CN104498590B - 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用 - Google Patents

基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104498590B
CN104498590B CN201410675830.4A CN201410675830A CN104498590B CN 104498590 B CN104498590 B CN 104498590B CN 201410675830 A CN201410675830 A CN 201410675830A CN 104498590 B CN104498590 B CN 104498590B
Authority
CN
China
Prior art keywords
corn
zmnl
smut
head
dcaps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410675830.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104498590A (zh
Inventor
邸宏
王振华
曾兴
张�林
刘显君
阚帅帅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Agricultural University filed Critical Northeast Agricultural University
Priority to CN201410675830.4A priority Critical patent/CN104498590B/zh
Publication of CN104498590A publication Critical patent/CN104498590A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104498590B publication Critical patent/CN104498590B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用。本发明利用生物信息学方法在玉米主效抗丝黑穗病区域(bni2.09)预测到抗病基因ZmNL，针对该基因外显子1的序列设计引物，比对从感病自交系黄早四与抗病玉米自交系Mo17扩增出的序列，挖掘到抗感材料间存在的差异SNP位点，并转化成分子标记LSdCAP8，其效用在38份抗病性不同的玉米资源中得到了验证。结果表明，本发明的一种dCAPS分子标记可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗病品种的选育进程。

Description

基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8 及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗玉米丝黑穗病候选基因及基于其开发的分子标记及其应用，特别涉及一种抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL及基于该基因开发的分子标记LSdCAP8，还涉及该分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的应用。本发明属于基因工程技术领域。
背景技术
玉米丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint.)是世界春播干旱、冷凉玉米产区普遍发生的真菌病害，也是我国玉米生产(北方春玉米区)上的主要病害之一。2002年仅因玉米丝黑穗病，东北三省直接损失玉米1.2亿kg，农民减收9600万元(以2002玉米单价，0.8元/kg)造成相当严重的经济损失(王晓鸣等，2003)。利用栽培措施和药物防治玉米丝黑穗病，既增加生产投入，又带来了环境污染。另外，前人研究已经发现在玉米种质中存抗丝黑穗病材料(王振华，2004；孙志超，2007；郭满库，2007；王燕，2010)。因此，加强培育和推广抗病品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。抗病育种的关键在于对抗源的把握和对抗病规律的认识。
玉米丝黑穗病抗性属数量性状遗传，同时受到加性、显性和上位性效应协同控制，其中以加性和显性效应为主，同时抗病性与生态条件、水热条件有关，且易受母本类型和各种修饰因子的影响。目前，关于玉米丝黑穗病的分子遗传研究主要集中在玉米丝黑穗病抗病QTL定位和玉米丝黑穗病抗病相关候选基因挖掘两方面。
利用不同的抗丝黑穗病玉米种质构建的定位群体(BC，F2:3等)中已经初步定位了至少15个与抗丝黑穗病相关的数量性状基因位点(QTL)，其中位于第2染色体的bin2.09区域的主效QTL，能在多个研究中被重复检测到，平均解释表型变异率35％左右(Lü等，1999；Lu等，1999；Li等，2008；Chen等,2008；Shi等，2010)；同时，结合分子生物信息学和功能基因组学也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因类似物(RGA，Resistance Gene Analog)和丝黑穗病抗性相关的候选基因(TUGs，tentative unique genes)(吉海莲等，2007；张书红等，2007)。
玉米分子标记的研究始于1975年。自从第一张分子标记遗传图谱RFLP图谱于1986年诞生以来，玉米分子标记的发展经历了RFLP、SSR到SNP标记的发展历程。研究结果表明SNPs(Single nucleotide polymorphisms)在植物基因组中是很丰富的(Drenkard etal.，2000；Nasu et al.，2002；Batley et al.，2003；Hayashi et al.，2004)。与传统的分子标记比较，SNP有可以容易检测一个小区段的优势。目前在植物中植物的抗病基因分子标记定位也开始运用SNP技术。在玉米中SNP的频率更高，这有利于在玉米中发现和运用SNP作为分子标记进行定位和基因克隆。Ching(2002)等研究了美国有代表性的36个玉米优良自交系，发现在基因组的非编码区平均每31个碱基就有一个SNP差异。在非编码区还有高频率的插入和缺失，平均每85个碱基就有一个这样的差异。Tenaillon和Rafalski报道在玉米3’端非翻译区和编码区分别有每48个碱基和130个碱基就有一个SNP差异(Tenaillon etal.，2001；Rafalski，2002)。
CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)或dCAPS(derivedCAPS)标记是利用SNP位点的常用方式(Michaels and Amasino,1998)。CAPS标记是PCR反应和酶切相结合产生的一种分子标记。如果不同的材料间在PCR扩增区域有SNP位点，且该位点是限制性内切酶作用位点，那么不同材料的PCR扩增产物经特定的酶切后，再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。所以这种方法也是一种。简单的成本较低的方法。但SNP恰好位于限制性酶切位点这种情况还比较少，于是在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性。这就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法则可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记(Michaels and Amasino,1998)。
分子生物技术及生物信息技术的飞速发展为玉米丝黑穗病抗病候选基因的发掘和分子标记的开发提供了良好的平台。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子中与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP(单核苷酸序列多态性)位点。
本发明的目的之二在于提供一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法。
本发明的目的之三在于提供一种位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子中dCAPS的分子标记以及用于扩增该分子标记的引物对。
本发明目的之四在于提供了以上所述的SNP位点以及基于SNP位点开发dCAPS分子标记及其扩增引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明利用生物信息学手段，在抗丝黑穗主效位点所在的玉米染色体2.09区域内预测到抗病基因ZmNL，该基因包含2个外显子，根据长度为888bp的1号外显子侧翼序列设计引物，分别以高感玉米丝黑穗病自交系黄早四和高抗病自交系Mo17的基因组总DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行序列比对，发现1个抗感材料间存在差异的SNP位点。
本发明的一种与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为C22G，其中核苷酸位置的编号基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
其中，“C22G”为SNP位点的一种表示方法，意在指明该SNP位点在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的位置，并说明该位置的单核苷酸的多态性，“C22G”具体表示为该SNP位点于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第22位，并且该位置处的核苷酸为胞嘧啶核苷酸(C)或为鸟嘌呤核苷酸(G)。
进一步的，本发明还提供了一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于以含有位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子中的SNP位点的核苷酸序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP位点有效的转化为dCAPs标记；其中所述的含有位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子中的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的具体实施例中，所述的dCAPS引物对序列如下所示：
LSCAP8上游(F)CGACAACGCCCGCCATCGCCG(SEQ ID NO.2所示)下游(R)TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT(SEQ ID NO.3所示)
本发明还提供了按照以上所述的方法制备得到的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记，含有SNP位点，命名为LSdCAP8，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为C22G，其中核苷酸位置的编号基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的分子标记是由位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中的SNP位点转化得到的，是一个dCAPS分子标记，命名为LSdCAP8，来源于高感丝黑穗病玉米自交系黄早四和存在主效抗丝黑穗病位点的玉米自交系Mo17，具有序列表中SEQ ID NO.1中132个核苷酸序列，对应的SNP位点位于序列表中SEQ ID NO.1所示的132个核苷酸序列中。
由于玉米对丝黑穗病的抗性属数量性状遗传，采用前期人工菌土接种、乳熟期进行病株率调查的传统抗病性鉴定方法，耗费时间较长，本发明的dCAPS标记在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，因此可用于玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种，加速玉米抗病品种选育进程。
本发明的目的是提供一个位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子中的分子标记。
附图说明
图1是Fgenesh预测基因ZmNL外显子的结果；
TSS.转录起始位点；CDSf.起始外显子；CDSI.末端外显子
图2是抗丝黑穗病基因候选基因ZmNL外显子1部分片段PCR扩增结果；
M为分子量标准Marker，1和2为黄早四扩增产物，3和4为Mo17扩增产物
图3是黄早四和Mo17测序比对结果；
Query为高感丝黑穗病玉米自交系黄早四的序列，Sbjct为高抗丝黑穗病玉米自交系Mo17的序列
图4是LSdCAP8在黄早四和Mo17中PCR扩增产物酶切前和酶切后的结果比对。
M为天根公司分子量标准50bp marker，1和2为黄早四扩增产物，3和4为Mo17扩增产物
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL的预测
本发明以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2.09区域的DNA序列为研究对象，利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，应用NCBI网站中的ORF Finder工具识别预测出的序列开放阅读框(ORF)，选择其中含有抗病保守结构域的序列，其中包括：锌指结构(参与核酸和锌离子结合)、DNA聚合酶(DNA聚合酶活性中心)、反转录酶(指示移动因子)、GTP活化蛋白(可以激活活性的酶原)、NBS及LRR结构(抗性保守结构域)等。
发现1个玉米抗丝黑穗病候选基因，命名为ZmNL。ZmNL基因预测结果如图1所示，ZmNL基因全长8640bp，转录起始于1993bp，终止于8264bp，具有典型的PolyA尾巴，为完整的基因。ZmNL基因包含两个外显子，一个内含子。其中外显子1全长888bp(2314bp-3201bp)，外显子2全长2250bp(6014bp-8264bp)。
实施例2玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中SNP位点的获得
利用Primer5.0引物设计软件对玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1的序列进行引物设计，分别以高感玉米丝黑穗病自交系黄早四和高抗病自交系Mo17的基因组总DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行序列比对。
引物序列如下：
上游(F)：5’AAGATCGAGCGACGTAGTTG 3’
下游(R)：5’TAGCACCTCATTCCAACAGA 3’
从高感玉米丝黑穗病自交系黄早四和高抗病自交系Mo17中均能扩增出长度约为1044bp的特异性条带，与所用引物预期的扩增片段大小一致。所获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。
PCR产物进行回收和纯化，采用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-BluntCloning Kit试剂盒对纯化后的产物进行T载体的连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞进行转化，最后在含有Amp、IPTG和X-Gay的固体LB平板上筛选重组体。在含有蓝白斑的LB平板中挑选白色单菌落接种于LB/Amp的液体培养基中，200rpm，培养16小时左右，将菌液作为PCR的模板进行PCR鉴定，PCR产物大小与目的片段大小一致，将菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，每个样品三次重复。
测序结果去除T载体后，将2个实验材料的序列进行比对，结果表明，黄早四和Mo17测出的候选序列相似性极高，存在2个SNP差异位点，分别为G17C和C291G(其中核苷酸位置的编号基于图3所示的核苷酸序列)，序列比对结果见图3。
实施例3玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中SNP位点转化为dCAPS分子标记
一、基于SNP位点的dCAPs标记开发方法
玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中SNP C291G位点信息为基础序列，利用在线工具(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶。通过MAIZEGDB网站查找以SNP突变位点为中心向两边扩展碱基序列，总长度约500bp。再利用primer5.0软件，固定SNP位点一端(带改变碱基的酶切位点)的引物，使突变位点为PCR扩增延伸的第一个碱基，而后用该软件需找另一端合适的引物，产物大小为90-140bp左右。将设计的引物下载，并在其中固定的一条引物链中，根据所选择的限制性内切酶，变化相应的1个碱基，由北京奥科生物科技有限公司合成引物。
表1 由SNP位点转化的dCAPS标记引物、限制性内切酶
所获得dCAPs分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为C22G，其中核苷酸位置的编号基于SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
二、LsdCAP8标记在抗感材料间的验证
1.dCAPs引物的PCR扩增
利用设计好的dCAPs标记上下游引物，在高感玉米丝黑穗病自交系黄早四和高抗病自交系Mo17中进行PCR扩增，验证引物设计的扩增效果。PCR的反应体系见表2。
表2 dCAPs引物PCR的反应体系
dCAPs引物PCR的热反应程序：
2.PCR扩增产物的限制性内切酶酶切检验
对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切检验，限制性酶切反应体系按照AciI限制性内切酶说明，20微升反应体系，酶切温度为37℃，时间为3h，65℃加热10min终止酶切反应。
3.聚丙烯酰胺凝聚电泳检验
对酶切前和酶切后的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝聚电泳检验，方法如下：
(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳设备
仪器：BIO-RADPowerpae 5000型电泳仪
胶型：38cm×32cm×0.4mm
凝胶：4.5％聚丙烯酰胺胶(变性胶)
(2)电泳程序
⑴清洗电泳板和灌胶
①清洗玻璃板：用自来水及洗涤剂小心严格地将玻璃板洗净，用吸水纸擦干，然后用76％酒精擦拭，再用95％的乙醇擦洗一遍，自然风干，最后小板用面巾纸均匀涂2mL0.5％的亲和硅烷(Binding Silane)，耳朵板用面巾纸均匀涂2mL 2％的剥离硅烷(RepelSilane)，操作过程中防止两块玻璃板相互污染，让其充分晾干。
②用200mL的灌胶罐加入变性胶、N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和25％的过硫酸胺(APS)，避免进入气泡，然后顺着灌胶板的上口慢慢将胶推入，然后将梳子平齐一侧慢慢插入胶液中防止产生气泡。用水平仪测将玻璃板调至水平，凝固至少需要2小时。
⑵电泳
①酶切后的扩增产物变性：加入5μL 3×Lodaing Buffer(100％Formamide；0.5MEDTA,pH＝8.0；Brph Blue；X.lund)，95℃变性5min。
②预电泳45min固定功率100W。上槽电泳缓冲液为0.5×TBE(Tris Base,BoricAcid,0.5M EDTA,pH＝8.0)，下槽电泳缓冲液为1×TBE(Tris Base,Boric Acid,0.5MEDTA,pH＝8.0)。
③插好梳子，先将泳道中的气泡和多余的胶吹出，先在每泳道点样约4μL，再点对照亲本约4μL。
④电泳，固定功率75W。至溴酚兰接近板底。
(3)快速银染显色
①电泳完毕，取下胶板，剥起耳朵板。
②固定：用1.5L 0.5％的乙酸(含10％的乙醇)蒸馏水定容，清洗5min。
③漂洗：用1.5L蒸馏水清洗2.5min。
④银染：用0.12％左右的AgNO3固定7min～10min。
⑤漂洗：用1.5L蒸馏水快速冲洗，冲洗时间不超过30s。
⑥显影：用1.5L 1.5％的NaOH(含0.5％的甲醛)显影5min～7min。
⑦漂洗：用1.5L水蒸馏水冲洗5min。
⑧干胶：从水中取出自然凉干。
聚丙烯酰胺凝聚电泳结果见图4，由高感玉米丝黑穗病自交系黄早四扩增出的条带能够被AciI内切酶切开，由高抗病自交系Mo17中扩增出的条带不能被切开，对PCR扩增产物与酶切产物大小与预计的结果相符合。
实施例4由玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中SNP位点转化的LsCAPS8分子标记的应用
为了对新开发出的LsdCAPs8标记进行功能性分析，选取了38份抗病性不同玉米自交系为试材，其中属于兰卡斯特(LAN)类群的自交系16份，PB类群的自交系14份，唐四平头类群(SPT)的自交系8份。在3叶期提取叶片总DNA，利用LsCAPS8分子标记的引物进行PCR扩增，扩增产物使用AciI限制性内切酶酶切，能够切开的为感病材料，记为“S”，不能切开的为抗病材料，记为“R”。
将LsdCAP8检验的结果与44份自交系历年平均发病率及抗性评价结果进行对比分析，结果见表4。由表4可见，LsdCAP8分子标记在LAN类群的16份自交系中14份检测结果与田间抗性评价结果一致，准确率为87.5％；在14份PB类群的玉米自交系中有12份检测结果与田间抗性评价结果一致，准确率为85.7％；在8份SPT类群的玉米自交系中有6份检测结果与田间抗性评价结果一致，准确率为75％。
表4 LsdCAP8分子标记在检测38份抗病性不同的玉米资源中的应用
注：HR表示高抗丝黑穗病；R表示抗丝黑穗病；MR表示中抗丝黑穗病；S表示感丝黑穗病；HS表示高感丝黑穗病
对38份玉米自交系进行LsdCAP8标记平均检测准确率达到84.2％，说明该标记可以有效的识别感丝黑穗病材料(S)和高感丝黑穗病材料(HS)，在今后的玉米丝黑穗病的分子辅助育种中，可以利用这个标记进行抗、感材料的筛选，进而加速抗丝黑穗病育种进程。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中的dCAPS分子标记，命名为LSdCAP8，含有SNP位点，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，所述的SNP位点为C22G，其中核苷酸位置的编号基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种基于SNP位点开发dCAPS分子标记的方法，其特征在于以含有位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中的SNP位点的核苷酸序列为基础序列，设计dCAPS引物对，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，使SNP位点有效的转化为dCAPs标记；其中所述的含有位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的dCAPS引物对序列如下所示：
LSCAP8上游(F)CGACAACGCCCGCCATCGCCG
下游(R)TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT。
3.一种引物对，其特征在于其为获得权利要求1所述的一种位于玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL外显子1中的dCAPS分子标记的引物对；所述的引物对序列如下所示：
LSCAP8上游(F)CGACAACGCCCGCCATCGCCG
下游(R)TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT。
4.权利要求1所述的与玉米抗丝黑穗病基因紧密连锁的dCAPS分子标记在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。
5.权利要求3所述的引物对在玉米抗丝黑穗病分子标记辅助育种中的用途。
CN201410675830.4A 2014-11-21 2014-11-21 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用 Active CN104498590B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410675830.4A CN104498590B (zh) 2014-11-21 2014-11-21 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410675830.4A CN104498590B (zh) 2014-11-21 2014-11-21 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104498590A CN104498590A (zh) 2015-04-08
CN104498590B true CN104498590B (zh) 2017-01-25

Family

ID=52940040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410675830.4A Active CN104498590B (zh) 2014-11-21 2014-11-21 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104498590B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636386B (zh) * 2016-12-13 2020-09-25 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病次主效位点连锁的分子标记DNdCAPS8.03-1及其应用
CN109652578B (zh) * 2018-11-30 2022-06-14 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司 高通量检测玉米抗丝黑穗病基因分型的方法及其试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010022328A2 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic loci associated with head smut resistance in maize
CN102533748A (zh) * 2012-02-13 2012-07-04 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用
CN102533747A (zh) * 2012-02-13 2012-07-04 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP4及其应用
CN102559668A (zh) * 2012-02-13 2012-07-11 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP3及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010022328A2 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic loci associated with head smut resistance in maize
CN102533748A (zh) * 2012-02-13 2012-07-04 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用
CN102533747A (zh) * 2012-02-13 2012-07-04 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP4及其应用
CN102559668A (zh) * 2012-02-13 2012-07-11 东北农业大学 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP3及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of SNP-based dCAPS markers linked to major head smut resistance quantitative trait locus qHS2.09 in maize;Hong D et al.;《Euphytica》;20140729;第202卷(第1期);摘要，材料和方法，结果，讨论 *
抗玉米丝黑穗病分子标记辅助育种研究;邢跃先等;《玉米科学》;20121231;第20卷(第6期);9-13 *
玉米主效抗丝黑穗病候选基因预测即dCAPS标记开发;阚帅帅;《中国优秀硕士论文全文数据库 农业科技辑》;20130315(第3期);摘要，2材料与方法，3结果与分析，5结论 *
玉米抗丝黑穗病主效位点连锁分子标记利用效率的初步分析;杨剑飞等;《玉米科学》;20140815;第22卷(第4期);44-49 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104498590A (zh) 2015-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fulnecek et al. Evolution and structure of 5S rDNA loci in allotetraploid Nicotiana tabacum and its putative parental species
CN103952402B (zh) 一种与植物根系性状相关的snp位点及其应用
CN102154281B (zh) 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0010
CN105349671B (zh) 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法
CN107475426A (zh) 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用
CN104630215A (zh) 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法
CN109971865A (zh) 一种与凡纳滨对虾体重性状显著相关的snp标记和应用
CN111690763A (zh) 用于枸杞品种鉴定的dna条形码及其鉴定方法
CN103993013B (zh) 一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用
CN104109666A (zh) 小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用
CN107400715A (zh) 十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用
CN104498590B (zh) 基于抗玉米丝黑穗病候选基因ZmNL开发的分子标记LSdCAP8及其应用
CN109735648B (zh) 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒
CN102127597B (zh) 一种长穗偃麦草e组染色体特异rapd-scar分子标记
CN103215289B (zh) 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法
CN102690812A (zh) 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0067
CN104531882A (zh) 鉴定小麦新矮秆主效qtl的分子标记的引物对、方法及应用
CN104818272B (zh) 一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52及其应用
CN103333886A (zh) 一种利用dna熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记
CN102533748B (zh) 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP2及其应用
CN102559668B (zh) 与玉米抗丝黑穗病基因连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记LSdCAP3及其应用
CN113046466B (zh) 一组与小麦白粉病抗性显著关联的snp位点及其在遗传育种中的应用
KR101410329B1 (ko) Ｔｓｗｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트
CN104762298A (zh) 一种水稻苗期耐盐基因qST11及其分子标记方法
CN105671180B (zh) 导致小麦粒重增加的相关基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant