低温处理7-9天。

外植体的消毒为花药的灭菌：将穗子从冰箱取出，剥去叶鞘。挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，其特点为：颖壳黄绿色。花药淡黄色，在颖壳内约占1/2（籼稻）或2/3（粳稻）的高度，花药成簇不散开。将枝梗剪为5-7厘米的小段，在灭菌瓶中进行灭菌。灭菌程序如下：用70%酒精浸泡30-60秒进行表面消毒，再依次用新鲜配制的1-1.5％次氯酸钠灭菌20min，3％双氧水灭菌10min，期间上下倒置振荡灭菌瓶几次，最后无菌水冲洗4－5次。

花药愈伤的诱导培养：穗子灭菌好后，在超净台内吹10min左右，要吹的比较干燥，以减少接种污染，但不能太干，否则花药脱水失活。采用剪颖倒花药法，将花药接种到诱导培养基上。花药基本诱导培养基为N6，NB，M8等固体培养基。

    本发明优选使用本实验室针对节水抗旱稻改良过的M8培养基，具体配方为M8基本培养基 + 2,4-D 2.0mg·L^-1 + NAA 3.0mg·L^-1 + KT 1 mg·L^-1，附加水解酪蛋白300 mg·L^-1，脯氨酸300 mg· L^-1，谷氨酰胺500 mg·L^-1，麦芽糖55g·L^-1，植物凝胶（phytagel）3.8g·L^-1，pH为6.0。

热激处理及诱导培养：将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24小时，以提高出愈率。热激处理结束后，再将愈伤转到25℃半光条件，倒扣培养15-20天，光照强度为3000-4000lux, 光照周期12h/d。至愈伤开始长出后，转到25℃黑暗条件继续培养10-15天，花药愈伤长至2mm左右进行分化培养。诱导培养温度不能高于26℃。

花培愈伤组织分化培养：将生长至2mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照条件为5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃。水稻愈伤常用分化培养基种类很多，本发明采用本实验室针对节水抗旱稻优化的添加山梨醇的分化培养基,具体配方为MS基本培养基 + 6-BA 2.0 mg·L^-1 + KT 2.0 mg·L^-1 + IAA 0.2 mg·L^-1 + NAA 0.2 mg·L^-1,附加山梨醇10g·L^-1，水解酪蛋白1.0g·L^-1,麦芽糖30g L^-1, 植物凝胶（phytagel）3.8g·L^-1，pH为6.0。

组培苗生根培养与移栽既为花培苗的生根壮苗：将长至约5-8cm的分化苗，转入生根壮苗培养基，本发明采用的生根培养基为1/2MS + 0.1NAA mg·L^-1，蔗糖20g·L^-1，植物凝胶（phytagel）3.8g·L^-1。pH为6.0。生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃。

本发明显著提高了节水抗旱稻，特别是籼型节水抗旱稻品种的花药培养效率，为加速节水抗旱稻优良品种的选育提供有力的技术支持。

附图说明

图1为培养方法的流程图；

图2不同低温处理时间对出愈率和绿苗分化率的影响；

图3不同热激处理时间对出愈率和绿苗分化率的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

参照图1所示，水稻花药培养的方法包括以下步骤：外植体的选择,外植体的消毒与接种,愈伤组织诱导与增殖,愈伤组织分化，组培苗生根培养与移栽。

具体的步骤和方法为：选取花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，7-9℃低温预处理7-9天后，用次氯酸钠和双氧水灭菌，在超净工作台用剪颖倒花药法接入愈伤诱导培养基，先在30℃黑暗条件下热激培养24hr，再转到25℃条件暗培养20-30天，将生长出的愈伤转入分化培养基，25℃条件光照培养30-40天，最后将分化出的绿苗进行生根培养7-10天即可。

外植体的选择为田间取材：选择在晴天早晨露水未干时或傍晚取穗．以尽量减少幼穗水分的散失，穗子处于苞内大约2/3处，穗子不破口；剥出穗子，中段颖壳淡绿色；剥开小穗，花药颜色淡黄。田间取穗后应立即放入装有清水的桶中，以避免穗子失水。在实验室内用70%酒精棉球擦拭叶片和叶鞘（不要太湿），再按株系将穗子捆扎在一起，保留前1-2张叶片，然后用潮湿的纱布（不滴水为宜）和塑料薄膜依次包好。包好的穗子放在7-9℃冰箱中低温处理7-9天。

外植体的消毒为花药的灭菌：将穗子从冰箱取出，剥去叶鞘。挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，其特点为：颖壳黄绿色。花药淡黄色，在颖壳内约占1/2（籼稻）或2/3（粳稻）的高度。花药成簇不散开。将枝梗剪为5-7厘米的小段，在灭菌瓶中进行灭菌。灭菌程序如下：用70%酒精浸泡30-60秒进行表面消毒，再依次用新鲜配制的1-1.5％次氯酸钠灭菌20min，3％双氧水灭菌10min，期间上下倒置振荡灭菌瓶几次，最后无菌水冲洗4－5次。

花药愈伤的诱导培养：穗子灭菌好后，在超净台内吹10min左右。要吹的比较干燥，以减少接种污染，但不能太干，否则花药脱水失活。采用剪颖倒花药法，将花药接种到诱导培养基上。花药基本诱导培养基为N6，NB，M8等固体培养基。本发明优选使用本实验室针对节水抗旱稻改良过的M8培养基，具体配方为M8基本培养基 + 2,4-D 2.0mg·L^-1 + NAA 3.0mg·L^-1 + KT 1 mg·L^-1，附加水解酪蛋白300 mg·L^-1，脯氨酸300 mg· L^-1，谷氨酰胺500 mg·L^-1，麦芽糖55g·L^-1，phytagel 3.8g·L^-1。pH为6.0。

热激处理及诱导培养：将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24小时，以提高出愈率。热激处理结束后，再将愈伤转到25℃半光条件，倒扣培养15-20天，光照强度为3000-4000lux, 光照周期12h/d。至愈伤开始长出后，转到25℃黑暗条件继续培养10-15天，花药愈伤长至2mm左右进行分化培养。诱导培养温度不能高于26℃。

花培愈伤的分化培养：将生长至2mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照条件为5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃。水稻愈伤常用分化培养基种类很多，本发明采用本实验室针对节水抗旱稻优化的添加山梨醇的分化培养基,具体配方为MS基本培养基 + 6-BA 2.0 mg·L^-1 + KT 2.0 mg·L^-1 + IAA 0.2 mg·L^-1 + NAA 0.2 mg·L^-1,附加山梨醇10g·L^-1，水解酪蛋白1.0g·L^-1,麦芽糖30g L^-1, phytagel 3.8g·L^-1。pH为6.0。

花培苗的生根壮苗及移栽：将长至约5-8cm的分化苗，转入生根壮苗培养基，本发明采用的生根培养基为1/2MS + 0.1NAA mg·L^-1，蔗糖20g·L^-1，phytagel 3.8g·L^-1，pH为6.0。生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃。

待花培苗长至13cm左右，真叶3片以上，根系新鲜发达时，可将花培苗移出试管。移出后，将根部的培养基完全洗净，剪去老根和过长的叶片，仅保留3mm左右的根系，放置清水中养根炼苗3-5天，再移栽到土中。刚移栽到土壤中要注意遮阴，浅水养苗生根，至叶尖吐水完全成活，可施加少量尿素。

下面根据不同的实施例做进一步详细的说明，为的是表明处理方法的不同对节水抗旱稻花药培养的影响。

实施例1  

图2显示了不同低温预处理时间对节水抗旱稻花药愈伤诱导率的影响。

在单核靠边期进行低温预处理是有效提高花培效率的常规手段，研究认为低温处理作用机制是延缓花粉的退化维持花粉发育的生理环境提高内源生长素水平并降低乙烯水平启动雄核发育等（肖国樱.水稻花药培养研究. 杂交水稻, 1992, (2): 44-46.）在本试验中，研究了HP1、X17、R1084等三个节水抗旱稻组合在0天、3天、7天和15天不同低温预处理时间下，花药愈伤出愈率及绿苗分化率的影响。结果表明，7-9℃低温预处理3天和15天时，愈伤出愈率和绿苗分化率都明显比处理0天和7天高。

实施例2

图3显示了不同热激时间对节水抗旱稻花药愈伤诱导率的影响。

高温热激主要作用是加快启动小孢子分裂，提高愈伤诱导率。在本试验中，采用0h，24h，36h，48h不同热激时间。S624、X41、S1125三个节水抗旱稻的结果表明，30℃热激处理24h，愈伤诱导率和绿苗分化率都达到最高。

实施例3

节水抗旱稻花药愈伤诱导培养基的筛选与优化。

水稻花药愈伤诱导常用的培养基有N6、合5、SK3、M8及改良M8等。我们采用对籼粳稻均有较好适应性的M8培养基为基本培养基，与其他常用诱导培养基做比较，同时优化C源浓度、相关激素配比、补充氨基酸浓度等，最后确立了广泛适用于节水抗旱稻的花药愈伤诱导培养基M84，具体配方为M8基本培养基 + 2,4-D 2.0mg·L^-1 + NAA 3.0mg·L^-1 + KT 1 mg·L^-1，附加水解酪蛋白300 mg·L^-1，脯氨酸300 mg· L^-1，谷氨酰胺500 mg·L^-1，麦芽糖55g·L^-1，phytagel 3.8g·L^-1，pH为6.0。采用M84花药诱导培养基，一般20天开始出愈，30天左右，花药愈伤已大量生成。粳型节水抗旱稻出愈率平均达到30-50%，最高可达66.2%；籼型节水抗旱稻出愈率平均达到20-30%，最高可达42.3%。

实施例4

添加一定浓度山梨醇，有效提高节水抗旱稻花药愈伤绿苗分化率。

水稻分化培养是比较成熟的技术，常规培养中分化率一般在80%或以上。但在花药培养中，愈伤分化率往往不尽如人意，其中一个主要问题是培养过程中花粉愈伤的褐化率很高，特别是籼型基因型品种，分化率一般低于10%，且容易产生白化苗。我们在常规水稻分化培养基的基础上，改变C源成分，添加一定浓度的山梨醇，显著抑制了愈伤的褐化，降低白化苗率，提高了绿苗率，具体配方为MS基本培养基 + 6-BA 2.0 mg·L^-1 + KT 2.0 mg·L^-1 + IAA 0.2 mg·L^-1 + NAA 0.2 mg·L^-1,附加山梨醇10g·L^-1，水解酪蛋白1.0g·L^-1,麦芽糖30g L^-1, phytagel 3.8g·L^-1。pH为6.0。在此分化培养基中，粳型节水抗旱稻绿苗分化率平均达到30-50%，籼型节水抗旱稻绿苗分化率平均达到15-20%。

Claims (10)

1.一种节水抗旱稻花药的培养方法,其步骤包括外植体的选择,外植体的消毒与接种,愈伤组织诱导与增殖,愈伤组织分化，组培苗生根培养与移栽，其特征在于，所述花药愈伤组织诱导的培养基配方为M8基本培养基 + 2,4-D 2.0mg·L^-1 + NAA 3.0mg·L^-1 + KT 1 mg·L^-1，附加水解酪蛋白300 mg·L^-1，脯氨酸300 mg· L^-1，谷氨酰胺500 mg·L^-1，麦芽糖55g·L^-1，植物凝胶（phytagel） 3.8g·L^-1，pH为6.0。

2.根据权利要求1所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述花药愈伤组织分化培养基配方为MS基本培养基 + 6-BA 2.0 mg·L^-1 + KT 2.0 mg·L^-1 + IAA 0.2 mg·L^-1 + NAA 0.2 mg·L^-1,附加山梨醇10g·L^-1，水解酪蛋白1.0g·L^-1,麦芽糖30g L^-1, 植物凝胶（phytagel） 3.8g·L^-1，pH为6.0。

3.根据权利要求1所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述组培苗生根培养与移栽培养基配方为1/2MS + 0.1NAA mg·L^-1，蔗糖20g·L^-1，植物凝胶（phytagel）3.8g·L^-1，pH为6.0，生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为12h/d，培养温度为25℃。

4.根据权利要求1所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述外植体选取花粉发育时期为单核中期到晚期的水稻幼穗。

5.根据权利要求1或4所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述外植体的消毒与接种的方法是对选取的幼穗用70%酒精棉球简单擦拭灭菌后，保湿包好，进行低温预处理，然后剥去叶鞘，挑选幼穗花药处于单核靠边期的枝梗，剪成5-7cm的小段，用次氯酸钠和双氧水灭菌处理，然后用剪颖倒花药法接入愈伤诱导培养基，进行热激处理。

6.根据权利要求5所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述热激处理方法为将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24小时，以提高出愈率。

7.根据权利要求5所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述低温预处理的方法为将花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，用70%酒精棉球擦拭叶片和叶鞘，保留前1-2张叶片，然后用潮湿的纱布和塑料薄膜依次包好，包好的幼穗放在7-9℃冰箱中低温处理7-9天。

8.根据权利要求5所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述外植体的消毒是将枝梗剪为5-7厘米的小段，用70%酒精浸泡30-60秒进行表面消毒，再依次用新鲜配制的1-1.5％次氯酸钠灭菌20min，3％双氧水灭菌10min，期间上下倒置振荡灭菌瓶几次，最后无菌水冲洗4－5次。

9.根据权利要求1所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导是在培养温度为25℃、光照强度为3000-4000lux,光照周期为12h/d的条件下半光倒扣培养15-20天，至花药愈伤开始长出后，再转到25℃条件下继续暗培养10-15天。

10.根据权利要求1所述的节水抗旱稻花药的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织分化是在光照培养温度为25℃，光照强度5000-6000lux,光照周期为14h/d，光照培养时间30-40天，直至长出小苗。

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