CN106636386B

CN106636386B - 与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的分子标记DNdCAPS8.03-1及其应用

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Publication number: CN106636386B
Application number: CN201611147933.9A
Authority: CN
Inventors: 王振华; 邸宏; 张�林; 张晓明; 周璇
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: CN106636386A

Abstract

本发明公开了一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的分子标记DNdCAPS8.03‑1及其应用，属于基因工程技术领域。本发明还涉及一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点，位于玉米基因组bin8.03区域的抗病候选基因GRMZM2G047152开放阅读框中的第3169位，当该位点为G时，表现为抗病，当该位点为A时表现为感病。基于该SNP标记开发了dCAPS标记，命名为DNdCAPS8.03‑1，该分子标记的内切酶为BsiHKAI，酶切位点为GWGCWC，PCR扩增产物为137bp，酶切后产物为114bp。将DNdCAPS8.03‑1与位于bin2.09主效抗病位点区域的分子标记MZA6393和LSdCAP2联合使用，选择效率大大高于单标记。因此，本发明可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗丝黑穗病种质资源的筛选抗病品种选育进程。

Description

与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的分子标记DNdCAPS8.03- 1及其应用

技术领域

本发明涉及一种SNP位点及基于其开发的分子标记及其应用，特别涉及一种与玉米抗丝黑穗病次主效抗病位点连锁的SNP位点，基于该位点的分子标记及其在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的应用。属于基因工程技术领域。

背景技术

玉米丝黑穗病是一种世界性的病害，近年来玉米种植面积逐年递增，连作现象严重，丝黑穗病的发生也逐年加剧。一般年份该病的发病率在5％～10％，个别地块达60％以上，感病株率每增加1个百分点，玉米减产100kg/hm²，严重影响玉米产量的提高。采用化学药物防治无法从根本上解决问题，选育抗病品种是现阶段育种工作者的主要目标。用传统育种的方法筛选抗病种质和选育抗病品种耗时耗力、效率差。应用分子标记的分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术不仅增加了选择的准确性，而且大大缩短了育种年限。

研究表明，植物的抗病性大多表现为由多基因控制数量抗病性，还没有数量性状被完整的定位出来。不同的数量性状之间还存在连锁遗传现象，因此，分子标记辅助选择还不能被全面有效的应用于针对数量性状的育种中。为了解决这一问题，研究者们提出主效QTL(quantitative trait locus)这一概念，主效QTL通常均有较高的变异系数，这样将与主效QTL紧密连锁的标记应用于辅助选择可以大大提高育种进程。

然而数量性状除了受到主效QTL的调控外，次主效位点以及微效的QTL的作用也是十分重要的。包劲松等(2000年)对稻米直链淀粉含量进行研究结果表明，稻米直链淀粉含量为数量性状，除了受到1-2个主效QTL(qAc-6和qAC-3)控制外，还受到一些微效QTL(qAC-5,qAC-6a,qAC-6b等)的影响。2012年栾俊文采用遗传分析和QTL定位分析相结合的方式对雄穗发育状况进行分析，说明该性状数量性状，由主效基因和微效基因共同控制。2007年，Jines等在10号染色体短臂上定位到一个抗南方锈病的主效QTL，另外在4、8、9号染色体上定位到了微效QTL。徐凌等通过对前人研究进行总结可知，控制SCMV的主效抗病QTL位于第6号染色体上，因此bin6.00/6.01为SCMV的主效区；而位于bin3.04/05区段的Scmv2是一个微效位点，对SCMN同样具有重要作用。2001年Lehmensiek在第1染色体上发现灰斑病主效QTL，在第3、5染色体上定位出2个微效QTL。

其他禾谷类作物不同，玉米是一个高度异花授粉作物，具有庞大且复杂的基因组，在繁育后代的过程中通过重组大量的差异基因被保留，故而在后代中产生丰富的多样性变异。玉米的大多数性状都是由多个QTL控制的数量性状，因此，玉米育种家可以采用将多个微效QTL聚合在一起的方式，有效的利用遗传资源的多样性，进而获得稳定抗性。同时由于玉米中缺少主效单一的抗病基因，玉米育种家只能通过利用病累加多个抗病QTL使抗性达到较高的水平。由此可见主效QTL的研究固然重要，与此同时次主效位点的研究同样重要，将主次QTL结合起来才能使数量性状的研究更加完善。

玉米丝黑穗病是由多基因控制的数量遗传性状，在10条染色体上都发现与丝黑穗病紧密连锁的QTL，其中贡献率较高的有bin1.04、bin2.09、bin3.04-3.05、bin8.02-8.03等，贡献率分别为10.6％、15.37％和9.78％。bin2.09区域被大多数研究者公认为该病的主效区域，该区域存在的主效QTL平均可解释表型变异达35％左右。针对该主效抗病位点，2014年左为亮等克隆一个抗病基因ZmWAK(wall-assoeiated kinase)，通过验证可知，ZmWAK基因可能在玉米对丝黑穗病的抗病途径中起重要作用。此外，针对该主效抗病位点研究者已经开发了一系列不同类型与之紧密连锁的分子标记，包括SSR、SCAR、dCAPs、STS等。除了在主效区开发标记外，高树仁(2005年)和石红良等(2009年)还在次主效区域开发出一些标记，如bin3.04区域的标记scar-111、bin1.09区的标记ASP和bin3.08区域的标记S100等，这也说明次主效区研究的重要性。本研究室前期针对bin2.09区域开发的分子标记进行选择效率的比较研究结果表明，15个分子标记中标记MZA6393和LSdCAP2的选择效率较高，分别为84.4％和78.5％。因此，有必要开发其他次主效抗病位点的标记用于标记辅助育种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点，基于该位点开发的dCAPS分子标记及其在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点，所述的SNP位点位于玉米基因组bin8.03区域的抗病候选基因GRMZM2G047152的开放阅读框中的第3169位，当该位点为G时，表现为抗病，当该位点为A时表现为感病。

其中，所述的GRMZM2G047152的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种基于所述的SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于以含有与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点的序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP位点有效的转化为dCAPS标记；其中所述的含有与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

其中，优选的，所述的dCAPS引物对的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’(SEQ ID NO.3所示)

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’(SEQ ID NO.4所示)

按照所述的方法得到的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记，命名为DNdCAPS8.03-1，该分子标记的内切酶为BsiHKAI，酶切位点为GWGCWC。

获得所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记的引物对也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的引物对的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’(SEQ ID NO.3所示)

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’(SEQ ID NO.4所示)

再进一步的，本发明还提出了所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点、所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记以及所述的引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途，优选的，将所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点、所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记以及所述的引物对与位于bin2.09主效抗病位点区域的分子标记MZA6393和LSdCAP2联合使用，以提高选择效率。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提出了一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点以及基于该位点开发的dCAPS分子标记，命名为DNdCAPS8.03-1。实践证明，将DNdCAPS8.03-1与位于bin2.09主效抗病位点区域的分子标记MZA6393和LSdCAP2联合使用，选择效率大大高于单标记。因此，本发明提出的分子标记可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗丝黑穗病种质资源的筛选抗病品种选育进程。

附图说明

图1为Fgenesh预测基因结果；

注：TSS.转录起始位点；CDSo.单外显子；PolA:末端polyA区；

图2A-D为开放阅读框分析；

注：方框代表起始密码子；*代表终止密码子；

图3为玉米基因GRMZM2G047152编码蛋白的保守结构域；

图4为标记DNdCAPS8.03-1在不同抗感材料间的PCR扩增结果；

M:DNA Marker D2000；1-4：B73；5-8：Mo17；9-12：齐319；13-17：黄早四；18：水对照；

图5为扩增片段克隆载体的菌液PCR检测结果；

M:DNA Marker D2000；1-4：B73；5-8：Mo17；9-12：齐319；13-16：黄早四；

图6为标记DNdCAPS8.03-1酶切检测结果。

M:DNA Marker pBR322DNA/MspI；1-4：B73；Mo17；齐319；黄早四。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记DNdCAPS8.03-1的建立

一、位于玉米次主效抗病区域bin8.03候选基因GRMZM2G047152的生物信息学分析

1材料与方法

本试验研究对象为位于bin8.03区域的候选基因GRMZM2G047152，该基因为含有NBS结构的抗病基因。

在MaizeGDB和Phytozome11网站上对基因GRMZM2G047152进行检索，利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行基因结构分析。

利用NCBI中的ORF Finder和CD-search搜索对候选基因GRMZM2G047152的氨基酸序列进行预测并分析其保守结构域。

登陆NCBI网站利该网站上BLAST工具，对候选序列的氨基酸序列进行同源性比对。从而寻找到与其相似性高的氨基酸序列，然后使用DNAMAN4.0软件进行同源性分析，进而利用MEGA6软件构建系统进化树，以分析候选序列与抗病基因的进化关系。

2结果与分析

2.1基因GRMZM2G047152的结构预测

由MaizeGDB和Phytozome11网站上对基因GRMZM2G047152进行检索均得到3620bp的一段序列。在Phytozome11网站中，对该基因的genomic sequence进行分析，该段序列仅含有一个连续的CDS。故而以B73RefGen_v3为模板，在该基因两侧各截取5000bp序列，利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行基因结构分析(图1)，分别在编码区的前端和后端找到一个转录起始位点和一个PolyA尾巴。

2.2基因GRMZM2G047152编码蛋白质氨基酸序列及保守结构域分析

在线使用ORF Finder确定玉米抗丝黑穗病候选基因GRMZM2G047152的开放阅读框，结果表明，基因包括一个完整的ORF，大小为3336bp(SEQ ID NO.1所示，图2A-D)。利用NCBI中的CD-search搜索玉米抗病候选基因GRMZM2G047152编码蛋白的保守结构域。结果如图3，蛋白具有NB-ARC、LRR等一系列保守结构域，且所包含的NB-ARC、LRR这些保守结构域绝大多数存在于植物R蛋白中，其结构高度保守，可能参与植物抗病信号转导和抗病作用的发挥。

二、抗病候选基因的克隆及差异SNP位点的挖掘

1材料与方法

1.1试验材料

自交系材料：测序材料B73(Reid)

抗病材料Mo17(Lancaster)、齐319(PB)，发病率分别为：1.64％、3.63％

感病材料黄早四(SPT)发病率为：76.81％

1.2叶片总DNA提取

本试验采用CTAB法提取玉米自交系Mol7、齐319、黄早四以及B73的DNA。将提取的DNA去除RNA后，用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其浓度和纯度于-20℃冰箱中保存备用。

1.3目的基因片段的序列获取

1.3.1 PCR扩增

用Primer Premier5对候选基因部分序列进行引物设计(如表1)。查询可知，GRMZM2G047152基因CDS区共3336bp，编码1111个氨基酸，设计引物时将其分成两段，分别扩增，且两段序列间存在重叠部分以保证序列的完整性。筛选合适的体系(表2)及反应条件(表3)进行PCR反应。

表1 扩增GRMZM2G047152基因的引物序列

表2 GRMZM2G047152基因的PCR反应体系

表3 GRMZM2G047152基因的PCR反应程序

取PCR扩增产物6ul进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 PCR扩增产物的凝胶回收与纯化

对于琼脂糖凝胶电泳分离的DNA产物，利用OMEGA的DNA胶回收试剂盒进行回收和纯化。

1.3.3 PCR纯化产物的连接、转化与鉴定

选用北京全式金生物技术有限公司pEASY-T1载体进行连接，转化，挑选白斑进行PCR鉴定，对白斑进行菌液培养后测序，三次重复。PCR产物的连接转化步骤如下：

(1)克隆反应体系的建立

(2)转化

(3)阳性重组子的鉴定和测序

利用原引物对菌液直接进行PCR，对鉴定出的阳性克隆，取0.5ml菌液加入0.5ml无菌30％甘油至终浓度为15％，-80℃保存菌液，并将菌液送出测序

1.4 SNP差异位点挖掘

利DNAMAN软件将4份试验材料的测序结果分别与抗病候选序列进行比对分析，从而明确所选用的材料是否含有候选序列；并且将4个抗、感材料间的序列进行比对，以便找到抗感材料之间的差异位点。

2结果与分析

2.1目的基因片段的获取

本研究利用全式金的DNA胶回收试剂盒对B73、Mol7、齐319和感病品种黄早四这4份试验材料扩增的PCR产物进行回收和纯化。PCR产物经胶回收纯化后，没有杂带，效果好，可以用于连接转化，进一步确定是否为目的基因的扩增片段。釆用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1载体对纯化后的产物进行连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞进行转化，最后在含有Amp、IPTG和X-Gay的固体LB平板上筛选重组体。在含有蓝白斑的LB平板中挑选白色单菌落接种于LB/Amp的液体培养基中，200rpm，培养16小时左右，将菌液作为PCR的模板进行PCR鉴定，PCR产物大小与目的片段大小一致，且无杂带，初步断定为重组子，将菌液送至公司测序，每个样品三次重复。

2.2 SNP差异位点挖掘

对目的序列的测序选择吉林库美生物科技有限公司和上海生工生物工程股份有限公司共同完成，每个公司均进行两次测通型式的重复测序。以B73为参考序列。

通过对抗感材料中扩增出的序列进行比对，发现在抗感材料间存在6个SNP位点，其中位点2的突变会引起氨基酸的变化(如表4)，位于富亮氨酸重复结构中，故而主要针对SNP2开发dCAPs标记。

表4 抗感材料差异SNP信息

三、基于抗病候选基因SNP位点的dCAPs标记的开发

1材料与方法

本试验以获得的SNP2序列信息(SEQ ID NO.2)为研究对象，利用在线网站dCAPsFinder获得一条引物、最佳酶切位点以及相应的限制性内切酶。再利用primer5.0软件在序列的另一端距离已知引物90-140bp处设计另一条引物；要求上、下游引物的退火温度(Tm)相近，且约为60℃。引物由北京生工生物科技有限公司合成。需要经过一系列PCR验证和酶切反应摸索，确定最佳PCR和酶切反应体系和程序。

以B73、Mo17、齐319和黄早四为材料，对这四个品种进行DNA提取和PCR鉴定，之后通过酶切反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定SNP是否能被有效的区分。

1.1 dCAPs引物PCR扩增

按照dCAPs标记开发要求设计引物，筛选合适的反应体系为ddH₂O 13.3μL，10×Taq Buffer和dNTP(2.5mM/mL)各4μL，Primer和酶为0.4μL，DNA为2.5μL，且PCR反应程序如表5。

表5 dCAPS引物的PCR反应程序

1.2 dCAPs标记PCR产物限制性酶切反应

筛选合适的酶切反应体系为ddH₂O 6.1μL，10×NEBuffer1μL，限制性内切酶为0.4μL，PCR产物为2.5μL，按照内切酶的要求确定酶切温度，对PCR产物进行酶切。

1.3聚丙稀酰胺凝胶电泳及银染

dCAPs标记的PCR扩增产物经限制性内切酶酶切后，用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法如下：

(1)清洗制备凝胶的小玻璃板，晾干，组装好两块玻璃板，备用。

(2)配制10×TBE缓冲液。

(3)配制8％的聚丙烯酰胺凝胶：先将380gAcrylamide(聚丙烯酰胺)和20gBisacrylamide(双叉聚丙烯酰胺)用蒸馏水稀释至1000ml，过滤，配制成40％的Acrylamide，4℃储存备用。聚丙烯酰胺凝胶一般现用现制，TEMED和20％的APS在灌胶前加入。

(4)灌胶：灌胶时防止出现气泡，待灌好胶后插入梳子，等待凝胶约20min。

(5)安装电泳槽：一个电泳槽安装两块胶板，注入1×TBE缓冲液(将配置好的10×TBE缓冲液稀释10倍)，拔梳子，将点样孔内的碎胶吹掉，备用点样。

(6)电泳：每个点样孔点样1.5μl，每个电泳槽恒功率30W，电泳50min左右结束电泳。小心分开两个玻璃板，并取下电泳的胶片进行银染。

(7)银染程序

(8)拍照：将胶片放在灯箱上面读带，并用相机拍照记录实验结果，胶片放在指定的地方以便处理。

1.4分子标记的单克隆及鉴定方法

对新开发的dCAPs标记进行单克隆鉴定，并送出测序。再利用DNAMAN软件对测序获得的结果与目的片段序列进行比对分析，验证PCR产物。

2结果与分析

2.1基于SNP位点的dCAPs标记开发

6个SNP位点中只有SNP2、3和4能使氨基酸发生突变，因此本发明以SNP2为对象开发dCAPs标记。由于引物是根据参考序列的反向互补链设计的，故SNP2由G/A变为C/T突变。利用在线网站dCAPs Finder分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶。然后使用DNAMAN软件对已获得的克隆的候选序列及SNP序列进行比对，找出突变SNP位点两侧附近延伸碱基序列，总长度约500bp。再利用primer5.0软件，固定SNP位点一端(带改变碱基的酶切位点)的引物，使突变位点为PCR扩增延伸的第一个碱基，而后用该软件需找另一端合适的引物。要求：退火温度(Tm)值约60℃将上、下游引物TM值调至相近，产物大小为90-140bp左右。将设计的引物下载，并在其中固定的一条引物链中，根据所选择的限制性内切酶，变化相应的1-2个碱基，复查后合成引物。引物由北京生工生物科技有限公司合成。对于己设计合成的引物，要经过一系列PCR验证和酶切摸索分析。开发的标记命名为DNdCAPS8.03-1，信息见表6。

表6 dCAPs标记引物及相应的内切酶

2.2分子标记的单克隆及鉴定

以dCAPs标记的PCR产物为材料，利用琼脂糖凝检测，结果表明可以扩增出单一、清晰大小与目标片段一致的条带(图4)，对PCR产物进行胶回收目的片断，再通过连接、转化和摇菌步骤，获得每个标记的单克隆，利用原引物对菌液直接进行PCR(图5)，鉴定片断后，将菌液送出测序，以B73为例测序结果如SEQ ID NO.5所示。再利用DNAMAN软件对测序获得的结果与目的片段序列进行比对分析。比对结果表明扩增出的片段与目标片段一致，且抗感之间的SNP仍然存在，说明该SNP位点可以有效的转化成dCAPs标记。用限制性内切酶切割PCR产物，抗感材料间差异较大，PCR扩增产物为137bp，酶切后产物为114bp，能明显区分，故而转化的dCAPs标记在开发材料B73、Mo17、齐319和黄早四间有效(图6)。

四、抗丝黑穗病次主效位点dCAPS标记验证

1试验材料

75份常用玉米自交系：在2003年和2004年东北农业大学玉米研究所对这75份自交系进行了田间人工菌土接种鉴定，各材料的发病率，结果见表7。以上植物材料均由东北农业大学玉米研究所提供。

表7 75份自交系材料田间接种中后的丝黑穗抗性评价及其血缘系谱表

注：常用自交系血缘划分按照目前我国玉米种质主要分为6个类群，即四平头(SPT)、旅大红骨(LRC)、兰卡斯特(Lan)、瑞德(Reid)、PA和PB。

2试验方法

2.1新开发标记DNdCAPS8.03-1基因型分析方法

提取试验材料叶片的总DNA，具体PCR和酶切方法见前文。

8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2.2主效抗病位点bin2.09区域已开发分子标记的基因型分析方法

前期试验表明，位于主效抗病位点bin2.09的标记MZA6393和LSdCAP2的选择效率较高。上述两个标记的引物信息见表8。

表8 2个与玉米bin2.09主效抗病位点连锁分子标记的引物信息

(1)STS标记基因型分析方法

1)STS标记引物PCR反应(表9、10)

2)利用3％的琼脂糖凝胶电泳检测

表9 STS引物PCR的反应体系

表10 STS引物的PCR反应程序

(2)dCAPs标记基因型分析方法

与标记DNdCAPs8.03-1对75份常用自交系的基因型分析方法相同。

2.3分子标记及标记组合在自交系中分子检测符合率分析

本试验利用Excel进行数据分析，具体公式如下：

(1)主效抗病区单一标记分子检测符合率

标记对抗病材料的分子检测符合率＝基因型为R株数/表型为抗病株数×100％；

标记对感病材料的分子检测符合率＝基因型为S株数/表型为感病株数×100％；

标记平均分子检测符合率＝(标记对抗病材料的分子检测符合率+标记对感病材料的分子检测符合率)/2

(2)标记组合分子检测符合率

标记组合对抗病材料的分子检测符合率＝各标记共检测出基因型为R株数/表型为抗病株数×100％；

标记组合对感病材料的分子检测符合率＝各标记共检测出基因型为S株数/表型为感病株数×100％；

标记组合平均分子检测符合率＝(标记组合对抗病材料的分子检测符合率+标记组合对感病材料的分子检测符合率)/2

3结果与分析

3.1单个分子标记在自交系中分子检测符合率分析

75份丝黑穗病发病率已知的自交系材料中，根据王晓鸣(2002)提出的抗性分级标准，将高抗HR、抗R以及中抗MR定为抗病，将感病S和高感HS界定为感病。根据表11可知，75份自交系材料中共有抗病材料32份，感病材料43份。在32份抗病材料中，标记MZA6393共检测出基因型为R的有26份，分子检测符合率为81.25％；在43份感病材料中检测出基因型为S的有35份，分子检测符合率为81.4％，平均分子检测符合率为81.33％。可知标记MZA6393在抗病材料中的分子检测符合率高于在感病材料中。在32份抗病材料中，标记LSdCAP2检测基因型为R的有26份，分子检测符合率为81.25％；在感病材料中分子检测符合率为53.49％，平均分子检测符合率为67.37％，可知标记LSdCAP2在抗病材料中的符合率也高于在感病材料中的符合率。由于bin2.09区域为玉米抗丝黑穗病的主效区域，故而针对这一区域开发出的标记的效率明显高于次主效区开发的分子标记，因此，次主效区新开发的分子标记应结合主效区标记进行分析，从而确定次主效区开发出标记的意义。

表11 标记自交系中的分子检测符合率

3.2标记组合在自交系中分子检测符合率分析

将基于bin8.03次主效抗病区域开发的标记DNdCAPS8.03-1，与基于bin2.09主效抗病区域开发的标记MZA6393和LSdCAP2，配成标记组合联合分析，结果见表12。

在不同发病率的75份玉米自交系材料中，标记组合DNdCAPS8.03-1+MZA6393、DNdCAPS8.03-1+LSdCAP2、MZA6393+LSdCAP2以及DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子检测符合率均高于主效区的两个单标记的符合率。其中标记组合DNdCAPS8.03-1+MZA6393的分子检测符合率较单一标记MZA6393高10.53％；标记组合DNdCAPS8.03-1+LSdCAP2的分子检测符合率较单一标记LSdCAP2高12.87％；标记组合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子检测符合率较单标记MZA6393和LSdCAP2分别高11.70％和25.66％，较标记组合MZA6393+LSdCAP2高8.98％，说明在bin2.09区标记组合中加入次主效区标记DNdCAPS8.03-1，标记组合的分子检测符合率提高；在所有标记及标记组合中，三标记组合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子检测符合率最高，为93.03％，说明三标记组合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2为最优组合。

表12 标记组合在自交系中的分子检测符合率

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的分子标记DNdCAPS8.03-1及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 3336bp

<212> DNA

<213> GRMZM2G047152 ORF

<400> 1

atggcggaga cgttggccgg ctggctggtg tgcccgatca tcaagatcgt gatggataag 60

gcaaaatctt gcgcttccga caggatcaag agcctgggcg acggcgtccc caaggcgctc 120

aagcggatgg agcacttgct gtatcagctc cgcgccgtgg gggccgccgt ccagcggcgg 180

ggctctccga acggatgcgg ggacccggac ttccgtgagt ggctacagca gctcatggat 240

gccgtgtacg aggccctaga cgtcgtcgat gacttcgacg actctatgcc gccgcctgaa 300

tcccccgtcg ccagggtcag caagcggatc ttcggcaccg acgagcgcgt caacaggctc 360

aacgatgtcg tcgacaagct ggaagccatc tccaaagcct cgccgacact gattctgacg 420

gcggaggcca acgcgtcggc gtcgcgcgaa cagagcggtc acctgccccc gctcggccgc 480

atcacggcct cgctgcgcca ccacaaggac gtggtggttg ggcgcgactg ggagctgcaa 540

aatatggtgt cctggctcgt cggcgcaggc ggcgacgccc aggttgtctc tgtccccatc 600

gcggcgatca taggacatgg cgggatgggg aagaccacgc tggcgcaggt cctgttagag 660

gacccgaatg tggtctccac ctttgaaatc aaaatctgga tccagccttt cccgacggac 720

aacgagcttg agcttgccaa gaagatcctc ctgggcgccg acgtgggcgt cgacgccttc 780

gacgggctga cgaatttcga cttgctactg aaaaagataa aggagaaagt ctcgttgcgc 840

aagttcctgc tggtgatcga cgacgtctgg aacaaggaga acatgggtca gcatgagtac 900

cgagagatgt ggtccaaggt gctggcgccc ctcagccacg gggaaagggg aagcaggatc 960

gtggtcacca cccgtcaaaa gatggtagcg aatttgctgt ccgcaagcat ggaggtccgg 1020

ttggatgact tgccggccaa tgacatctgg tctctgttca agaggtatgc cttcggtggc 1080

gaggacattg atggtcagcc ttgtgcactg caggacatcg gaaggaaaat tgcccaaaag 1140

ctcaaggggt ctccaatgct cgccaaggcc gttgggcaga tgcttgaagg caaccccagt 1200

gtctcccact ggaggaaggt gcttgagatg gacatcttcg acaatgtttc caagacatta 1260

gagttgtgct accagaattt accgggccac ctgcaaccat gcttcgcaat ctgcagctta 1320

ttccccaaga actggaggtt caagcgcgat aagctggtga agatttggat ggcccttggt 1380

ttcgtgcagg cagcggatgg gaaattggag gatctgggaa gtgactactt cgatcagctt 1440

gtggccaggt cctttttcca taggcagaag gtggggcgtc ggagttacta ttacatccac 1500

gaccttatgc atgatttggc caagaaggtt tctcggtttg attgtgtgag agttgaagat 1560

gcaaagaagg agatccccaa gacagttcgg cacctgtctg tctgcagtga taccgtggca 1620

cagctcaaga gccgacctga gcttaaaaga ttgcacacgt tgctgattct caagagccct 1680

tcctcttcgc tggatcaact gccaggagat cttttcacag agctgaaaag ccttcgagtt 1740

cttggtttgg aagactgcaa tatcattcgc ctaccggaga ggattgggaa ccttaagtac 1800

atcagatacc tggcactttg caaatcaatc accaagcttc cacaagcact gacaaggctc 1860

tatcgtcttc agaccttaag tagtcctaag gggtctggcc ttgaggtccc ggaagatatc 1920

gtaaacctga cgcgtctgag acatttggac atggatacat ccaaaatcac cggcattggg 1980

aaactggttc acctgcaggg atctgtcaag ttccatgtta aaaatgaaaa aggccatact 2040

ttaggagact tgaatggtat gaatggtctt cgtaaagagc ttcatatcaa gaatcttgat 2100

cttgtagcgg ataaacaaga agcctgccag gctgggctaa acaagaagga gaatgttaag 2160

gtcctggaat tagaatggaa ctcgactggt aagattgtgc cctctagtga ggctgatgtc 2220

ttggatggcc ttgaacccaa ccaatatgtt aaaaagctta ctgttagaag atatcatggt 2280

gatagatcac caaactggct taacacaagc ttgaaagtga gtgtcttcta cgttaaatac 2340

ctgcatttgg tcaactgcag aaaatgggag gtcctgcctc ctctggggca gcttccatgc 2400

ctcaaggctt tgcgtctgaa agagatgtgt gcagtgaaaa aaatcagctt ccgtgacttc 2460

tatggaacca aatcgactgc gtttccatct ttggaggaac ttgaattcga tgatatgcct 2520

caatgggttg agtggaccca agaagagaag aatatcgatg tgctacctaa actccgtagg 2580

ctgaagcttt tgaactgtcc caagctcgtt aggttgcccc agctccctct gtccgtgagg 2640

aaggtctcgg taaaaaatac aggatttgtt tcacagctga aactatcccc ctgctcttcc 2700

tcgccatcaa acgcgtgcaa gtttaaatta gatacgtgct ctgccaccat ccttacaaat 2760

ggcttaatgc accagcaaca taaggaatca attgctactt tggctctgag gaactgtcaa 2820

gatgcaaagt ttgaagagct tgagaagctg acttccctga agagtctgca aatatgccat 2880

tcaagcatta acgatggcca gctgggcact tgtttgaggg gatcgcgagt acttacctgt 2940

ctggaattgt ccaactgcaa caacatcaca tgccttccac agatggaagg ttcagactgc 3000

ttaacaaaaa tgcatgagtt acgcattcaa cagtgttctg aattctcctc tctgcgctca 3060

ctgccaagtt ttgcggctct agaaagtgta ttgattgaaa actgctcgaa gatcactgcg 3120

ggatcgttcc ctaccgactt cagcagcaac acctctctga gaaaactggg cataatgaat 3180

tgcgttgagc tggagtcgtt gccaagcggt ttcccatctt cactgcaagt tcttcatcta 3240

attgggtgca aagcaagttt gacgaagcaa ctacaactca aggatggacc agaatgggat 3300

aaagtagcta gtattcccat aaaacaaatc cgttga 3336

<210> 2

<211> 141bp

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<220> m= G/A

<400> 2

gcggctctag aaagtgtatt gattgaaaac tgctcgaaga tcactgcggg atcgttccct 60

accgacttca gcagcaacac ctctctgaga aaactgmgca taatgaattg cgttgagctg 120

gagtcgttgc caagcggttt c 141

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctcaacgc aattcattgt gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctcactgc caagttttgc 20

<210> 5

<211> 137bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agctcaacgc aattcattat gcccagtttt ctcagagagg tgttgctgct gaagtcggta 60

gggaacgatc ccgcagtgat cttcgagcag ttttcaatca atacactttc tagagccgca 120

aaacttggca gtgagcg 137

Claims

1.一种基于与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于所述的SNP位点位于玉米基因组bin8.03区域的抗病候选基因GRMZM2G047152的开放阅读框中的第3169位，当该位点为G时，表现为抗病，当该位点为A时表现为感病；所述的GRMZM2G047152的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

以含有与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点的序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP位点有效的转化为dCAPS分子标记；其中所述的含有与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；

所述的dCAPS引物对的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’。

2.按照权利要求1所述的方法得到的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记，命名为DNdCAPS8.03-1，该分子标记的内切酶为BsiHKAI，酶切位点为GWGCWC。

3.获得权利要求2所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记的引物对，所述的引物对的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’。

4.权利要求2所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的dCAPS分子标记与位于bin2.09主效抗病位点区域的分子标记MZA6393和LSdCAP2联合使用。

6.权利要求 3所述的引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的引物对与位于bin2.09主效抗病位点区域的分子标记MZA6393和LSdCAP2联合使用。