CN104429932A - 一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，该育种新方法的步骤如下：（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源；（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定；（3）杂交育种获得三交F1杂交种；（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养；（5）大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。本发明的育种新方法能够将籼稻抗纹枯病基因特定而高效地渗入粳稻，3年左右即可完成抗纹枯病育种，显著缩短常规籼粳交抗纹枯病育种周期，具有较大的育种应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，尤其是指一种特定而高效地将籼稻纹枯病抗性基因渗入粳稻的水稻育种方法，具体地说是一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法。
背景技术
水稻纹枯病（rice sheath blight），俗称烂脚瘟、花秆、下脚枯等，是水稻生产上的重要病害之一，是遍及全球的水稻病害。该病1905年在日本被首次发现，1934年在我国有发病报道，其后迅速扩散并蔓延至非洲、欧洲和美洲等地。目前该病已在亚、非、欧、美各洲水稻种植国家普遍发生，一般减产10％～30％，严重时可达50％，对水稻生产威胁很大。该病主要危害叶鞘和叶片，严重时也能危害到顶叶及穗部。一般叶鞘先发病，然后是叶片。先在近水面出现水泽壮斑块，后扩大成云纹壮大斑，并长出许多像蛛丝的白色菌丝。轻的叶片枯黄，抽穗困难，出米率下降，严重时常导致稻株倒伏或枯死，使水稻严重减产。近些年，随着矮秆、多蘖、高产品种的推广和施肥、栽培方式的不断提高，稻田病原物的累积增多，病害渐趋普遍和严重，我国南方一些稻区纹枯病已高居水稻三大病害之首。
水稻纹枯病是种真菌性病害，它的致病菌为水稻纹枯病菌，具有强腐生性和较宽的寄主范围。纹枯病菌在生长代谢过程中会产生真菌毒素，在植物病害的发生、发展过程中真菌毒素具有明显的致病、致毒作用，对植物组织也有明显的损害作用。研究表明，水稻纹枯病菌粗毒素不仅能引起纹枯病的相似病斑，而且抑制胚根生长，致使幼苗萎蔫，这显示毒素在病菌致病过程中起非常重要的作用。
长期以来，对水稻纹枯病的防治主要依赖于化学药剂和栽培措施，但防治效果不甚理想。现在农业生产中采取综合防治技术预防纹枯病的发生，主要手段是采取一些预防性措施，如选用抗病品种、栽培上采用抗菌消毒手段和施用农药进行药物治疗，并建立纹枯病预报预测系统，长期的生产实践证明，水稻纹枯病抗性品种的选育和应用是防治纹枯病最经济有效的措施。
籼粳稻深刻分化与显著差异，使它们在产量、品质和抗逆性等方面各具特色，其杂种F1，无论在营养器官还是在产量性状上均具有强大的杂种优势。袁隆平首次提出了籼粳亚种间杂种优势利用的设想，认为直接利用亚种间杂种优势是产量突破中最有希望且能在较短时期内取得成效的途径，提出了应用广亲和基因与光温敏核不育基因实现亚种间杂种优势直接利用的战略设想。籼粳稻杂交育种将打破亚种内育种的界限，从亚种内育种走向亚种间育种。籼粳杂交为亚远缘杂交，杂交后代易产生巨大变异和超亲优势，蕴藏着巨大的遗传潜力。籼粳稻杂交常规育种和籼粳亚种间杂种优势利用已成为当今水稻超高产育种研究的重要手段和方法。我国的育种实践也证明，利用籼粳稻杂交是创造新株型优异种质行之有效的方法。目前籼粳交育成的品种有浙江的矮粳23、T209和城特232等，辽宁的辽粳5号、辽粳 326、沈农1033，江苏的紫金粳，北京的中作系统，湖北的鄂育晚5号等。这些品种（系）表现出高产、抗病和优质的优良特性，但有的籼粳亚种间杂交后代表现出一些缺点，如“千重浪”的不抗稻瘟病，“南粳35”的易于穗发芽等。
国外对籼粳杂交常规育种技术亦给予高度重视。自60年代中后期起，韩国的籼粳杂交常规育种取得了举世瞩目的成就，育成了统一、水原、密阳等高产矮秆系统，这些品种一般比传统粳型品种增产20%～40%。日本引进中国和韩国等地的高产籼稻品种，与当地粳稻品种杂交，增加杂种后代的颖花数，同时提高杂交后代的抗逆性和稳产性，先后育成了 52个有希望的新品系和5个新品种，如中国91、北陆125、北陆142、关东146、星丰、秋力等，比对照品种增产20%～36%。日本育种家认为，在第三阶段要实现增产50%的指标必须依靠杂交稻，特别是在水稻广亲和基因理论提出后，主要依靠籼粳亚种间杂种优势利用途径来达到。
但是，由于籼、粳属两个亚种，Fl尽管营养优势很强。但一般都存在部分生殖障碍，籼粳亚种间杂种F1代的株高偏高，生育期超亲晚熟，以及花粉部分败育、结实率偏低等问题，是籼粳交育种面临的三大障碍，严重限制了这种优势在生产上的直接利用。籼粳交利用无论是常规稻品种选育还是恢复系选育，基本上是建立在随机配组和大量选择的基础上的，需要耗费多年的时间和巨大的劳动量。
研究发现，典型的籼籼交和粳粳交由于基因交流少，Fl优势弱，而过度的籼粳基因交流也不利于F1在营养生长与生殖生长上的协调，同样难以表现出产量优势，这就涉及到籼粳基因渐渗的程度问题。育种事实表明，籼粳基因渐渗在超级杂交稻育种中发挥了重要作用，通过分子检测，很多超级杂交稻的亲本均通过籼粳基因渐渗获得。然而，基因渐渗在超级稻育种中，还是通过多次代的杂交、回交筛选来实现，育种周期长，工作量巨大。
籼粳稻深刻分化与显著差异，使它们在产量、品质和抗逆性等方面各具特色，其中一个就是在纹枯病病菌的抗性表现差异非常显著，籼稻品种多对纹枯病有较高的抗性水平，而粳稻对纹枯病的抗性较差，表明籼稻基因组内含有大量粳稻所没有的抗纹枯病基因存在。如能将籼稻内的抗纹枯病基因通过精确高效的手段转移进粳稻基因组培养抗纹枯病粳稻品种，在生产上具有极高的价值。
随着生物技术的发展，除常规杂交育种外又出现了许多新的育种手段，这赋予了水稻抗纹枯病育种新途径，一种是利用纹枯病培养液提取粗毒素作为选择压，在细胞水平上进行筛选突变体，并与常规育种技术结合培育新的抗病品种，但是通过粗毒素人工诱变的频率低，筛选量大；第二种就是以转基因技术和分子标记辅助选择育种技术为代表的分子育种技术。分子育种技术的出现，对水稻抗纹枯病育种和籼粳交育种难关本来是一种可行的解决方案，目前，转基因育种与分子标记辅助选择等分子技术育种是目前农业发展的新道路，被科学界公认为第三次农业绿色革命的出现。但是，对特定优良主栽品种进行抗纹枯病基因和其他优良基因的转基因育种，本来可以精确实现籼粳交的改良，但由于目前转基因育种被抵制，而分子标记辅助选择育种首先需要基因定位，同样需要大田多世代的杂交回交，不能解决籼粳交的问题，另外，分子技术育种，都存在费用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握。
发明内容
本发明的目的是针对现有籼粳交常规育种所面临的杂种F1株高偏高、生育期超亲晚熟、花粉部分败育结实率偏低的障碍，提供一种将籼稻纹枯病抗性基因特定而高效地渗入粳稻从而改良粳稻品种的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：该育种新方法的步骤如下：
（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有纹枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗纹枯病籼稻抗源；
（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压；
（3）杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗纹枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1；
（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田；
（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、纹枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。
所述步骤（1）中的农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、纹枯病抗性有待改良以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；抗纹枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗纹枯病的籼稻品种/系。
所述步骤（1）中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养的过程如下：
（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；
（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；
（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系。
所述步骤（1.2）中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15～25粒。
所述步骤（1.2）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8。
所述步骤（2）中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：
（2.1）粗毒素的制备：将混合纹枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，27℃下培养至菌丝长满平板，从平板菌落边缘取直径为5mm的5块菌丝块至50mL产毒培养基中，27℃暗培养15d，每天人工振荡2次，15天后将培养滤液加热，产生的白色沉淀用滤纸过滤，在滤液中加入30g活性炭，4℃静置吸附12h，然后8500r/min离心15min，再将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，洗脱液60℃下旋转蒸发浓缩，获得的黄色浆状物即为水稻纹枯病菌粗毒素；
（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度。
所述步骤（2.2）中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。
所述步骤（2.1）中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为：马铃薯200g/L+葡萄糖20g/L+琼脂粉12g/L，pH值自然；产毒培养基配方为：KNO310g/L+KH2PO45g/L+MgSO4·7H202.5g/L+Fe2(SO4)30.02g/L+蔗糖45g/L，pH值为6.5；所述步骤（2.2）中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6.0。
所述步骤（4）中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。
所述步骤（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5.8；生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%，生根培养基的pH值为5.8。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明的育种新方法与常规育种方法相比，能够将籼稻抗纹枯病基因特定而高效地渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成育种，显著缩短常规籼粳交抗纹枯病育种周期；与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少且育种周期缩短的优点，具有较大的育种应用价值。
附图说明
附图1为本发明的育种新方法技术路线图。
具体实施方式
下面结合附图1与实施例对本发明作进一步的说明。
如图1的技术路线图所示：一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，该育种新方法的步骤如下：
（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源：
选取农艺性状良好的粳稻品种/系，因为籼粳交杂种F1代通常具有株高偏高、生育期超亲晚熟的特点，故该农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、纹枯病抗性有待改良的以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；然后对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，以检验该粳稻品种/系是否适用于排籼培养基中进行花药诱导愈伤组织，诱导培养的过程如下：（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，每个小支梗上花药数量限制为15～25粒，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌不低于10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，该排籼培养基的pH值为5.8；（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系。同时选取农艺性状良好且含有纹枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗纹枯病籼稻抗源，抗纹枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗纹枯病的籼稻品种/系，确保该籼稻抗源含有纹枯病高抗基因。
（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：
粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：（2.1）粗毒素的制备：将混合纹枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，27℃下培养至菌丝长满平板，马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为：马铃薯200g/L+葡萄糖20g/L+琼脂粉12g/L，pH值自然，从平板菌落边缘取直径为5mm的5块菌丝块至50mL产毒培养基中，产毒培养基配方为：KNO310g/L+KH2PO45g/L+MgSO4·7H202.5g/L+Fe2(SO4)30.02g/L+蔗糖45g/L，pH值为6.5，27℃暗培养15d，每天人工振荡2次，15天后将培养滤液加热，产生的白色沉淀用滤纸过滤，在滤液中加入30g活性炭，4℃静置吸附12h，然后8500r/min离心15min，再将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，洗脱液60℃下旋转蒸发浓缩，获得的黄色浆状物即为水稻纹枯病菌粗毒素；（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液且分化培养基的pH值为6.0，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择达到合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度，其中合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。
（3）杂交育种获得三交F1杂交种：
将大田种植筛选的抗纹枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1。
（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：
三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养获得花药愈伤组织，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；当三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+选择压浓度粗毒素提取液且分化培养基的pH值为5.8，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗；待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%且生根培养基的pH值为5.8，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。
（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、纹枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：
大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。
实施例
（1）分别筛选W09557和特青作为粳稻育种亲本和籼稻纹枯病抗源：
多年的育种实践发现，育种主干品系W0955具有产量高、米质比较优良的特点，同时，W0955的株高两年测定平均只有92.8cm，全生育期仅有146天，感纹枯病，2011年正季取W0955花药接种于排籼培养基进行诱导培养，实验发现W0955愈伤组织的诱导率高达48%（花药培养操作步骤同前），非常适合该技术路线的粳稻育种亲本的要求。特青是对多地纹枯病病区的多个纹枯病菌系表现高度抗性，是抗纹枯病育种的重要抗原之一。2011年特青与矮秆广亲和粳稻02428杂交架桥，收获杂种F1，2012年海南选取F1花药再与W09557杂交获取杂交种三交F1。
（2）对W09557进行粗毒素耐性浓度的鉴定：
2011年对选取的W09557进行粗毒素耐力浓度鉴定，在分化培养基中加入5%、10%、15%、20%、25%的粗毒素提取液，配制分化培养基，分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，pH值6.0，然后将步骤（1）中诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，统计愈伤组织分化率。结果如下表：
W09557进一步南繁，获取花药进行诱导培养，并进一步粗毒素耐性浓度的优化，结果如下：
因此，综合比较，我们将20%的粗毒素提取液浓度定为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压。
（3）杂交育种获得三交F1杂交种：
2011年特青与矮秆广亲和粳稻02428杂交架桥，收获杂交种F1，2012年海南选取F1花药再与W09557杂交获取杂交种三交F1。
（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：
2012年正季大田常规种植三交F1杂交种，选取健壮主穗花药接种于排籼培养基进行花药诱导培养获得花药愈伤组织，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，pH值5.8；并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了20%粗毒素提取液的分化培养基中，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+20%粗毒素提取液，pH值6.0，温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得189颗花培幼苗；待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%且生根培养基的pH值为5.8，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，2013年移栽入温室。
（5）花培家系大田种植，农艺性状、纹枯病抗性筛选获得纹枯病抗性改良的3个优良粳稻新品系：
移栽到温室的花培苗单株收种，获得189个花培家系，2014年正季进一步大田播种189个花培家系，以W09557为对照，从中筛选获得3个农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。
本发明的育种新方法与常规育种方法相比，能够将籼稻抗纹枯病基因特异而高效地渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成育种，显著缩短常规籼粳交抗纹枯病育种周期；与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少且育种周期缩短的优点，具有较大的育种应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：该育种新方法的步骤如下：
（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有纹枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗纹枯病籼稻抗源；
（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压；
（3）杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗纹枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1；
（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田；
（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、纹枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。
2.根据权利要求1所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（1）中的农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、纹枯病抗性有待改良以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；抗纹枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗纹枯病的籼稻品种/系。
3.根据权利要求1所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（1）中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养的过程如下：
（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；
（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；
（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系。
4.根据权利要求3所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（1.2）中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15～25粒。
5.根据权利要求3所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（1.2）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8。
6.根据权利要求1或3所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（2）中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：
（2.1）粗毒素的制备：将混合纹枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，27℃下培养至菌丝长满平板，从平板菌落边缘取直径为5mm的5块菌丝块至50mL产毒培养基中，27℃暗培养15d，每天人工振荡2次，15天后将培养滤液加热，产生的白色沉淀用滤纸过滤，在滤液中加入30g活性炭，4℃静置吸附12h，然后8500r/min离心15min，再将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，洗脱液60℃下旋转蒸发浓缩，获得的黄色浆状物即为水稻纹枯病菌粗毒素；
（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度。
7.根据权利要求6所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（2.2）中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。
8.根据权利要求1所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（2.1）中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为：马铃薯200g/L+葡萄糖20g/L+琼脂粉12g/L，pH值自然；产毒培养基配方为：KNO310g/L+KH2PO45g/L+MgSO4·7H202.5g/L+Fe2(SO4)30.02g/L+蔗糖45g/L，pH值为6.5；所述步骤（2.2）中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6.0。
9.根据权利要求1所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（4）中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。
10.根据权利要求1所述的籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：所述步骤（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5.8；生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%，生根培养基的pH值为5.8。
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