CN113151544B - 一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法，针对的Xa23基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，水稻品种IR24的Xa23感病等位基因xa23具有如SEQ ID No.2的所示的核苷酸序列，利用功能标记检测Xa23基因的引物组具有如SEQ ID No.3‑6所示的核苷酸序列。Xa23基因是当前发现的抗性最强、抗谱最广的显性抗白叶枯病基因，通过本发明的方法能够更快的、更有效的将白叶枯病抗性基因Xa23应用到广谱、持久抗性育种项目中，提高Xa23基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的利用效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测Xa23基因的方法，具体涉及一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法。
背景技术
水稻是世界主要粮食作物之一，在中国的种植面积高达3000万公顷，总产量达2亿多吨，约占全国粮食总产量的34％，对国家粮食安全至关重要。水稻白叶枯病是水稻最严重的病害之一，是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)的侵染引起的细菌性病害，可以造成水稻减产10％-30％，严重时可导致颗粒无收。水稻抗病品种的培育是目前最经济、环境友好的抗病害的方式，规避了传统育种效率低、准确性低、耗费高等劣势，分子标记辅助选择已经广泛应用于水稻育种。
到目前为止，已有27个抗白叶枯病显性基因，17个抗白叶枯病隐性基因被报道，共44个。由于44个抗白叶枯病基因初始来源于不同的种质，不方便于应用，为此国际水稻研究所以水稻品种IR24为轮回亲本培育了20多个带不同抗性基因的近等基因系，其中包括分别携带具有重要育种价值的广谱抗性基因xa5、Xa21、Xa27的IRBB5、IRBB21、IRBB27。
Xa23基因来源于中国普通野生稻(Oryza rufipogon Griff)，该基因全生育期对多数中国白叶枯病致病小种、菲律宾白叶枯病致病小种、日本白叶枯病致病小种均表现出广谱高抗且该基因是完全显性基因。目前，Xa23基因已经克隆，并且抗病机制得到了阐释：Xa23基因无毒蛋白avrXa23是在白叶枯菌中广泛存在的转录激活类效应因子(Transcription activator-like effector,TALE)，它可以识别Xa23基因启动子上的一段长度为28bp的特定DNA序列(TALE binding element,EBE)，从而激活Xa23基因表达。但是，感病等位xa23启动子区缺少avrXa23特异性结合区域，不能被诱导表达(Wang et al.,2015)。
尽管Xa23的功能位点已经确定，但目前还没有开发Xa23的功能标记，此外，已经发表的跟Xa23紧密连锁的分子标记在IRBB系列中大多无扩增条带。因此，开发与IRBB系列有多态性的Xa23的功能标记将有极大促进Xa23的分子标记辅助育种，尤其与其他抗性基因的聚合育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法，解决了Xa23的功能标记问题，能够检测Xa23基因，提高Xa23基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的利用效率。
为了达到上述目的，本发明提供了一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组，该引物组具有如SEQ ID No.3-6所示的核苷酸序列。该引物组针对的功能标记的Xa23基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列设计，水稻品种IR24的Xa23感病等位基因xa23序列具有如SEQ ID No.2的所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种利用功能标记检测Xa23基因的方法，该方法包含：该方法采用的引物组具有如SEQ ID No.3-6所示的核苷酸序列，采用该引物组进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断是否含有Xa23基因：若有557bp的PCR产物，则待检测水稻中携有Xa23基因；若在557bp处无PCR产物，则待检测水稻中无Xa23基因。
优选地，根据PCR扩增产物判断是否含有Xa23基因时，当确定待检测水稻中携有Xa23基因时，根据251bp和194bp的PCR产物判断Xa23杂合或纯合：若同时含有251bp和194bp的PCR产物，则待检测水稻为Xa23杂合；若只含有194bp的PCR产物，则待检测水稻为Xa23纯合。
本发明的另一目的是提供一种聚合Xa23基因与IRBB系列遗传背景下的抗白枯病基因的方法，该方法包含：
(1)以K608R为轮回亲本，分别以携Xa23的CBB23、Xa21基因的IRBB21水稻为供体，经田间抗性鉴定及分子标记辅助选择后，轮回杂交6～7代，再自交得到株叶形态与K608R一致，且抗性无分离携带Xa23基因的K60823R、携带Xa21基因的K60821R；
(2)将K60823R与K60821R杂交得到F1代，F1代自交后构建F2分离群体，单株提取叶片DNA，采用Xa21基因的功能标记的引物及Xa23基因功能标记的引物进行PCR检测，在分离植株中找出Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株，和/或找出Xa21杂合但Xa23纯合的植株；其中，检测Xa23的引物组为具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；检测xa23的引物组为具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；检测Xa21的引物组为具有如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
(3)针对Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株和/或Xa21杂合但Xa23纯合的植株，将这些植株单株套袋收种，后代种植于田间，再经步骤(2)中的Xa21、Xa23功能标记检测，筛选出Xa21、Xa23均纯合且农艺性状与K608R一致的植株。
优选地，Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株，其PCR产物包含大小为574bp、251bp和194bp的产物；Xa21杂合但Xa23纯合的植株，其PCR产物包含大小为574bp、447bp和194bp的产物。
优选地，所述携Xa23、Xa21基因的水稻分别为CBB23、IRBB21或由其转育成的水稻品种。
本发明的另一目的是提供一种用于检测Xa23基因的试剂盒，该试剂盒中的引物组为具有如SEQ ID No.3-6所示的核苷酸序列。
本发明的利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法，解决了Xa23的功能标记问题，具有以下优点：
本发明的引物组能够检测Xa23基因，Xa23基因是当前发现的抗性最强、抗谱最广的显性抗白叶枯病基因，通过本发明的方法能够更快的、更有效的将白叶枯病抗性基因Xa23应用到广谱、持久抗性育种项目中，提高Xa23基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的利用效率。
附图说明
图1为CBB23/Xa23、IR24/xa23序列示意图。
图2为本发明的Xa23功能标记检测结果。
图3为本发明的功能标记在与Xa21与Xa23基因聚合中应用结果。
注：图2中，M：DL2000 DNA marker；1：IR24不携抗病基因；2：IRBB21携Xa21；3：CBB23携Xa23(Xa23纯合)；4：为携Xa23的K60823R与携Xa21的K60821R杂合第一代(Xa23杂合)；5：IRBB5携xa5；6：IRBB27携Xa27；7：ddH2O对照；图3中，A：Xa21功能标记的PCR检测；B：Xa23功能标记的检测；M：DL2000 DNA marker；1：K608R CK不携抗病基因；2：携纯合Xa21的K60821R；3：携纯合Xa23的K60823R；4：为携纯合Xa21且Xa23杂合的单株；5：携杂合Xa21且Xa23纯合的单株；6：携纯合Xa21且Xa23纯合的单株；7：ddH2O对照。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用功能标记检测Xa23基因的方法，针对具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的Xa23基因设计，高通量测序获得IR24的Xa23感病等位基因xa23具有如SEQ ID No.2的所示的核苷酸序列，该方法采用的引物组具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列、如SEQID No.4所示的核苷酸序列、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，以水稻叶片总DNA为模板，采用该引物组进行PCR扩增，其中反应体系包括2×TaqPCRMix 10μL，双蒸水7μL，引物SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA(50ng/μL)1μL。PCR程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸40s，扩增35个循环，最后72℃继续反应6min，16℃保存。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳。
根据PCR扩增产物判断是否含有Xa23基因：若有大小为557bp的PCR产物，则待检测水稻中携有Xa23基因；若在557bp处无PCR产物，则待检测水稻中无Xa23基因(如图2的泳道1、2、5、6所示)；在有557bp特异条带前提下，若只有194bp PCR产物条带，则为Xa23纯合(如图2的泳道3所示)；若有251bp与194bp两种PCR产物条带，则为Xa23杂合(如图2的泳道4所示)。
实施例2
一种聚合Xa23基因与IRBB系列遗传背景下的抗白枯病基因的方法，该方法以水稻品种CBB23(携Xa23基因，来自中国农业科学院)，IRBB21(携Xa21基因)、K608R为例，包含：
(1)以K608R为轮回亲本，分别以携Xa23、Xa21的水稻CBB23、IRBB21为供体，经田间抗性鉴定及分子标记辅助选择后，轮回杂交6～7代，再自交得到株叶形态与K608R一致，且抗性无分离的K60823R(Xa23)、K60821R(Xa21)；
(2)K60823R与K60821R杂交得到F1代，F1代自交后构建F2分离群体，单株提取叶片DNA，分别采用Xa21的功能标记引物U1、I2(SEQ ID No.7、SEQ ID No.8)(赵天龙等，白叶枯病抗病基因Xa21与Xa23的聚合育种研究，分子植物育种，2015，13(3)：513-517)及Xa23功能标记的引物组进行PCR检测，其中检测Xa23的引物组序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示；检测xa23的引物序列SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示。Xa21反应条件与文献一致(白叶枯病抗病基因Xa21与Xa23的聚合育种研究，分子植物育种，2015，13(3)：513-517)，Xa23功能标记反应体系包括2×Taq PCR Mix10μL，双蒸水6μL，引物SEQ ID No.3(10μmol/L)、SEQID No.4(5μmol/L)、SEQ ID No.5(5μmol/L)各1μL，模板DNA(50ng/μL)1μL。PCR程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环，最后72℃继续反应6min，16℃保存在分离植株中找出Xa21纯合且携有Xa23杂合，即该单株Xa21功能标记PCR产物只有574bp的条带，Xa23功能标记扩增条带有251bp与194bp(如图3中A和B的泳道4所示)；或找出Xa21杂合但Xa23纯合的植株，即该单株Xa21功能标记PCR产物有574bp与447bp两条带，Xa23功能标记扩增条带只有194bp(如图3中A和B的泳道5所示)；
(3)针对Xa21纯合且携有Xa23的植株和/或Xa21杂合但Xa23纯合的植株，将这些植株单株套袋收种，后代种植于田间，再经Xa21、Xa23功能标记检测，筛选出Xa21、Xa23均纯合，即该植株Xa21功能标记PCR产物只有574bp的条带，Xa23功能标记扩增条带只有194bp(如图3中A和B的泳道6所示)且农艺性状与K608R基本一致的植株。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 海南大学 三亚市南繁科学技术研究院
<120> 一种利用功能标记检测Xa23基因的引物组及试剂盒和方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 649
<212> DNA
<213> Xa23
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tcgccgttga gctcgcctac gcttttatct ttccgtataa cttgcgatac atagctgaca 480
accacgacga ggacaatatg gttattcccc ctgtttaatc tttcagggcc tataagcttc 540
ggaagcccaa tatcacggcc tacatacaac ggcctttgat ggtagatggg ccggaccggg 600
aaattaaagc ctcccaaagg gtctattgaa taagaagggc ttgtgagttg tatttgtgta 660
ttttgtttgt ttag 674
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aaagtccctt ccgaaacatc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gttgggtcat ggccctcatc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actcacaaca caagctagcc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atacaactca caagcccttc 20
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<212> DNA
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<400> 7
cgatcggtat aacagcaaaa c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tctgatcatg catgttctgt g 21
Claims (1)
1.一种聚合Xa23基因与IRBB系列遗传背景下的抗白枯病基因的方法，其特征在于，该方法包含：
（1）以K608R为轮回亲本，分别以携Xa23的CBB23、Xa21基因的IRBB21水稻为供体，经田间抗性鉴定及分子标记辅助选择后，轮回杂交6~7代，再自交得到株叶形态与K608R一致，且抗性无分离携带Xa23基因的K60823R、携带Xa21基因的K60821R；
（2）将K60823R与K60821R杂交得到F1代，F1代自交后构建F2分离群体，单株提取叶片DNA，采用Xa21基因的功能标记的引物及Xa23基因功能标记的引物进行PCR检测，在分离植株中找出Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株，和/或找出Xa21杂合但Xa23纯合的植株；其中，检测Xa23的引物组为如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；检测xa23的引物组为如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；检测Xa21的引物组为如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
（3）针对Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株和/或Xa21杂合但Xa23纯合的植株，将这些植株单株套袋收种，后代种植于田间，再经步骤（2）中的Xa21、Xa23基因功能标记的引物检测，筛选出Xa21、Xa23均纯合且农艺性状与K608R一致的植株；
Xa21纯合且携有Xa23杂合的植株，其PCR产物包含大小为574 bp、251 bp和194 bp的产物；Xa21杂合但Xa23纯合的植株，其PCR产物包含大小为574 bp、447 bp和194 bp的产物；
Xa21、Xa23均纯合的植株，其Xa21功能标记的引物的PCR产物只有574 bp的条带，其Xa23功能标记的引物的扩增条带只有194 bp。
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