CN102533748B - 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP-2位点，位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中，基于该SNP位点本发明建立了与玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的分子标记，具有序列表中SEQ ID NO.1中93个核苷酸序列。它是由主效抗病位点玉米基因组bin2.09区域的SNP ID序列转化得到的，该SNP-2ID序列具有序列表中SEQ ID NO.4中的121个核苷酸序列。本发明可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗病品种选育进程。

Description

与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用

技术领域

本发明涉及一种SNP位点及基于其开发的分子标记及其应用，特别涉及一种与玉米抗丝黑穗病主效抗病位点连锁的SNP位点及显著相关的分子标记及在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的应用。属于基因工程技术领域。

背景技术

玉米(Zea mays)是重要的粮食和饲料作物，在我国玉米种植面积已升至为第一位、单产和总产保持第二位，仅次于水稻(李少昆，2010)。随着世界经济的发展，物质生活水平的提高，人们对玉米的需求趋势呈刚性增长。玉米生产的高产、稳产已上升为世界粮食安全和未来经济可持续发展的重要影响因子，而玉米病害是主要限制因素之一，提高玉米品种抗病性是实现稳产、高产、优质的基础。玉米丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint.)是世界春播干旱、冷凉玉米产区普遍发生的真菌病害，也是我国玉米生产(北方春玉米区)上的主要病害之一。2002年仅因玉米丝黑穗病，东北三省直接损失玉米1.2亿kg，农民减收9600万元(以2002玉米单价，0.8元/kg)造成相当严重的经济损失(王晓鸣等，2003)。利用栽培措施和药物防治玉米丝黑穗病，既增加生产投入，又带来了环境污染。另外，前人研究已经发现在玉米种质中存抗丝黑穗病材料(王振华，2004；孙志超，2007；郭满库，2007；王燕，2010)。因此，加强培育和推广抗病品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。

抗病育种的关键在于对抗源的把握和对抗病规律的认识。前人研究显示，玉米对丝黑穗病菌的抗性属数量性状遗传、同时受加性和显性、上位性效应控制，其中基因加性效应占主导作用(马秉元等，1983；Bernardo等，1992；Akhtar等1990；王振华等，2006)。利用不同的抗丝黑穗病玉米种质构建的定位群体(BC，F2：3等)中已经初步定位了至少15个相关抗丝黑穗病的数量性状基因位点(QTL)，其中位于第2染色体的bin2.09区域的主效QTL，能在多个研究中被重复检测到，平均解释表型变异率35％左右(Lü等，1999；Lu等，1999；Li等，2008；Chen等，2008；Shi等，2010)；同时，结合分子生物信息学和功能基因组学也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因类似物(RGA，Resistance Gene Analog)和丝黑穗病抗性相关的候选基因(TUGs，tentative unique genes)(吉海莲等，2007；张书红等，2007)。但是，目前玉米种质改良和分子辅助育种中尚未有相关抗玉米丝黑穗病主效位点的分子标记开发与利用的报道。因此，分离抗丝黑穗病主效基因(或QTL)，明确其抗病遗传机制，开发功能分子标记，已成为下一步研究的目标。随着生物信息学、比较基因组学和功能基因组学的不断发展和完善，玉米自交系B73测序工作的完成与发布，为玉米重要数量性状基因(或QTL)的挖掘和分子标记的开发奠定了基础。

玉米分子标记的研究始于1975年。自从第一张分子标记遗传图谱RFLP图谱于1986年诞生以来，玉米分子标记的发展经历了RFLP、SSR到SNP标记的发展历程。研究结果表明SNPs(Single nucleotide polymorphisms)在植物基因组中是很丰富的(Drenkard et al.，2000；Nasu et al.，2002；Batley et al.，2003；Hayashi et al.，2004)。与传统的分子标记比较，SNP有可以容易检测一个小区段的优势。目前在植物中植物的抗病基因分子标记定位也开始运用SNP技术。在玉米中SNP的频率更高，这有利于在玉米中发现和运用SNP作为分子标记进行定位和基因克隆。Ching(2002)等研究了美国有代表性的36个玉米优良自交系，发现在基因组的非编码区平均每31个碱基就有一个SNP差异。在非编码区还有高频率的插入和缺失，平均每85个碱基就有一个这样的差异。Tenaillon和Rafalski报道在玉米3’端非翻译区和编码区分别有每48个碱基和130个碱基就有一个SNP差异(Tenaillon et al.，2001；Rafalski，2002)。

CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)或dCAPS(derived CAPS)标记是利用SNP位点的常用方式(Michaels and Amasino，1998)。CAPS标记是PCR反应和酶切相结合产生的一种分子标记。如果不同的材料间在PCR扩增区域有SNP位点，且该位点是限制性内切酶作用位点，那么不同材料的PCR扩增产物经特定的酶切后，再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。所以这种方法也是一种。简单的成本较低的方法。但SNP恰好位于限制性酶切位点这种情况还比较少，于是在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性。这就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法则可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记(Michaels and Amasino，1998)。

玉米自交系Mo17和齐319是抗病性突出的优良抗源。在美国和其他发达国家，分子标记辅助选择育种加速了玉米产量提高的进程，同时为亚洲玉米种质资源的生产及品质的提高提供了巨大的潜力。但在玉米抗病分子标记的应用报道较少。利用传统的表型鉴定选择，需要足够大的群体、多世代的自交或回交、适宜大小的选择强度和多环境条件的鉴定表现。寻找与目的抗病位点紧密连锁的分子标记，对于分子标记辅助抗病育种研究意义重大。所以，加快玉米抗病功能性分子标记开发，是目前研究的重点，对将来分子辅助抗病回交育种、分子辅助多个抗病基因聚合育种及主效抗病基因分离都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP(单核苷酸序列多态性)位点。

本发明的目的之二在于提供一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法。

本发明的目的之三在于提供一种与玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的分子标记以及用于扩增该分子标记的引物对。

本发明目的之四在于提供了以上所述的SNP位点以及基于SNP位点开发dCAPS分子标记及其扩增引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点，命名为SNP-2，其特征在于，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为T61C，其中核苷酸位置的编号基于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，“T61C”为SNP位点的一种表示方法，意在指明该SNP位点在SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列中的位置，并说明该位置的单核苷酸的多态性，“T61C”具体表示为该SNP位点位于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第61位，并且该位置处的核苷酸为胸腺嘧啶核苷酸(T)或为胞嘧啶核苷酸(C)。

进一步的，本发明还提供了一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于以含有与玉米抗丝黑穗病显著相关的SNP-2位点的核苷酸序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP-2位点有效的转化为dCAPs标记；其中所述的含有与玉米抗丝黑穗病显著相关的SNP-2位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的具体实施例中，所述的dCAPS引物对序列如下所示：

LSCAP2上游(F)TACATTGATATTTGCCACACGAAT(SEQ ID NO.2所示)

      下游(R)CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA(SEQ ID NO.3所示)

本发明还提供了按照以上所述的方法制备得到的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记，命名为LSdCAP2，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的分子标记是由玉米基因组主效抗丝黑穗病位点bin2.09区域的SNP-2ID序列转化得到的，是一个dCAPS分子标记，名称为LSdCAP2，来源于存在主效抗丝黑穗病位点的玉米自交系Mo17和齐319，是由对应的SNP位点SNP-2转化而来的，具有序列表中SEQ ID NO.1中119个核苷酸序列，对应的SNP位点位于序列表中SEQ ID NO.4所示的121个核苷酸序列中。

获得以上所述的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记的引物对，优选的，所述的dCAPS引物对序列如下所示：

LSCAP2上游(F)TACATTGATATTTGCCACACGAAT(SEQ ID NO.2所示)

      下游(R)CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA(SEQ ID NO.3所示)

进一步的，本发明提出了所述的与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

再进一步的，本发明提出了所述的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

更进一步的，本发明提出了所述的引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

在存在主效抗丝黑穗病位点的玉米自交系Mo17和齐319为抗性供体的回交世代中，筛选到和玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的分子标记，为进一步分离和克隆抗丝黑穗病基因奠定基础。同时该分子标记可用于玉米分子标记辅助育种工作中，用以鉴定含有主效抗丝黑穗病位点的单株材料。

由于玉米对丝黑穗病的抗性属数量性状遗传，采用前期人工菌土接种、乳熟期进行病株率调查的传统抗病性鉴定方法，耗费时间较长，本发明的dCAPS标记在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，因此可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗病品种选育进程。

本发明的目的是提供一个和玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的分子标记。

附图说明

图1是标记LSdCAP2对菌液PCR后的电泳条带；

1-18孔为LSdCAPS2引物的单克隆菌落号；M为Marker 2000

图2是标记LSdCAP2在近等基因系、亲本及感病池单株中的电泳检测照片；

电泳点样孔1-7为酶切后PCR产物，8-14孔为酶切前PCR产物，其中1孔为含Mo17供体主效位点近等基因系，2孔为含齐319供体主效抗病位点近等基因系，3孔为亲本Mo17，4孔为齐319，，5孔为黄早四，6-7孔为BC34F2感病家系单株；8-14孔DNA样品与1-7孔DNA样品依次对应；M为Marker PBR322

图3是LSdCAP2在Mo17供体创建近等基因系的抗感病BAS池中的单株验证电泳图；

由左至右，1-12孔为Mo17供体近等基因系，13-24孔为Mo17供体BC4F2感病家系单株，25孔为黄早四，26孔为Mo17，28孔为MARKER PBR322

图4是标记LSdCAP2在65份自交系中的电泳检测图；

电泳点样孔1-36为不同血缘的自交系材料，第37孔为齐319，38孔为黄早四，第40孔为Mo17；第39孔M为MARKER PBR322

图5是LSdCAP2标记在10条染色体上检索的分布图；

图6是LSdCAP2标记在玉米第2染色体上检索的分布图；

图7是LSdCAP2标记在第2染色体上检索的碱基区间分布图；

图8是LSdCAP2标记PCR产物BLAST后检索结果的详细参数及序列比对分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1.与玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的SNP位点的获得

一、含主效抗丝黑穗病位点玉米近等基因系的创建

1亲本材料

Mo17是由中国农业科学院作物育种栽培研究所，于1974年从美国引入，系187-2×C103的二环系。该系具有遗传基础丰富、配合力高、适应性广、秆强不倒、出籽率高和抗丝黑穗病等突出优点，是Lan杂优类群的代表系和测验种，其与塘四平头群、改良Reid群和旅大红骨子都具有较强的杂种优势。因Mo17抗丝黑穗病与其组配的杂交种(F1)也具有优良的抗病性，所以在北方春玉米生产上发挥了巨大的作用。

齐319是1990年由山东省农业科学院玉米研究所以外引杂交种78599为基础材料，通过二环系选育而成的优良PN类群种质，含有丰富的热带、亚热带玉米种质，配合力高，多抗性强，综合性状优良，是PB杂种优势类群的优良代表系和测验种。齐319高抗玉米丝黑穗病，对玉米南方锈病表现免疫，同时抗玉米大斑病、小斑病、青枯病、粗缩病、黑粉病等，是兼抗多种病害的优良玉米自交系。

黄早四为1975年由中国农业科学院作物育种栽培研究所与北京市农林科学院作物研究所在我国地方种质“塘四平头类群”中共同选择育成。该系具有配合力高、适应性广、耐旱性强等优点，是“塘四平头类群”的代表系和测验种，同时具有株型紧凑、花粉量多、抗大斑病和矮花叶病毒病，使在我国玉米育种中应用十分广泛。该系高感丝黑穗病，一直成为北方春玉米区直接应用的限制因素，加强对该种质的丝黑穗病抗性改良和利用意义十分重大。

2.近等基因系的基础群体及创建过程

以Mo17和齐319为抗性供体，黄早四为感病轮回亲本，在田间人工接种压力的选择下，选择极端抗病回交家系进行下一轮回交和自交鉴定。对Mo17(或齐319)抗源的抗丝黑穗病回交群体构建，主要通过选择Mo17(或齐319)群体中抗性家系的抗性单株进行下一轮回交。具体创建过程为，首先，在授粉前对Mo17(或齐319)群体中各个家系进行长势(株高、穗位和叶片)正常和性器官发育(抽雄、散粉和雌穗)正常评估，推测各家系对玉米抗丝黑穗病的抗性，经3次重复的综合评价，初步筛选出Mo17(或齐319)群体中的抗性家系及行号。第二，选择Mo17(或齐319)抗性家系中的4-5个正常单株，单独取花粉，一一对应与黄早四进行授粉杂交，同时自交，并挂牌标示好自交单株、回交单株来源。第三，乳熟期调查Mo17(或齐319)群体中家系的发病率，依据各个家系发病率在群体中的分布情况，选择位于波峰单侧极端抗性的3-5个家系的抗性自交单株及其回交单株，并进行保存，以备下一年种植。以此类推，创建出了BC4F2(2009年，哈尔滨)世代的基础近等基因系群体。

3.Mo17供体近等基因系创建方法

以BC4F2抗性家系为材料，通过田间人工接种选择抗性的单株，再通过SSR标记的连锁标记筛选、全基因组SSR标记背景检测和可能抗病区域的SSR标记检测分析，最终筛选出仅含主效抗丝黑穗病位点的抗性单株。具体操作为，首先，以主效抗丝黑穗病位点的连锁SSR标记SSR148152为工具，筛选含有纯合Mo17供体主效抗病位点的抗性单株；第二，在玉米全基因组平均随机选取324对SSR标记，利用Mo17和黄早四亲本间存在多态性的SSR标记对入选的抗性单株进行背景恢复检测分析。第三，在玉米染色体bin1.02、bin1.03、bin2.08等10个可能存在玉米抗丝黑穗病的区域内选取113个SSR标记，利用亲本Mo17与黄早四之间存在多态性的可能抗丝黑穗病区域标记SSR，对12份含主效抗丝黑穗病位点的高恢复率单株进行其他可能抗丝黑穗病的位点检测分析。对于无其他可能导入抗丝黑穗病位点的单株进行自交，从而初步获得Mo17主效抗丝黑穗病导入基因的纯合个体，即获得Mo17供体近等基因系。

4.齐319供体近等基因系创建方法

以BC4F2抗性家系为材料，通过田间人工接种选择抗性的单株，再通过SSR标记的连锁标记筛选、全基因组SSR标记背景检测和可能抗病区域的SSR标记检测分析，最终筛选出仅含主效抗丝黑穗病位点的抗性单株。具体操作为，首先，用主效抗丝黑穗病位点的连锁SSR标记umc2077、bnlg1893和umc1525，筛选含有齐319供体纯合主效抗病位点的抗性单株；第二，在玉米全基因组平均随机选取324对SSR标记，利用齐319和黄早四亲本间存在多态性的SSR标记对入选的抗性单株进行背景恢复检测分析。第三，在玉米染色体bin1.02、bin1.03、bin2.08等10个可能存在玉米抗丝黑穗病的区域内选取113个SSR标记，利用亲本齐319与黄早四之间存在多态性SSR的标记，对12份含主效抗丝黑穗病位点的高恢复率单株进行其他可能抗丝黑穗病的位点检测分析。对于无其他可能导入抗丝黑穗病位点的单株进行自交，从而初步获得齐319主效抗丝黑穗病导入基因的纯合个体，即获得齐319供体近等基因系。

二、玉米抗丝黑穗病主效区域染色体2.09内的SNP分析

本研究以抗性高且稳定的近等基因系L35(平均发病率为2.33％，Mo17抗源，BC4F4)、L271(平均发病率为2.9％，齐319抗源，BC4F4)、亲本Mo17、齐319、黄早四(感病轮回亲本)及已知抗、感的16份自交系材料进行基因芯片分析，最终获得主效抗丝黑穗病位点(染色体2.09区域内)的抗病相关SNP信息，其中16份自交系材料的2.09区域基因芯片分析数据由中国农业科学院作物所玉米研究室提供。而16份自交系的材料选择，参考于玉米抗丝黑穗病主效位点的供体亲本Mo17(R)和齐319(HR)，二者分别来自于LAN血缘和PB血缘材料，感病轮回亲本为黄早四(HS)，源于感丝黑穗病的SPT血缘材料。为此，选择了LAN血缘4份、PB血缘3份和其他血缘1份，共计8份抗性自交系，田间接种发病率在0-2.25％之间，抗病级别分别属于HR和R；选择了SPT血缘5份、PB血缘1份和其他血缘2份，共计8份的高感病自交系，其田间接种发病率在53.15％-89.1％之间，抗病级别分别属于HS(见表1)。

在bin2.09区域检索到抗性差异的SNP信息(自交系的芯片数据由中国农业科学院作物所玉米育种研究室和东北农业大学玉米研究中心共同合作完成，见表2)。

表1  16份自交系芯片材料的抗病和感病分类表

表2  在玉米染色体bin2.09区域内检索的抗性差异SNP ID序列信息

实施例2.与玉米抗丝黑穗病主效抗病位点显著相关的SNP标记转化为dCAPS分子标记

一、基于SNP位点的dCAPs标记开发方法

以与玉米抗丝黑穗病显著相关的SNP-2位点ID信息为基础序列，利用在线工具(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶。通过MAIZEGDB网站的BLAST功能需找与其高度同源的BAC序列，并将其下载至电脑中，再利用DNAMAN软件将SNP-2位点ID信息与下载的BAC序列进行比对分析，查找SNP位点ID信息的区域并以突变位点为中心向两边扩展碱基序列，总长度约500bp。再利用primer5.0软件，固定SNP位点一端(带改变碱基的酶切位点)的引物，使突变位点为PCR扩增延伸的第一个碱基，而后用该软件需找另一端合适的引物；要求，退火温度(Tm)值约60℃，将上、下游引物TM值调至相近，产物大小为90-140bp左右。将设计的引物下载，并在其中固定的一条引物链中，根据所选择的限制性内切酶，变化相应的1-2个碱基，复查后合成引物。引物由北京奥科生物科技有限公司合成(见表3)。

表3  基于SNP位点开发的dCAP_S引物信息表

将设计好的dCAPs标记通过PCR扩增、琼脂糖电泳检测、PCR扩增产物的限制性内切酶酶切和聚丙烯酰胺凝聚电泳检测来分析引物的可用性。SNP-2有效的转化为dCAPs标记。

1.dCAPs标记的PCR扩增

利用设计好的dCAPs标记上下游引物，在近等基因系L35、L271、亲本Mo17、齐319、黄早四中进行PCR扩增，对合成引物进行预扩产物效果验证，判断扩增条带大小与设计的目的条带是否一致，同时验证引物设计的扩增效果(条带清晰度和稳定性)是否理想。PCR的反应体系见表4。

表4  dCAPs引物PCR的反应体系

dCAPs引物PCR的热反应程序：

2.PCR扩增产物的限制性内切酶酶切检验

对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切检验，限制性酶切反应体系见表5。

表5  dCAPs标记PCR产物的限制性内切酶信息表

表6  dCAPs标记PCR产物限制性酶切反应体系(不含BSA)

3.聚丙烯酰胺凝聚电泳检验

对酶切后的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝聚电泳检验，方法如下：

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳设备

仪器：BIO-RADPowerpae 5000型电泳仪

胶型：38cm×32cm×0.4mm

凝胶：4.5％聚丙烯酰胺胶(变性胶)

(2)电泳程序

(1)清洗电泳板和灌胶

①清洗玻璃板：用自来水及洗涤剂小心严格地将玻璃板洗净，用吸水纸擦干，然后用76％酒精擦拭，再用95％的乙醇擦洗一遍，自然风干，最后小板用面巾纸均匀涂2mL 0.5％的亲和硅烷(Binding Silane)，耳朵板用面巾纸均匀涂2mL 2％的剥离硅烷(Repel Silane)，操作过程中防止两块玻璃板相互污染，让其充分晾干。

②用200mL的灌胶罐加入变性胶、N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)和25％的过硫酸胺(APS)，避免进入气泡，然后顺着灌胶板的上口慢慢将胶推入，然后将梳子平齐一侧慢慢插入胶液中防止产生气泡。用水平仪测将玻璃板调至水平，凝固至少需要2小时。

(2)电泳

①酶切后的扩增产物变性：加入5μL3×Lodaing Buffer(100％Formamide；0.5MEDTA，pH＝8.0；Brph Blue；X.lund)，95℃变性5min。

②预电泳45min固定功率100W。上槽电泳缓冲液为0.5×TBE(Tris Base，BoricAcid，0.5M EDTA，pH＝8.0)，下槽电泳缓冲液为1×TBE(Tris Base，Boric Acid，0.5MEDTA，pH＝8.0)。

③插好梳子，先将泳道中的气泡和多余的胶吹出，先在每泳道点样约4μL，再点对照亲本约4μL。

④电泳，固定功率75W。至溴酚兰接近板底。

(3)快速银染显色

①电泳完毕，取下胶板，剥起耳朵板。

②固定：用1.5L 0.5％的乙酸(含10％的乙醇)蒸馏水定容，清洗5min。

③漂洗：用1.5L蒸馏水清洗2.5min。

④银染：用0.12％左右的AgNO3固定7min～10min。

⑤漂洗：用1.5L蒸馏水快速冲洗，冲洗时间不超过30s。

⑥显影：用1.5L 1.5％的NaOH(含0.5％的甲醛)显影5min～7min。

⑦漂洗：用1.5L水蒸馏水冲洗5min。

⑧干胶：从水中取出自然凉干。

三、基于SNP位点的dCAPs标记的单克隆及鉴定方法

LSdCAP2标记的PCR产物为材料，利用琼脂糖凝胶回收目的片断，再通过连接、转化和摇菌步骤，获得每个标记的单克隆，利用原引物对菌液直接进行PCR(见附图1)，鉴定片断后，将菌液送出测序，再利用DNAMAN软件对测序获得的结果与目的片段序列进行比对分析。

1.琼脂糖凝胶目的片断回收

对于琼脂糖凝胶电泳分离的DNA产物，利用天为时代DNA回收纯化试剂盒进行回收和纯化。其具体步骤为：

在长波紫外灯下用干净灭菌手术刀片切下单一的目的DNA带(尽量切除多余部分)，放入1.5ml已灭菌的eppendorf管中，称取重量；

向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴10min，期间震荡3次；

将溶胶液加入一个吸附柱CA2(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

向吸附柱中加入700μl漂洗液PW(已加好无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；

向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。将离心吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数min，彻底地凉干，以防止残留的漂洗液干扰下一步实验；

将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm离心1min收集DNA溶液；

为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6)；

去掉离心柱，将回收DNA放-20℃保存；

2 连接

载体应用天为时代公司的pMD18-T克隆试剂盒载体系统，具体步骤为：把试剂放在冰上溶解，在0.2μL离心管中依次加入以下成分：pMD18-T载体1.5μl，连接缓冲液4.5μl，回收的DNA4μl，16℃保温3h。

3 培养基配制

LB液体培养基(1000ml)：酵母提取物(Basto-Yeast extract)5g，蛋白胨(Bacto-typtone)10g，NaCl 10g。

LB固体培养基：1000mlLB液体培养基中加入15g琼脂。高压灭菌后加入Ampicillin(100mg/ml)铺平板，每100ml加入60ulAmp。

4 转化

将100μl感受态细胞DH5α于冰浴上解冻；

将5μl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min；

42℃热激90s；

迅速将管移到冰浴中，冰浴2-3min；

加入900μl预冷的LB液体培养基，37℃轻摇培养60min；

取200μl菌液、8μl IPTG(100mg/ml)、4μl X-Gal(20mg/ml)加在含amp的LB固体筛选培养基上，用无菌玻璃涂布器均匀涂在平板上，自然干燥5-10min；

将平板在37℃倒置培养12-16h，至长出大小适宜的菌落；

将长有菌落的平板放在4℃冰箱中数小时，使蓝色充分显现。培养皿上生长着许多白色和蓝色菌落，蓝色菌落只含有载体，而白色菌落为DNA重组子。

5 摇菌

挑取典型白色菌落，放入含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养10-12h，利用原引物对菌液直接进行PCR，鉴定片断后，将菌液送出测序。

6.测序结果的比对分析

为了保证序列的正确性，每个片断选取2-4个克隆送去测序，利用DNAMAN对测序结果和设计引物的PCR片段进行比较，结果完全一致。同时对SSR148152，umc1525，bnlg1893和umc2077的PCR产物进行胶回收和单克隆，其中umc1525和bnlg1893没有回收成功。所测得的序列如下：

5’-TACATTGATATTTGCCACACGAATACGTCAGTCCTCTTAAGGGAGGAGGTCGCTAGATCTTCGGGCATCTGCTGTAAATCACTCGTTGATTTG-3’

四、抗性近等基因系和感病家系的dCAPS标记分析结果

为了对新开发出的dCAPs标记进行功能性分析，组建了Mo17和齐319群共同组建的玉米抗丝黑穗病的BSA池(见表7)。首先，抗病池由Mo17和齐319群的各自12份抗丝黑穗病近等基因系，共计24份材料组建，其中Mo17群的近等基因系由标记SSR148152跟踪，齐319群的近等基因系由标记umc1525，bnlg1893和umc2077跟踪。第二，感病池由BC4F2世代的Mo17和齐319群体中的高感家系单株各12份而组成，共计24个单株，利用卡方适合性检验评价新开发的dCAPs标记在群体中与玉米抗丝黑穗病主效抗性位点的相关性。

表7  Mo17和齐319群体中优选的抗、感丝黑穗病池材料表

注：“a”中Mo17群12个近等基因系，编号为L161、L165、L167、L171、L169、L164、L166、L168、L170、L162、L163和L173；“b”齐319群12个近等基因系，编号为L417、L410、L418、L419、L412、L415、L408、L411、L416、L413、L421和L409；“c”和“d”中Mo17群和齐319群的BC4F2感病家系单株由玉米主效抗丝黑穗病位点连锁标记筛选BSA池的感病池中随机抽取。

经卡方适合性检验表明，新开发标记LSdCAP1、LSdCAP2、LSdCAP3、LSdCAP4、LSdCAP7-1和LSdCAP7-2的卡方值分别为0.0208、0.0208、0.1875、0.0208、0.0208和0.0208，其值均小于0.05水平的卡方值3.84(见表8)，其标记的抗性突变位点与玉米抗丝黑穗病的主效抗病位点具有较好的相关性，说明6个dCAPs标记均与玉米抗丝黑穗病的主效抗病位点显著相关。

表8  dCAPs标记在创建近等基因系的抗病池和感病池中的卡方检测分析表

实施例3.dCAPS分子标记染色体物理位置碱基序列位置信息查找

针对dCAPS标记的有效扩增序列信息，以B73RefGen_v1 sequence为参照序列，在MAIZEGDB网站的BLAST和Locus Lookup功能项中查找相应标记在玉米染色体上的具体物理位置，将与玉米主效抗丝黑穗病位点相关的12个分子标记分别定位在玉米染色体bin2.09区域，具体的查找结果如下：

一、LSdCAP2标记PCR产物BLAST后查找的图例分析

结果如图5-7。图5显示LSdCAP2标记在10条染色体上的检索分布图，图6显示LSdCAP2标记在第2染色体上的检索分布图，图7显示LSdCAP2标记在第2染色体上检索的碱基区间分布图。

二、LSdCAP2标记PCR产物BLAST后检索结果的详细参数及序列比对分析

结果如图8所示。

三、LSdCAP2标记通过BLAST检索后查找到的具体碱基位置

LSdCAP2标记在第2染色体上检索的具体碱基位置在227,921,313和227,921,405之间。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的单核苷酸多态性分子标记，含有SNP位点，命名为SNP-2，其特征在于，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为T61C，其中核苷酸位置的编号基于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于以含有与玉米抗丝黑穗病显著相关的SNP-2位点的核苷酸序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP-2位点有效的转化为dCAPS标记；其中所述的含有与玉米抗丝黑穗病显著相关的SNP-2位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述的SNP-2位点为T61C；所述的dCAPS引物对序列如下所示：

上游（F）TACATTGATATTTGCCACACGAAT

下游（R）CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA。

3.按照权利要求2所述的方法得到的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记，命名为LSdCAP2，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.一种引物对，其特征在于其为获得权利要求3所述的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记的引物对；所述的dCAPS引物对序列如下所示：

上游（F）TACATTGATATTTGCCACACGAAT

下游（R）CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA。

5.权利要求1所述的与玉米抗丝黑穗病基因连锁的单核苷酸多态性分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

6.权利要求3所述的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

7.权利要求4所述的引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。

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