CN104255443B

CN104255443B - 一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法

Info

Publication number: CN104255443B
Application number: CN201410562006.8A
Authority: CN
Inventors: 孙海波; 邹美智; 任洪岩; 王景余; 李艳萍; 冯瑞光
Original assignee: TIANJIN CITY CROP RESEARCH INST
Current assignee: TIANJIN CITY CROP RESEARCH INST
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: CN104255443A

Abstract

本发明公开了一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法。本发明采用分子标记辅助选择技术、花药培养与常规育种技术相结合，快速实现抗白叶枯病基因Xa23、抗稻瘟病基因Pi‑1与抗条纹叶枯病基因Stvb‑i的聚合。结果表明：所获得的聚合三种抗病基因的花培材料所含的抗病基因，均能稳定遗传，且高效抗病。本发明的水稻选育方法创造出一批抗性稳定的水稻新种质资源，为水稻抗病育种提供了物质基础。

Description

一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法

技术领域

本发明涉及一种水稻品系的选育方法及应用。更具体地说是一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法及其应用。

背景技术

水稻是我国第一大粮食作物，也是单产水平最高的粮食作物，常年种植面积不足粮食作物的30％，产量却占粮食总产量的40％以上；我国有60%以上人口以稻米为主食，尤其是以粳米为主食的城乡居民日益增多。所以发展水稻生产，对解决我国粮食安全供给具有举足轻重的作用。

在水稻生产中，病害是水稻高产稳产的重要限制因子，其中白叶枯病（由病原黄单胞菌的变种Xanthomonas. oryza pv. 引起的一种水稻细菌性病害）、稻瘟病（由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的一种水稻真菌性病害）、条纹叶枯病（由灰飞虱介导水稻条纹叶枯病毒（rice stripe virus, RSV）引起的一种水稻病毒性病害）广泛发生在全国各个稻区，每年均有不同程度的发生，年发生面积约500万公顷，流行年份一般减产10-20%，重者高达40-50%，甚至绝收，年损失稻谷约10亿公斤，而且其危害面积、危害程度都日趋严重。生产上主要通过两种途径防治病害：一是使用化学农药，二是种植抗病优良品种。前者过多使用农药不仅生产成本较高，而且易污染环境、杀伤害虫天敌、增大稻谷中农药残留等许多问题；而后者不仅可以提高水稻产量，减轻病害造成的损失，还可以减少农药使用量，减轻环境污染，实现现代农业健康可持续发展。实践证明，选育、应用抗病品种是保证水稻稳产、高产的最为经济有效的措施之一。

当前主栽粳稻品种综合抗病性较好的有花育409、徐稻3号、吉粳88、盐丰47、南粳46等，但这些品种多是单一抗性，不能对多种病害同时表现抗病。绝大多数抗稻瘟病、白叶枯病水稻品种大面积推广3~5年以后，因某一致病生理小种的变化，使品种的抗性下降或丧失。因此，采用基因聚合技术，将不同的抗病基因转入同一品种中，使同一品种对多种病害表现抗病，是今后水稻抗病育种的发展方向和必然趋势。通过开展粳稻多种抗病基因分子聚合与种质创新研究，对创新多抗水稻种质、提高综合抗病性、减轻各种病害对水稻生产的危害、提高水稻产量具有重要意义。

选择是育种工作中的重要环节。常规育种周期长、效率低，耗费大量人力物力，对目标性状多采用直接选择的方法，但许多农艺性状不容易观测，易受环境影响，表现不稳定，直接选择比较困难。传统的水稻抗病育种主要依赖于抗性鉴定和植株表型的选择，要求丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间，并且受有无合适的病菌菌株和病菌发病条件的限制，鉴定结果容易造成误差，甚至造成抗性基因的丢失，所以选择效率低、周期长。

随着近年来越来越多的水稻基因被发现、定位和克隆，传统技术同分子标记辅助选择、花药培养以及转基因手段等现代生物技术相结合，进行多基因抗病育种，已经成为水稻种质资源创新的新途径。不同水稻病害由于抗病育种基础理论研究的深度和广度不同，其进展也不尽相同。目前水稻抗白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病单一抗性育种都取得较显著的成效。

将分子标记辅助选择进行基因聚合应用于水稻抗病育种的实践中，已取得一些实质性进展。用一些与一些目标基因共分离或紧密连锁的分子标记进行了基因聚合研究，将数个抗性基因聚合到一个品种中，产生了一批很有价值的育种材料。将多个单一病害不同的抗性基因聚合到同一个水稻品种中被认为是建立持续抗性的重要途径之一。Satomi等用与抗性基因连锁的RFLP和RAPD标记聚合了抗白叶枯病基因Xa4+ xa5、Xa4+Xa10，获得稳定纯合系，其中具有Xa4+Xa10的纯系出现了在抗谱上由原单个抗性基因所没有的新的抗性类型。据郑康乐等报道，国际水稻研究所已通过MAS方法成功地获得分别聚合3个抗稻瘟病基因和3个抗白叶枯病基因的株系。Huang等用RFLP和PCR标记对白叶枯病抗性基因累加系进行选择，成功地构建了含Xa4、xa5、Xa13、Xa21的多基因累加系。巴沙拉特等以携带Xa4、xa5、Xa13、Xa21四个抗白叶枯病基因的IRBB60与8个水稻新品系，组配8个杂交组合，应用分子标记辅助选择技术从F₂和F₃群体中共获得216个携带4个抗白叶枯病基因的纯合体。Yoshimura等通过RFLP和RAPD标记将来自不同组合的5个白叶枯病抗性基因Xa1、Xa3、Xa4、xa5和Xa10聚合在一起。徐建龙等^[76]在3个晚粳品系中聚合了抗白叶枯病基因Xa3和xa5聚合后的抗性水平和抗扩展能力强于双亲。Singh等把3个水稻白叶枯病抗性基因xa5、xa13和Xa21进行分子标记辅助聚合，获得了含2个或3个白叶枯病抗性基因的品系，该品系在自然条件下表现出较高的抗谱，并把上述3个基因聚合到PR106籼稻品种中。Sanchez等聚合3个抗性基因xa5、xa13、Xa21到IR655982112、IR6560024和IR65600296中。Hittal-mani等已成功地利用RFLP标记技术将Pi1、Piz-5、Pi-ta三个稻瘟病抗性基因聚合到籼稻BL124中。陈志伟等将水稻品种地谷、BL-1、Pi-4号中Pi-d(t)、Pi-b、Pi-ta²基因聚合到保持系籼稻品种冈46B中，其稻瘟病抗性明显提高。邓其明等^[80]通过常规回交育种结合分子标记辅助选择技术，将来自IRBB24的2个抗白叶枯病基因Xa21、Xa4聚合到感病的杂交籼稻恢复系绵恢725中，加速育成了新的高度抗性的杂交籼稻恢复系蜀恢207。王弋等通过回交-自交的育种方法，结合分子标记辅助选择和组织培养，把稻瘟病抗性基因Pi-2导入不具有稻瘟病抗性的华两优103和华两优105的父本T1007中，以期提高这2个组合的稻瘟病抗性。柳武革等以含广谱稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2的BL122为供体，温敏核不育系GD-7S为受体，通过杂交、回交和自交并结合分子标记辅助选择，将Pi-1、Pi-2基因导入温敏核不育系GD-7S中，获得5个携带两个抗性基因的纯合改良不育株系。

利用多种抗病基因同时改良多个性状、利用多种方法聚合多种抗性基因成为基因工程研究方向之一。王兴春等利用分子标记辅助选择与花药培养相结合快速聚合水稻白叶枯病抗性Xa21基因。冯道荣等将多个抗病抗虫基因在水稻中的遗传和表达。王爱菊等利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻。姜明松等利用转抗白叶枯病Xα21基因纯合稳定的圣稻301与转抗螟虫Bt基因、转抗除草剂bar基因的纯合稳定株系GK-1杂交，依据田间抗病虫性表现，利用标记基因选择，分子标记辅助选择，获得了多抗转基因水稻植株。倪大虎等将高抗白叶枯病的Xa21基因和高抗稻瘟病Pi9(t)基因转到不同籼稻品系中，并且得到了含双抗基因的纯合株系。倪大虎等通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9(t)基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。He等应用分子标记技术将多组水稻抗病基因聚合，提高病害抗性：分别将水稻白叶枯病抗性基因Xa21、Xa7和水稻白叶枯病抗性基因Xa21和抗虫性Bt基因聚合到籼稻明恢63；将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2聚合到籼稻珍汕97。何光明等通过分子标记辅助选择结合回交转育，首次成功在进行了抗衰老基因IPT、抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi-6的聚合，并向两系杂交稻亲本进行转移。通过标记选择，Narayanan等聚合3个主效基因Pi-1、Piz-5 和Xa21到Co39，2个主效基因Piz-5和Xa21到IR50。杨子贤等将抗白叶枯病基因Xa21和抗水稻螟虫基因Bt导入93-11，获得含Xa21和Bt基因均为纯合的株系，经改良的93-11及其所配的杂交种显示出良好的抗虫、抗病性。

发明内容

本发明采用分子标记辅助选择技术、花药培养与常规育种技术相结合，快速实现抗白叶枯病基因Xa23、抗稻瘟病基因Pi-1与抗条纹叶枯病基因Stvb-i的聚合，创造出一批抗性稳定的水稻新种质资源，为水稻抗病育种提供了物质基础。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）抗两种病害基因的聚合：用含有抗白叶枯病Xa23基因的BG152和含有抗稻瘟病Pi-1基因的R118分别与含抗条纹叶枯病Stvb-i基因的花育409通过有性杂交进行双抗病基因聚合，分别获得含抗白叶枯病Xa23基因与抗条纹叶枯病Stvb-i基因的F₀种子和含抗稻瘟病Pi-1基因与抗条纹叶枯病Stvb-i基因的F₀种子；

（2）抗三种病基因的聚合：利用分子标记分别对含抗白叶枯病Xa23基因与抗条纹叶枯病Stvb-i基因的F₁植株和含抗稻瘟病Pi-1基因与抗条纹叶枯病Stvb-i基因的F1植株鉴别真假杂种，然后再将两个带有双抗抗病基因的真杂种彼此杂交，获得含抗白叶枯病Xa23基因、抗稻瘟病Pi-1基因与抗条纹叶枯病Stvb-i基因的复交F₀种子；

（3）含抗三种病害基因杂合型聚合体的获得：按划格方式稀播复交F₁群体，于3叶期对所有单株逐株取叶提取DNA，再采用与三种抗性基因紧密连锁的分子标记检测各个体的抗性基因，从中筛选出聚合了含抗三种病害基因型的杂合型个体；

（4）含抗三种病害基因杂合型聚合体的花药培养：从筛选出的聚合了含抗三种病害基因型的个体中，进一步选择农艺性状比较好的个体进行花药培养，获得花培一代H₀；

（5）含抗三种病害基因的纯合型聚合体的获得：花培一代H₀自然加倍，收获二倍体植株种子；按划格方式稀播二倍体植株种子，于3叶期对所有个体取叶提取DNA，再采用与三种抗性基因紧密连锁的分子标记检测各个体的抗性基因，从中筛选出聚合了含抗三种病害基因的纯合型聚合体花培植株，按株系收种；

（6）含抗三种病害基因的纯合型聚合体的选育：播种所有含抗三种病害基因的纯合个体，每个播种量为50-100g；移栽时将其分成四份，一份用于人工接种的白叶枯病接种鉴定，一份采用在病区种植进行条纹叶枯病鉴定，一份用于人工接种结合病区种植进行稻瘟病鉴定，一份种在水田考察农艺性状和测产，最终根据PCR检测与抗病鉴定结果，筛选出聚合三种抗病基因、抗三种病害且综合农艺性状优异的个体。其中三种病害的指的是：白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病。

本发明进一步公开了了聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法在培育抗多种病害水稻方面的应用；其中的多种病害指的是：白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病。

本发明的实验结果如下：

1. 用含有抗白叶枯病Xa23基因的BG152和含有抗稻瘟病Pi-1基因的R118分别与含抗条纹叶枯病Stvb-i基因的花育409进行通过有性杂交进行聚合，获得单交F₀种子180粒、105粒。利用分子标记鉴别真假杂种，然后再将两个带有双抗抗病基因的真杂种彼此杂交，分别获得复交F₀种子720粒和678粒聚合。

2. 含抗三种病害基因的杂合型聚合体的获得：按划格方式稀播复交F₁群体，于3叶期对901单株逐株取叶提取DNA，采用与3种抗性基因紧密连锁的分子标记检测各个体的抗性基因，从中筛选出聚合三种抗病基因的单株52株。

3. 含抗三种病害基因的纯合型聚合体的获得：将52株含三种抗病基因的复交F₁单本移栽于大田，选取田间无病虫害的农艺性状好的单株进行花药培养。共接种20700枚花药，出愈伤6543块，平均出愈率为29.65%；转管4000块，分化出苗1148丛，分化率为28.70%。766株花培苗H₀自然加倍，获得双倍体378株，占49.35%。

4. 含抗三种病害基因的纯合型聚合体的选育：对378份H₁植株进行PCR检测与抗病鉴定，筛选出聚合三种抗病基因的H1株系14个，占3.7%，抗病性鉴定表现为抗（R）。对14份聚合三种抗病基因的H2植株进行PCR检测及抗病鉴定。结果表明，所获得的聚合三种抗病基因的花培材料所含的抗病基因，均能稳定遗传，且高效抗病。

本发明更加详细的描述如下：

材料与方法

1 实验材料

1.1材料

供体亲本为携带抗白叶枯病Xa23基因的粳型材料BG152和抗稻瘟病Pi-1基因的籼型材料R118，由中国农业科学院作物科学研究所提供；受体亲本为携带抗条纹叶枯病Stvb-i基因的优质粳稻品种花育409，由天津市农作物研究所提供（可以购买）；以及携带三个抗病基因Xa23、Pi-1与Stvb-i的水稻材料。

1.2 试剂

提取DNA、PCR反应、电泳等所用试剂为进口或国产分析纯产品，其中Taq聚合酶购自华美公司，dNTPs为Oharmacia公司产品，华美公司分装。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2 实验方法

2.2.1多种抗病基因聚合

用含有抗白叶枯病Xa23基因的中间材料和含有抗稻瘟病Pi-1基因的中间材料分别与抗条纹叶枯病、优质粳稻品种进行有性杂交，分子标记鉴别真假杂种后，将两个带有抗病基因的真杂种彼此杂交，获得足够多的复交F₀种子，该群体中3种抗病基因均呈现分离和自由组合。按划格方式稀播复交F₁群体，确定每一个体的具体位置，于3叶期逐株取叶提取DNA，再采用与3种抗性基因紧密连锁的分子标记检测各个体的抗性基因型，从中选择聚合了3种基因型的个体，再从中进一步选择农艺性状比较好的个体分别花培。花培一代自然加倍，收获二倍体植株种子；花培二代（H₁）采用同样方法，分子标记检测各个体3个抗性基因位点的基因型，选聚合了3种抗性基因纯合的个体分单株收种。理论上花培一代个体加代后基因型应该是纯合稳定，但个体之间可能互不相同。移栽时将H₁分成四份，一份种植在水池用于白叶枯病接种鉴定，一份采用人工接种结合在病区种植进行条纹叶枯病鉴定，一份用于人工接种结合病区种植进行稻瘟病鉴定，一份种在水田考察农艺性状和测产。最终根据PCR检测与抗病鉴定结果，筛选出聚合三种抗病基因、抗三种病害且综合农艺性状优异的个体。

2.2.1.1有性杂交

采用人工剪颖去雄方法进行有性杂交，每个组合作250-300个穗子，每个穗子留60-80朵小花，预收1500-2000粒F₀代种子。

2.2.1.2种植方式

按划格方式稀播单交F₁及复交F₁群体，确定每一个体的具体位置，便于个体跟踪，苗期经PCR检测后，单本移栽，株行距为16.7cm×20cm。管理同一般大田。

2.2.2 PCR检测

2.2.2.1 DNA提取

在苗期对多种抗病基因的聚合植株及花培植株提取DNA，并用核酸蛋白分析仪ND1000进行检测，确定提取DNA的浓度及纯度，高纯度DNA稀释后用于PCR检测。

采用简易SDS法提取基因组DNA。具体步骤如下：

1）取约300mg新鲜的水稻嫩叶用液氮速冻后研磨成粉末，迅速转移至1.5mL离心管中；

2）加入650μL经65℃预热的SDS抽提缓冲液，65℃水浴40min，每隔10min摇动混匀；

3）加入等体积的氯仿异戊醇混合液，摇动混匀3min，静置3min；

4）10000rpm离心8min，小心转移上清于另一洁净的1.5mL离心管中；

5）加入0.8倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置片刻出现白色絮状沉淀；

6）10000 rpm离心5min，弃上清收集沉淀；

7）加入800μL75%的乙醇洗涤沉淀；

8）12000 rpm离心3min后弃上清；

9）超净台上吹干沉淀后加入200μL TE（pH8.0）溶解备用。

2.2.2.2 PCR扩增

反应体系

总体积为20μL：

DNA　　　　　　　 10-30ng

10×Buffer（含20 mM Mg²⁺） 2μL

dNTP（2.5mM）　　 0.2mM

primer1 0.2μM

primer2 0.2μM

Taq酶 1U

ddH2O补至　　　　　　　　20μL

引物序列

与抗白叶枯病Xa23基因紧密连锁的RM206序列：

F：5′-CCCATGCGTTTAACTATTCT-3′

R：5′-CGTTCCATCGATCCGTATGG-3′

与抗稻瘟病Pi-1基因紧密连锁的MRG4766序列：

F：5′-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3′

R：5′-AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-3′

与抗条纹叶枯病Stvb-i基因紧密连锁的RM11-8序列：

F：5′-TAGCCATGCTCATGCGTCAT-3′

R：5′-CGCGGTTTGCAGTAGTTGC-3′

PCR扩增程序

①94℃预变性5min ②94℃变性1min ③55℃退火1min

④72℃延伸1min②→④循环35次 ⑤72℃延伸10min。

2.2.2.3电泳

每管扩增产物加2μL的溴酚蓝（含0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液）混匀，点入3%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后，取出凝胶，在凝胶成像系统上观察、照相。

2.2.3抗病鉴定

每份待鉴定材料同期播种、插秧，插2行区，每行10穴，每穴单株，株行距为13.3cm×30cm。田间管理同一般水田。抗病鉴定的方法参照天津市植物保护研究所进行抗病性鉴定的方法及标准，稻瘟病病菌由天津市植物保护研究所提供。

2.2.3.1抗白叶枯病鉴定

接种鉴定材料种植在网室中，在大田严格隔离的条件下接种白叶枯病。

白叶枯病菌来源

白叶枯病原菌P6、V5生理小种为强致病株，由中国农业科学院作物科学研究所和天津农学院提供。

人工接种鉴定

在分蘖期和孕穗期，通过剪叶法（用剪刀蘸菌液再剪叶尖0.5cm处）对充分伸展的叶片接种白叶枯病强致病菌P6小种和我国的优势致病型V5菌系，每株接种5张以上叶片。病原菌接种于PSA培养基(马铃薯300g/L，Ca（NO₃）₂·4H₂O 0.5 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.0 g/L，蔗糖15 g/L，琼脂粉15 g/L)上置28℃条件下培养72h，调节浓度至10⁹细胞/mL，接种15d（分蘖期）~20d（孕穗期）左右当病斑长度明显而稳定时进行调查，每一植株测量三片叶，求其平均值分别评价目标株系的苗期和成株期抗性表现。

白叶枯病分级标准苗期分级标准

0级：无可见斑（免疫）；

1级：病斑局限于围绕接种点的1-2mm；

2级：病斑近椭圆，不超过2-3cm长；

3级：病斑伸长，扩展至叶片大约1/2或稍短；

4级：病斑向长和宽扩展，毁坏叶片的3/4；

5级：病斑扩展和破坏全叶；

6级：病斑扩展和破坏全叶片以及叶鞘的1/2以内；

7级：叶片和叶鞘被破坏有淡黄色症状；

8级：叶片和叶鞘破坏，植株淡黄色，近25%幼苗被杀死；

9级：大约50%或更多的幼苗全部被杀死。

孕穗期分级标准

0级：无可见斑（免疫）；

1级：病斑局限于围绕接种点的1-2mm；

2级：病斑近椭圆，不超过2-3cm长；

3级：病斑伸长，不及叶片的1/2；

4级：病斑阔广，叶子上半部死亡，扩展叶表面下半部的1/4；

5级：病斑连接，叶子上半部死亡，扩展叶表面下半部的1/4；

6级：病斑扩展至叶片下半部的大约3/4；

7级：病斑扩展至基部并破坏全叶片；

8级：病斑破坏了全叶片扩展到叶鞘的1/2处；

9级：病斑完全毁坏叶片和叶鞘。

白叶枯病抗性评价标准

0级：0免疫（IM）； 1级：0.1-1.0高抗（HR）；

3级：1.1-3.0抗（R）； 5级：3.1-5.0中抗（MR）；

7级：5.0 -7.1感（S）； 9级：7.1-9.0高感（HS）

2.2.3.2抗稻瘟病鉴定

病菌来源：采用2003～2005年天津市优势稳定小种混合菌株。

人工接种鉴定

苗瘟鉴定接种：苗龄在3叶1心期接种天津市4个生理小种和江苏省5个生理小种，用超低喷雾器接种于叶面，接种量为每平方米40ml孢子，接种后覆盖塑料布保温、保湿48h后，去掉塑料布，每天隔3h喷1次水，喷水3d。

穗颈瘟鉴定接种：

用手持喷雾器喷雾接种，水稻抽穗始期为第一次接种，每隔2d接种1次，共接4次，选择傍晚或阴天接种，接种量为150-200ml/m²孢子液，接种后搭架覆盖塑料布加盖遮阳网保湿60h，在保湿48h以后中午放风喷水，晚上覆盖塑料布，每隔喷水5-6次，喷水7d，促使发病。

调查时间与方法

苗瘟接种后7-10d调查病情，穗颈瘟在水稻乳熟期调查。按全国统一分级标准调查记载，计算病情指数，根据病情指数评价抗性类型。为保证穗瘟鉴定结果，同时将材料种在病区进行评价。

苗、叶瘟分级标准

0级：无病斑；（HR）

1级：仅有针尖大小的褐点；（R）

2级：有较大褐点；（R）

3级：圆形至椭圆形灰色病斑，边缘褐色，病斑直径约1-2mm；（R）

4级：椭圆形或狭长纺锤形病斑，局限于两条叶脉之间，病斑面积不超过叶面积的2%；（MR）

5级：典型稻瘟病斑，受害面积为3-10%；（MS）

6级：典型稻瘟病斑，受害叶面积为11%-25%；（MS）

7级：典型稻瘟病斑，受害叶面积为26%-50%；（S）

8级：典型稻瘟病斑，受害叶面积为51%-75%；（HS）

9级：全部叶片枯死。（HS）

穗颈瘟发病率分级标准

0级：无病；（HR）

1级：病穗率低于5%；（R）

3级：病穗率5.1-10%；（MR）

5级：病穗率10.1-25%；（MS）

7级：病穗率25.1-50%；（S）

9级：病穗率50.1-100%。（HS）

穗颈瘟损失率分级标准

0级：无病；

1级：每穗损失5%左右（个别小枝梗发病）；

2级：每穗损失20%左右（1/3左右枝梗发病）；

3级：每穗损失50%左右（穗颈或主轴发病，谷粒半瘪）；

4级：每穗损失70%左右（穗颈发病，大部瘪谷）；

5级：每穗损失100%左右（穗颈发病，造成白穗）。

穗颈瘟损失率抗性评价分级标准

0级：无病；（HR）

1级：损失率低于5%；（R）

3级：损失率低于5.1-15%；（MR）

5级：损失率低于15.1-30%；（MS）

7级：损失率低于30.1-50%（S）

9级：损失率低于50%以上。（HS）

穗颈瘟抗性评价分级标准计算公式：

苗叶瘟平均病级 × 25% + 穗颈发病率病级 × 25% + 穗颈损失率病级 × 50%

穗颈瘟抗性评价分级标准

0级：小于0.1（HR）；1级：0.1-2.0（R）；3级：2.1-4.0（MR）；

5级：4.1-6.0（MS）； 7级：6.1-7.5（S）； 9级：7.6-9.0（HS）

2.2.3.3抗条纹叶枯病鉴定

鉴定方法

在天津市西青区（重病区）自然鉴定，当地灰飞虱的带毒率为39%，为保证虫源充足，选用四周为麦田的地块种植待鉴定的材料。感病品种为武育粳3号。

调查时间

分蘖盛期及孕穗期逐株分别按下述症状描述，将各苗分级，并统计各株系中每级的株数，将之代入下面的公式，计算株系病情指数。根据病情指数评价抗性类型。

病情指数=（100×A+80×B+60×Bt+40×Cr+20×C+5×D）/ 被测总苗数×100%

单苗表型鉴定症状分级

A级：长势很差，病叶整片或部分萎蔫，叶片卷曲、枯心、枯死；

B级：长势很差，但病叶不萎蔫，下部叶的黄叶病斑连续、随机，上部叶有退绿症状；

Bt级：症状与B级相似，但长势较差；

Cr级：长势略弱，零星点状略黄，呈零星点状或条纹状，病健交界处明显清晰；

C级：长势略弱，零星点状略黄，病健部有间隙；

D级：长势很好，初期可见的很小病斑随苗的生长被掩饰。

条纹叶枯病抗性评价

1级：0-29，为抗（R）； 3级：40-69，为感（S）；

2级：30-39，为中抗（MR）； 4级：70-100，为高感（HS）。

2.2.4花药培养

2.2.4.1取材与预处理

在田间选取经PCR技术证明携带有目标基因且农艺性状好无病植株的剑叶与倒二叶的叶枕距为5-10cm的主茎或一级分蘖，在单核靠边期（此时的颖花浅绿色，花药伸长至2/5-1/2）取穗，保留上部两片叶子。用70%酒精消毒后，再用纱布包好后装入塑料袋中，把口扎紧，以防水分蒸发，置于7-9℃冰箱中，预处理10-15d。

2.2.4.2培养基

诱导培养基：N₆大量元素+MS微量元素+MS有机质+2mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+5%蔗糖+0.8%琼脂；

分化培养基：MS+0.5 mg/L IAA+1mg/L NAA +2 mg/L KT +3%蔗糖+1%琼脂；

壮苗培养基：1/2 MS+0.2 mg/L IAA +1.5%蔗糖+1%琼脂；

壮苗培养基：1/2 MS+0.2 mg/L IAA +1.5%蔗糖+1%琼脂。

所述的MS微量元素指的是铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等用量很少的元素；

MS有机质指的是铁盐、维生素和氨基酸；

IAA指的是吲哚乙酸；

NAA指的是萘乙酸；

KT指的是激动素。

2.2.4.3诱导与分化

接种时，挑选花药长度为颖壳长度1/2的穗子，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗4次，50ml三角瓶（用剪颖抖花药法）每瓶接种100枚左右花药；在温度为26±2℃、湿度为50-60%下暗培养，诱导愈伤组织；当愈伤组织长成直径1.5-2mm大小时，将其转至分化培养基上（试管），每管转3块愈伤；在温度为26±1℃、湿度为60%左右的条件下进行光培养，分化绿苗。

2.2.4.4壮苗与炼苗

当花培苗长至2-4cm、有2-3片叶子、根系发育良好时，及时把苗转入壮苗培养基上进行培养，当绿苗长至10-15cm时，将苗取出进行炼苗。

2.2.4.5鉴定倍性植株

花培绿苗单本移栽于大田，成熟期统计总苗数、单倍体数、二倍体数、多倍体数，计算二倍体得率。

2.2.4.6数据统计方法

出愈率（%）= 形成愈伤组织块数 / 接种花药数 × 100

分化率（%）=（分化绿苗愈伤组织块数+分化白苗愈伤组织块数）/ 转移愈伤组织块数 ×100绿（白）苗分化率（%）= 分化绿（白）苗愈伤组织块数 / 转移愈伤组织块数 × 100

绿苗产率（%）= 出愈率 × 绿苗分化率 × 100

二倍体得率（%）= 二倍体植株数 / 总绿苗株数 × 100

结果与分析

3.1 两种抗病基因的聚合

用携带抗白叶枯病Xa23基因的中间材料BG152和携带抗稻瘟病Pi-1基因的中间材料R118作为供体分别与含抗条纹叶枯病Stvb-i基因的优质粳稻品种花育409进行有性杂交，获得聚合两种抗病基因的F₀种子180粒、105粒，见表1。

表1 双抗病基因聚合结果

3.2 三种抗病基因的聚合

所获得的组合1、组合2的种子按划格方式稀播，分别获得103株、88株。苗期利用分子标记鉴别真假杂种后，将两个带有双抗抗病基因的真杂种移栽于大田，选择田间无病虫害的植株彼此杂交，分别获得聚合三种抗病基因的正、反复交F₀种子720粒和678粒，见表2。

表2 三抗病基因聚合结果

3.3聚合三种抗病基因复交F₁ 植株PCR检测

按划格方式稀播复交F₁群体，确定每一个体的具体位置，于3叶期对901株单株逐株取叶提取DNA，采用与3种抗病基因紧密连锁的分子标记检测各个体的抗性基因，其结果见表3、图1、图2、图3。

从表3可以看出，PCR检测带有一种抗病基因的植株226株，占25.09%，其中Xa23呈阳性的植株有56株，占6.22%；Pi-1呈阳性的植株有59株，占6.55%；Stvb-i呈阳性的植株有111株，占12.32%。获得聚合两种抗病基因的植株540株，占59.93%，其中Xa23和Pi-1呈阳性的植株有155株，Xa23和Stvb-i呈阳性的植株有194株，Pi-1和Stvb-i呈阳性的植株有191株，分别占17.20%、21.53%、21.20%。获得聚合三种抗病基因的植株52个，占5.77%。

表3 三种抗病基因聚合复交F₁植株的PCR检测统计

3.4花药培养

经PCR检测筛选出聚合三种抗病基因的复交F₁单本移栽于大田，从8月2日开始到8月29日结束，陆续采取田间无病虫害的农艺性状好的单株的穗子，8月11日开始接种。

3.4.1愈伤组织诱导与分化

共计接种20700枚花药，出愈伤6543块，平均出愈率为29.65%，转管4000块，分化出苗1148丛，其中绿苗766丛，白苗382丛，分化率为28.70%。复交1出愈率为33.84%、分化率为31.70%、绿苗分化率为21.65%、绿苗产率为7.33%、绿苗433丛；复交2出愈率为29.38%、分化率为25.70%、绿苗分化率为16.65%、绿苗产率为4.89%、绿苗333丛，见表4。

表4愈伤组织诱导率和分化率

从表4得出，不同复交组合后代花培效果不同，复交1表现好，其出愈率、分化率、绿苗产率均最高。

3.4.2自然加倍

表5 花培植株H₀自然加倍倍性调查结果

从表5得出，766株花培苗H₀在海南自然加倍，获得二倍体378株，占49.35%；单倍体374株，占48.83%；多倍体14株，占1.82%。来源不同组合的花培苗H₀倍性表现不同，来源于复交1的花培苗二倍体得率为51.04%、单倍体得率为47.11%；来源于复交2的花培苗二倍体得率为47.15%、单倍体得率为51.05%，各组合单倍体得率与二倍体得率持平，其原因有待进一步研究。笔者建议应加强对单倍体进行人工加倍处理（经田间鉴定和镜检，对单倍体植株进行秋水仙素溶液浸根加倍等）研究，提高二倍体得率。

3.5花培植株H₁PCR检测与抗病鉴定

将收获的378份H₀种子播种200粒，苗期提取DNA，进行PCR检测；理论上花培植株H₁个体基因型应该是纯合的，所以移栽时分成四份，每份20株：一份种植在网室盆中用于白叶枯病接种鉴定，一份在病区种植进行条纹叶枯病鉴定，一份在网室用于人工接种进行稻瘟病鉴定，一份种在水田考察农艺性状。花培植株H₁PCR检测结果，见表6、表7。

表6 花培植株H₁PCR检测统计

表7花培植株H1 PCR检测与抗病鉴定的符合率

从表6可以看出，378份花培植株H₁经PCR检测，获得带有一种抗病基因H₁株系172个，占42.35%，其中Xa23呈阳性的H₁株系有45个，占11.90%；Pi-1呈阳性的H₁株系有55个，占14.55%；Stvb-i呈阳性的H₁株系有72个，占19.05%。获得聚合两种抗病基因H₁株系127个，占33.60%，其中Xa23和Pi-1呈阳性的H₁株系有32个，Xa23和Stvb-i呈阳性的H₁株系有41个，Pi-1和Stvb-i呈阳性的H₁株系有54个，分别占8.47%、10.85%、14.28%。获得聚合三种抗病基因的H₁株系14个，占3.7%。

从表7可以看出，PCR检测Xa23和Stvb-i基因呈阳性的株系，其抗病鉴定均表现为抗病（R），检测呈阴性的株系的抗病鉴定均表现感病（S），Xa23和Stvb-i基因的PCR检测结果与抗病鉴定结果符合率达100%；而PCR检测Pi-1呈阳性的株系155个中有7个株系抗病鉴定表现为感病（S），有148个株系表现抗病（R），呈阴性的株系抗病鉴定表现为感病，Pi-1基因的PCR检测结果与抗病鉴定结果符合率达98.15%，其原因有待进一步研究（可能与检测标记与目的基因的连锁程度不同有关）。

3.6 花培植株H₂ PCR检测及抗病鉴定

种植14份聚合三种抗病基因的H₁种子，苗期提取DNA，进行PCR检测。移栽时分成四份，进行抗白叶枯病、条纹叶枯病、稻瘟病鉴定和农艺性状考察。PCR检测及抗病鉴定结果见表8。

表8 花培植株H₂ PCR与抗病鉴定结果

注：“+”为PCR检测阳性；“－”为PCR检测阴性；“S”为感病；“R”为抗病；“MR”为中抗。

从表8可以看出，筛选出的14份聚合三种抗病基因的花培植株H₂，经PCR检测三种抗病基因均呈阳性，抗病鉴定均表现为抗病（R）。结果表明所获得的聚合3种抗病基因的花培材料所含的抗病基因及其抗病性水平均能稳定遗传且表达。

4. 结论

4.1水稻分子标记辅助选择、花药培养与常规育种技术的有机结合，快速创造聚合多种抗病基因且高效表达的粳稻种质资源

本研究利用分子标记辅助选择、花药培养与常规育种技术相结合，实现了广谱显性抗白叶枯病基因Xa23、抗稻瘟病基因Pi-1和抗条纹叶枯病基因Stvb-i的聚合，快速地创造出14份农艺性状优异的全生育期抗白叶枯病、条纹叶枯病、稻瘟病的种质资源，聚合的三种抗病基因及其抗病程度均能稳定遗传且高效高达，提高了综合抗病能力，为今后更好地发挥其杂种优势利用提供技术支撑。

本研究从配组到选育出目标品系只需要2-3年的时间，比常规育种快2-3年。

4.2 PCR检测与抗病鉴定的一致性

本研究利用与其紧密连锁的分子标记进行对该目的基因的PCR检测，再通过田间抗病鉴定检测该基因的抗病表达水平。通过对378份花培材料的PCR检测与抗病鉴定。结果表明，凡PCR检测Xa23、Stvb-i基因呈阳性的株系其抗病鉴定表现为全生育期抗病性为抗（R），其抗病鉴定与PCR检测的符合率达100%，抗病基因及其抗病水平均能稳定遗传、高效表达；而PCR检测Pi-1基因呈阳性的株系155个中有7个表现感病，其抗病鉴定与PCR检测的符合率达98.15%。

4.3 用N₆培养基诱导产生的花培后代大部分表现为粳型

本研究利用在N₆培养上诱导的愈伤组织，其结构致密，分化的较好，成活率较高，来源2个粳籼交不同类型组合分化出的花粉植株多数表现为粳型，少数为偏粳型，极少数为偏籼型。结果表明，N₆培养基具有一定的选择粳型作用。

本发明的积极效果在于：

（1）本发明利用分子标记辅助选择、花药培养与常规育种技术相结合，拟将广谱显性抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病Pi-1基因导入到抗条纹叶枯病的优质粳稻品种中，以期提高现有材料的综合抗病能力，实现多种抗病基因的分子聚合，创造出抗多种病害的粳稻种质资源，为天津市优质抗病水稻育种提供可靠的物质基础和技术支撑。

（2）本发明的方法实现例如生物技术育种、分子标记辅助育种和常规育种技术的有机结合，实现多种抗病基因的分子聚合，提升我市粳稻抗病育种的分子水平；为天津市创造一批聚合多种抗病基因的粳稻种质资源，丰富水稻的遗传多样性，作为抗源可用于天津粳稻抗病育种计划；选育出的多抗粳稻品种可在病区直接种植推广，提高综合抗病性，减少农药使用量，降低生产成本，增加农民收入，发展绿色农业、生态农业，保证国家粮食安全。

附图说明：

图1为 Pi-1（229bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1、3为阴性对照花育109、BG152；2为阳性对照R118；4~9、12为含目的基因；10、11、13为不含目的基因；

图2为 Xa23（147bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1、2为阴性对照花育109、R118；3为阳性对照BG152；5、7~12为含目的基因；4、6为不含目的基因；

图3为Stvb-i（约200bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1为阳性对照花育109； 2、3为阴性对照R118、BG152；4~10、13为含目的基因；11、12为不含目的基因；

图4 为Pi-1（229bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1为阳性对照R118； 2~9、12为含目的基因；10、11为不含目的基因；

图5为Xa23（147bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1为阳性对照BG152；2~10、13为含目的基因；11、12为不含目的基因；

图6为Stvb-i（约200bp）的PCR检测结果；其中M为Marker DGL 2000；1为阳性对照花育109； 2~5、7~9、11为含目的基因；6、10、12为不含目的基因；

图7为抗稻瘟病鉴定——叶片及穗子基部表现图；其中1、2为感病叶片；3为抗病叶片；4、5为感穗颈瘟病的穗子；

图8为抗白叶枯病鉴定—叶片表现图；其中1、2为感病叶片；3、4为抗病叶片；5为正常叶片；

图9 为抗条纹叶枯病鉴定—植株表现图；其中1为感病植株；2为抗病植株。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中供体亲本为携带抗白叶枯病Xa23基因的粳型材料BG152和抗稻瘟病Pi-1基因的籼型材料R118，由中国农业科学院作物科学研究所提供；受体亲本为携带抗条纹叶枯病Stvb-i基因的优质粳稻自育品种花育409（由天津市农作物研究所提供，可购买）；所述的MS微量元素；MS有机质、IAA、 NAA 、 KT均有市售。

实施例1：

一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法，它包括：

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农作物研究所

<120> 一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccatgcgtt taactattct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgttccatcg atccgtatgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attgctgcaa agtgggagac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagtggaggc agttcaccac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagccatgct catgcgtcat 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcggtttgc agtagttgc 19

Claims

1.一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（6）含抗三种病害基因的纯合型聚合体的选育：播种所有含抗三种病害基因的纯合个体，每个播种量为50-100g；移栽时将其分成四份，一份用于人工接种的白叶枯病接种鉴定，一份采用在病区种植进行条纹叶枯病鉴定，一份用于人工接种结合病区种植进行稻瘟病鉴定，一份种在水田考察农艺性状和测产，最终根据PCR检测与抗病鉴定结果，筛选出聚合三种抗病基因、抗三种病害且综合农艺性状优异的个体。

2.权利要求1所述的水稻选育方法，其中三种病害的指的是：白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病。

3.权利要求1所述的聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法在培育抗多种病害水稻方面的应用；其中的多种病害指的是：白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病。