CN104521744B - 一种白叶枯病抗性粳稻育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白叶枯病抗性粳稻育种方法，该育种方法的步骤如下：（1）选取待改良粳稻品种/系和抗白叶枯病籼稻抗源；（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定；（3）杂交育种获得三交F1杂交种；（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养；（5）大田种植花培苗，单株收种获得白叶枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且白叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系。本发明的育种方法能够将籼稻白叶枯病抗性特定而高效地导入粳稻，3年左右即可完成抗白叶枯病育种，显著缩短常规抗白叶枯病育种周期，具有较大的育种应用价值。

Description

一种白叶枯病抗性粳稻育种方法

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，尤其是指一种特定而高效地将籼稻白叶枯病抗性基因渗入粳稻的水稻育种方法，具体地说是一种白叶枯病抗性粳稻育种方法。

背景技术

水稻是全世界最重要的粮食作物之一，其栽培面积和总产量仅次于小麦。由于亚洲2亿人口中4/5及非洲和拉丁美洲近10亿人口中1/3均以稻米为主要食物来源，所以水稻生产对发展中国家的重要性尤为突出。我国是世界稻谷生产大国。据近十年来的统计，年平均生产稻谷占世界稻谷总产的36.9%，居世界第一；水稻播种面积占世界总播种面积的22.8%，仅次于印度；稻谷的平均亩产约为380千克，比世界平均亩产高，在主要产稻国中名列前茅。近年来，随着我国工业的发展和人们生活水平的提高，对稻米的需求不断加大，而随着水稻病虫害的爆发、人口持续增长、干旱加剧、乡村劳动力匮乏以及环境污染等要素的影响，我国水稻生产正日益跟不上需求量的增加，使得我国粮食的自给率逐年下降，水稻种植和粮食安全问题正面临严峻的挑战。

水稻白叶枯病又称白叶瘟、茅草瘟、地火烧等，在欧洲、非洲、南美、美国、澳大利亚、亚洲都有发生，而又以日本、印度、我国发生最为严重，给包括我国在内的亚洲热带及亚热带地区的水稻生产带来严重的危害。在中国，20世纪30年代在苏、浙最早发现，长江以南（包括华南和云南）和江淮平原籼稻产区是常发区。该病20世纪50年代末至60年代在长江下游稻区的江苏，70～80年代在淮南、皖中、鄂中丘陵、鄂东、江汉平原和华南等稻区多次流行。20世纪80年代后曾得到了有效的控制，白叶枯病在生产中几乎“销声匿迹”了。20年后，此病害却在长江流域一些种植新组合的稻田里重新大爆发，在多省每年都有不同程度的发生。

水稻白叶枯病主要发生于叶片及叶鞘上，初起在叶缘产生半透明黄色小斑，以后沿叶缘一侧或两侧或沿中脉发展成波纹状的黄绿或灰绿色病斑；病部与健康部分界线明显；数日后病斑转为灰白色，并向内卷曲，远望一片枯槁色，故称白叶枯病。水稻白叶枯病病原菌为水稻黄单胞菌。初侵染源主要是病草和病谷，细菌经水流传播到秧田，引起秧苗发病。早稻秧苗感染后往往不表现症状，成为带菌苗。晚稻在三四叶期就可表现症状。秧田期淹水，秧苗期淹水，秧苗被感染的机会增多，淹水没顶次数越多，时间越长，秧苗带菌率越高。当带菌苗或显症状的秧苗移栽到大田后，到分蘖末期稻株抗病力降时开始发病，成为中心病株。以后又在病株的病部产生大量的菌脓，借灌水和暴风雨传播，不断进行再侵染，使病害在田间不断扩大蔓延。水稻白叶枯病对水稻生产的影响极大，一般引起叶片干枯，不实率增加，米质松脆，千粒重降低，发病田一般减产20%～30%，严重的减产50％以上，发生凋萎型白叶枯病的稻田常造成死丛现象，损失严重，甚至绝收。水稻白叶枯病的频繁爆发给水稻生产带来严重的危害，所以白叶枯病与稻瘟病、水稻纹枯病并称为水稻三大病害。

长期以来，对水稻白叶枯病的防治主要依赖于化学药剂和栽培措施，但防治效果不甚理想。现在农业生产中采取综合防治技术预防水稻白叶枯病的发生，主要手段是采取一些预防性措施，如选用抗病品种、栽培上采用抗菌消毒手段和施用农药进行药物治疗，并建立水稻白叶枯病预报预测系统。长期的生产实践证明，水稻白叶枯病抗性品种的选育和应用是防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。

目前水稻白叶枯病抗病育种中主要采用传统的抗病育种方法进行育种，如利用资源筛选、杂交、回交等常规育种途径选育出一批具有垂直抗性和水平抗性较好的优良品系。但是常规育种消耗时间特别长，一个品种的育成需要育种家7、8年以上的努力，常规的水稻白叶枯病抗病育种的育种周期漫长，其每年的筛选也很低效，工作量非常庞大。尤其随着水稻白叶枯病病菌突变频率的增加，一个新品种育成的速度已经跟不上水稻白叶枯病病菌的突变速度，所以寻找更高效更快捷的育种方法是目前水稻白叶枯抗病育种的迫切需求。

籼粳稻深刻分化与显著差异，使它们在产量、品质和抗逆性等方面各具特色，其杂种F1无论在营养器官还是在产量性状上均具有强大的杂种优势。袁隆平首次提出了籼粳亚种间杂种优势利用的设想，认为直接利用亚种间杂种优势是产量突破中最有希望且能在较短时期内取得成效的途径，提出了应用广亲和基因与光温敏核不育基因实现亚种间杂种优势直接利用的战略设想。籼粳稻杂交育种将打破亚种内育种的界限，从亚种内育种走向亚种间育种。籼粳杂交为亚远缘杂交，杂交后代易产生巨大变异和超亲优势，蕴藏着巨大的遗传潜力。籼粳稻杂交常规育种和籼粳亚种间杂种优势利用已成为当今水稻超高产育种研究的重要手段和方法。

国外对籼粳杂交常规育种技术亦给予高度重视。自 60年代中后期起，韩国的籼粳杂交常规育种取得了举世瞩目的成就，育成了统一、水原、密阳等高产矮秆系统，这些品种一般比传统粳型品种增产20%～40%。日本引进中国和韩国等地的高产籼稻品种，与当地粳稻品种杂交，增加杂种后代的颖花数，同时提高杂交后代的抗逆性和稳产性，先后育成了52个有希望的新品系和5个新品种，如中国91、北陆125、北陆142、关东146、星丰、秋力等，比对照品种增产20%～36%。日本育种家认为，在第三阶段要实现增产50%的指标必须依靠杂交稻，特别是在水稻广亲和基因理论提出后，主要依靠籼粳亚种间杂种优势利用途径来达到。

但是，由于籼、粳属两个亚种，Fl尽管营养优势很强。但一般都存在部分生殖障碍，籼粳亚种间杂种F1代的株高偏高，生育期超亲晚熟，以及花粉部分败育、结实率偏低等问题，是籼粳交育种面临的三大障碍，严重限制了这种优势在生产上的直接利用。籼粳交利用无论是常规稻品种选育还是恢复系选育，基本上是建立在随机配组和大量选择的基础上的，需要耗费多年的时间和巨大的劳动量。

研究发现，典型的籼籼交和粳粳交由于基因交流少，Fl优势弱，而过度的籼粳基因交流也不利于F1在营养生长与生殖生长上的协调，同样难以表现出产量优势，这就涉及到籼粳基因渐渗的程度问题。育种事实表明，籼粳基因渐渗在超级杂交稻育种中发挥了重要作用，通过分子检测，很多超级杂交稻的亲本均通过籼粳基因渐渗获得。然而，基因渐渗在超级稻育种中，还是通过多次代的杂交、回交筛选来实现，育种周期长，工作量巨大。

目前通过多年重灾区资源筛选，发现了一些抗水稻白叶枯病的优良籼稻资源，如嘉育280，皖稻61号，赣早籼40号，中优早81号，湘早籼21号、22号，汕优多系1号，滇籼13号、14号等，这些抗水稻白叶枯籼稻品种的选育对防治水稻白叶枯病带来了优质的育种抗源，如能将籼稻内的抗水稻白叶枯病基因通过精确高效的手段转移进粳稻基因组培养抗水稻白叶枯病粳稻品种，在生产上具有极高的价值。

随着生物技术的发展，除常规杂交育种外又出现了许多新的育种手段，这赋予了水稻抗水稻白叶枯病育种新途径，一种是利用水稻白叶枯病培养液提取粗毒素作为选择压，在细胞水平上进行筛选突变体，并与常规育种技术结合培育新的抗病品种，但是通过粗毒素人工诱变的频率低，筛选量大；第二种就是以转基因技术和分子标记辅助选择育种技术为代表的分子育种技术。分子育种技术的出现，对水稻抗水稻白叶枯病育种和籼粳交育种难关本来是一种可行的解决方案，目前，转基因育种与分子标记辅助选择等分子技术育种是目前农业发展的新道路，被科学界公认为第三次农业绿色革命的出现。但是，对特定优良主栽品种进行抗水稻白叶枯病基因和其他优良基因的转基因育种，本来可以精确实现籼粳交的改良，但由于目前转基因育种被抵制，而分子标记辅助选择育种首先需要基因定位，同样需要大田多世代的杂交回交，不能解决籼粳交的问题，另外，分子技术育种，都存在费用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握。

发明内容

本发明的目的是针对现有籼粳交常规育种所面临的杂种F1株高偏高、生育期超亲晚熟、花粉部分败育结实率偏低的障碍，提供一种将籼稻白叶枯病抗性基因特定而高效地渗入粳稻从而改良粳稻品种的白叶枯病抗性粳稻育种方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种白叶枯病抗性粳稻育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）选取待改良粳稻品种/系和抗白叶枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有白叶枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗白叶枯病籼稻抗源；

（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压；

（3）杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗白叶枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1；

（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田；

（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、白叶枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得白叶枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且白叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系。

所述步骤（1）中的农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、白叶枯病抗性有待改良以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；抗白叶枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗白叶枯病的籼稻品种/系。

所述步骤（1）中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养的过程如下：

（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；

（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；

（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系。

所述步骤（1.2）中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15～25粒。

所述步骤（1.2）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8。

所述步骤（2）中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：

（2.1）粗毒素的制备：将混合白叶枯病菌株接种于装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，28℃、130rpm恒温振荡培养50h，然后将培养的种子液按2.5％的接种量转接到1500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，继续扩繁72h，再用8500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取粗毒素；

（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度。

所述步骤（2.2）中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。

所述步骤（2.1）中的牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏0.5%+蛋白胨1%+NaCl0.5%，pH值7.5；所述步骤（2.2）中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6.0。

所述步骤（4）中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。

所述步骤（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5.8；生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%，生根培养基的pH值为5.8。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的育种方法与常规育种方法相比，能够将籼稻抗白叶枯病基因特定而高效地渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成育种，显著缩短常规抗白叶枯病育种周期；与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少且育种周期缩短的优点，具有较大的育种应用价值。

附图说明

附图1为本发明的育种方法技术路线图。

具体实施方式

下面结合附图1与实施例对本发明作进一步的说明。

如图1的技术路线图所示：一种白叶枯病抗性粳稻育种方法，该育种方法的步骤如下。

（1）选取待改良粳稻品种/系和抗白叶枯病籼稻抗源：

选取农艺性状良好的粳稻品种/系，因为籼粳交杂种F1代通常具有株高偏高、生育期超亲晚熟的特点，故该农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、白叶枯病抗性有待改良的以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；然后对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，以检验该粳稻品种/系是否适用于排籼培养基中进行花药诱导愈伤组织，诱导培养的过程如下：（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，每个小支梗上花药数量限制为15～25粒，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌不低于10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，该排籼培养基的pH值为5.8；（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系。同时选取农艺性状良好且含有白叶枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗白叶枯病籼稻抗源，抗白叶枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗白叶枯病的籼稻品种/系，确保该籼稻抗源含有白叶枯病高抗基因。

（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：

粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：（2.1）粗毒素的制备：将混合白叶枯病菌株接种于装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中扩繁，牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏0.5%+蛋白胨1%+NaCl0.5%，pH值7.5，28℃、130rpm恒温振荡培养50h后，然后将培养的种子液按2.5％的接种量转接到1500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，继续扩繁72h，再用8500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取粗毒素；（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液且分化培养基的pH值为6.0，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择达到合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度，其中合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。

（3）杂交育种获得三交F1杂交种：

将大田种植筛选的抗白叶枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1。

（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：

三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养获得花药愈伤组织，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；当三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+筛选压力水平的梯度浓度的粗毒素提取液且分化培养基的pH值为5.8，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗；待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%且生根培养基的pH值为5.8，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。

（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、白叶枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：

大田种植花培苗，单株收种获得白叶枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且白叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系。

实施例

（1）分别筛选W08479和赣早籼40号作为粳稻育种亲本和籼稻白叶枯病抗源：

多年的育种实践发现，育种主干品系W08479具有产量高、米质优良的特点，同时，W08479的株高两年测定平均只有97.4cm，全生育期仅有151天，感白叶枯病，2011年正季取W08479花药接种于排籼培养基进行诱导培养，实验发现W08479愈伤组织的诱导率高达45%（花药培养操作步骤同前），非常适合该技术路线的粳稻育种亲本的要求。赣早籼40号是江西省农科院水稻所采用早熟优质早籼品系“85-140”为母本、“珍龙13”为父本杂交育成的中早熟早籼水稻新品种，对多地白叶枯病病区的多个白叶枯病菌系表现高度抗性，非常适合作为抗白叶枯病育种的籼稻抗源。

（2）对W08479进行粗毒素耐性浓度的鉴定：

2011年对选取的W08479进行粗毒素耐力浓度鉴定，在分化培养基中加入0、5%、10%、15%、20%、25%的粗毒素提取液，配制分化培养基，分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，pH值6.0，然后将步骤（1）中诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，统计愈伤组织分化率。结果如下：

因此，我们将20%的粗毒素提取液浓度定为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压。

（3）杂交育种获得三交F1杂交种：

2011年赣早籼40号与矮秆广亲和粳稻02428杂交架桥，收获杂交种F1，2012年海南选取F1花药再与W08479杂交获取杂交种三交F1。

（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：

2012年正季大田常规种植三交F1杂交种，选取健壮主穗花药接种于排籼培养基进行花药诱导培养获得花药愈伤组织，排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，pH值5.8；并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了20%粗毒素提取液的分化培养基中，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+20%粗毒素提取液，pH值6.0，温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得174个花培幼苗；待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%且生根培养基的pH值为5.8，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，2013年移栽入温室。

（5）花培家系大田种植，农艺性状、白叶枯病抗性筛选获得白叶枯病抗性改良的2个优良粳稻新品系：

移栽到温室的花培苗单株收种，获得174个花培家系，2014年正季进一步大田播种174个花培家系，以W08479为对照，从中筛选获得2个农艺形状良好且白叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系。

本发明的育种方法与常规育种方法相比，能够将籼稻白叶枯病抗性特异而高效地导入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成育种，显著缩短常规抗白叶枯病育种周期；与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少且育种周期缩短的优点，具有较大的育种应用价值。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (4)

1.一种白叶枯病抗性粳稻育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）选取待改良粳稻品种/系和抗白叶枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有白叶枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗白叶枯病籼稻抗源；

（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压浓度；

（3）杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗白叶枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1；

（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行生根培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田；

（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、白叶枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得白叶枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺性状良好且白叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系；

所述步骤（1）中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养的过程如下：

（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；

（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；

（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系；

所述步骤（1.2）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；

所述步骤（2）中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：

（2.1）粗毒素的制备：将混合白叶枯病菌株接种于装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，28℃、130rpm恒温振荡培养50h，然后将培养的种子液按2.5％的接种量转接到1500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，继续扩繁72h，再用8500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取粗毒素；

（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压浓度；

所述步骤（2.1）中的牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏0.5%+蛋白胨1%+NaCl0.5%，pH值7.5；所述步骤（2.2）中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6.0；

所述步骤（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5.8；生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%，生根培养基的pH值为5.8；

所述步骤（2.2）中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。

2.根据权利要求1所述的白叶枯病抗性粳稻育种方法，其特征在于：所述步骤（1）中的农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、白叶枯病抗性有待改良以及株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻品种/系；抗白叶枯病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗白叶枯病的籼稻品种/系。

3.根据权利要求1所述的白叶枯病抗性粳稻育种方法，其特征在于：所述步骤（1.2）中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15～25粒。

4.根据权利要求1所述的白叶枯病抗性粳稻育种方法，其特征在于：所述步骤（4）中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行生根培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。