CN103993013B

CN103993013B - 一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN103993013B
Application number: CN201410250226.7A
Authority: CN
Inventors: 童治军; 肖炳光; 李永平; 陈学军; 方敦煌
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-06-09
Also published as: CN103993013A

Abstract

本发明提供了一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用。本发明所述的分子标记为TM29和TM50，在第20号基因连锁群上分别位于基因Ph两侧，与之紧密连锁，分子标记TM29与Ph基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与Ph基因的遗传距离为0.148cM。本发明还提供了一种利用所述分子标记检测烟草黑胫病抗性基因Ph的分子标记方法，以及所述分子标记在烟草分子辅助育种和烟草黑胫病抗性基因Ph定位中的应用。利用本发明的分子标记辅助育种选择目标明确，节约成本，显著提高了选择效率，不仅为烟草黑胫病的育种提供了抗源筛选方法，而且可进一步通过染色体步移法接近基因Ph，从而为基因Ph的克隆奠定基础。

Description

一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子遗传学和烟草种质创新技术领域，具体涉及一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用。

背景技术

烟草黑胫病是由烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae) 引起的一种土传真菌病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一，其发生蔓延很快，往往在1~2周之内可以使整个烟田毁灭，破坏性极强，大田侵染后常造成烟株整株死亡，造成了巨大的经济损失（王万能，肖崇刚. 烟草黑胫病的综合防治及其研究进展. 广西农业科学,2003(2):42-43.）。防治烟草黑胫病最安全、经济有效的措施之一是培育抗病品种。

烟草黑胫病的抗源主要有4个，即雪茄烟品种Florida301，晾晒烟品种Beinhart-1000、烟草野生种蓝茉莉叶烟草（Nicotiana Plumbaginifolia）和长花烟草（Nicotianalongiflora）。目前，烟草生产上广泛应用的抗源大都来自N.plumbaginifolia和Florida301。N.plumbaginifolia的抗性为显性单基因Ph控制（Campbell K G, Wernsman EA.Selection among haploid saprophytes for resistance to black shank intobacco. Crop Scencei,1994，6 (34):662-667.），高抗烟草黑胫病的0号小种（Nielsen MT. Black Shank Collaborative Study. CORESTA Paris France: Crestar InformationBulletin, 1995: 36-41.）。其余3个抗源的黑胫病抗性是由微效多基因控制的数量性状，极易受环境影响且遗传机制较为复杂，因此很难在烟草育种中应用。

迄今，国内外尚无与烟草黑胫病抗性基因Ph两侧紧密连锁的分子标记的报道。利用近几年发展起来的分子标记辅助选择育种技术，通过构建重要抗源的遗传图谱和基因定位分析，可以找到与烟草黑胫病抗性基因Ph两侧紧密连锁（或共分离）的分子标记。使用与某一特定抗源抗性基因紧密连锁的分子标记，不仅可对该特定抗源的后代及其衍生品种（系）在苗期进行早世代筛选，淘汰感病植株，节约成本，提高育种和选择效率，而且还可以为进一步克隆相关的抗病基因并分析其功能奠定基础。因此，开发分子标记用于定位烟草黑胫病抗性基因Ph和辅助选择抗烟草黑胫病材料对抗病育种具有重要的意义。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记；第二目的在于提供一种所述分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用；第三目的在于提供所述分子标记在烟草分子辅助育种中的应用；第四目的在于提供所述分子标记在烟草黑胫病抗性基因Ph定位中的应用。

本发明第一目的这样实现的，用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记为TM29或TM50，在第20号基因连锁群上分别位于基因Ph两侧，与之紧密连锁，分子标记TM29与Ph基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与Ph基因的遗传距离为0.148cM。

本发明第二目的这样实现的，所述分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用。

本发明第三目的这样实现的，所述分子标记在烟草分子辅助育种中的应用。

本发明第四目的这样实现的，所述分子标记在烟草黑胫病抗性基因Ph定位中的应用。

本发明具备的有益效果：

（1）本发明的分子标记具有特异性强、稳定性高，

（2）标记的开发方法操作简便快捷，对检测设备和引物模板质量要求不高，实验试剂用量少，速度快，成本低，适合高通量、自动化的优点，非常适合现代农业分子育种的实践；

（3）本发明为烟草黑胫病抗性基因Ph的克隆提供了重要的分子遗传学信息；

（4）如本发明的烟草黑胫病抗性基因Ph分子标记和引物对应用于烟草育种工作中，将极大降低烟草黑胫病流行对烟草生产造成的经济损失，同时显著地减少农药使用量，有益于降低生产成本，具有很大的应用潜力和极高的经济价值；

（5）本发明筛选出与基因Ph两侧紧密连锁的分子标记，可以有效地用于基因Ph的标记辅助选择，可进一步通过染色体步移法接近基因Ph，从而为基因Ph的克隆奠定基础。

附图说明

图1为利用BC₁F₁单株作为定位群体构建的黑胫病抗性基因Ph连锁图（局部图）；

图中，左侧的数字代表每个分子标记的遗传距离（单位：cM），右侧为各个分子标记的名称。

图2为分子标记TM29对BC₁F₁作图群体材料进行基因型分析（局部图）；

图中，1-36分别为BC₁F₁作图群体中的前36个单株，即RH001, RH002, …, RH035,RH036，M-100bp DNA Ladder。

图3为分子标记TM50对BC₁F₁作图群体材料进行基因型分析（局部图）；

图中，1-36分别为BC₁F₁作图群体中的前36个单株，即RH001, RH002, …, RH035、RH036，M-100bp DNA Ladder。

图4为分子标记TM29在含有Ph基因的抗病材料和不含Ph基因的感病材料中的分布谱带图；

图中，1-N.plumbaginifolia（野生烟，含Ph基因），2-Coker371-Gold（烤烟，含Ph基因），3-RBST（抗病亲本，含Ph基因），4-F₁（RBST×红花大金元，含Ph基因），5-红花大金元（感病亲本，不含Ph基因），6-云烟85（烤烟，不含Ph基因），7-云烟87（烤烟，不含Ph基因），8-K326（烤烟，不含Ph基因），9-Hicks（烤烟，不含Ph基因），10-单育二号（烤烟，不含Ph基因），11-中烟100（烤烟，不含Ph基因），12-Florida301（雪茄，不含Ph基因），13- Beinhart-1000（晾晒烟，不含Ph基因），14-Samsun（香料烟，不含Ph基因），M-100bp DNA Ladder。

图5为分子标记TM50在含有基因Ph的材料和不含基因Ph的材料中的分布谱带图；

图中，1-N.plumbaginifolia（野生烟，含Ph基因），2-Coker371-Gold（烤烟，含Ph基因），3-RBST（抗病亲本，含Ph基因），4-F₁（RBST×红花大金元，含Ph基因），5-红花大金元（感病亲本，不含Ph基因），6-云烟85（烤烟，不含Ph基因），7-云烟87（烤烟，不含Ph基因），8-K326（烤烟，不含Ph基因），9-Hicks（烤烟，不含Ph基因），10-单育二号（烤烟，不含Ph基因），11-中烟100（烤烟，不含Ph基因），12-Florida301（雪茄，不含Ph基因），13- Beinhart-1000（晾晒烟，不含Ph基因），14- Samsun（香料烟，不含Ph基因），M-100bp DNA Ladder。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

如图1所示，本发明所述的烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记为TM29或TM50，在第20号连锁群上分别位于基因Ph两侧，与之紧密连锁，分子标记TM29与Ph基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与Ph基因的遗传距离为0.148cM。

本发明所述的烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记的开发方法，具体过程如下：

（1）SSR位点信息分析

利用SSRIT软件（http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool）在红花大金元基因组数据（基因组数据以FASTA文件格式下载自中国烟草基因组数据库（ChinaTobacco Genome Database, CTGDB）内进行SSR位点信息的搜索，该软件仅用于查找二、三、四、五、六碱基5种类型的SSR。对于单碱基类型的SSR信息则利用TRF软件（Tandem RepeatsFinder，http://tandem.bu.edu/trf/trf.html ）进行搜寻。SSR搜索的参数设置为：单碱基重复≥20bp（基序 M=1；重复次数 N≥20）；二碱基重复≥12bp（M=2；N≥6）；三碱基重复≥15bp（M=3；N≥5）；四碱基重复≥16bp（M=4；N≥4）；五碱基重复≥15bp（M=5；N≥3）；六碱基重复≥18bp（M=6；N≥3）。

（2）SSR标记的开发与PCR扩增分析

利用Perl语言编写程序，在符合条件的SSR位点两侧各截取长度为200bp的核苷酸序列，用Primer3 （http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3）设计SSR引物。在设计引物时，主要考虑以下几个关键因素：1）引物长度，18~25bp（理想值为20bp）；2）PCR预期扩增的产物长度，150~400bp（理想值为200bp）；3）退火温度（T _m），55~62℃（理想值为58℃）；4）GC含量（GC%），40~60%（理想值为50%）；5）尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配。PCR扩增体系为20μL，其中15~30ng/μL DNA样品1.5uL、10×PCR Reaction Buffer（Mg²⁺plus）2μL、25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq 0.75U，最后用ddH₂O补足20μL。PCR扩增程序为95℃预变性5 min；然后进行30个循环，每个循环包括95℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5 min。PCR产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离， 220V恒压下电泳1.5h，按照Sanguinetti等（SANGUINETTI C J, DIAS N E, SIMPSONA J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated onpolyacrylamide gels.Biotechniques, 1994, 17: 915-919）的快速银染法进行染色，并拍照保存。

（3）多态性SSR标记筛选与遗传图谱构建

以亲本RBST、红花大金元及其杂交F₁为材料，对新开发的约20000对SSR引物进行筛选，获得607对在两亲本间有差异且在F₁中呈共显性的清晰、稳定、可靠的多态性SSR引物用于213个BC₁F₁作图单株基因型分析。利用作图软件JoinMap® v4.0对有多态的烟草SSR引物在213个BC₁F₁作图单株中所获得的基因型数据进行连锁分析并构建烟草全基因组遗传连锁图谱。

（4）烟草黑胫病抗性基因Ph的精细定位

基于已构建的遗传连锁图并结合9000个BC₁F₁定位单株材料的基因型数据和黑胫病抗性鉴定数据，利用JoinMap® v4.0软件将Ph基因定位在第20号连锁群上。软件JoinMap® v4.0的参数设置为：Kosambi′s mapping function； Goodness-of-fit Jumpthreshold for removal loci = 5.0；Number of added loci after which to performa ripple = 1； Recombination frequency ≤0.35；LOD score ≥ 2.0和 Third round =Yes。利用JoinMap® v4.0软件中的Regression Mapping算法，对第20号连锁群上标记的顺序和标记间的遗传距离进行了计算并绘制连锁图，最终，将目的基因Ph定位在SSR标记TM29和TM50之间0.239cM的区间内，其中标记TM29和TM50与Ph基因的遗传距离分别为0.091cM和0.148cM。

扩增本发明所述的烟草黑胫病抗性基因Ph的分子标记TM29的引物对序列为：

TM29F：5′-AGACGGGGCTAAATTTGACA -3′；

TM29R：5′-AGCGGAAGAGTTGAGGACAA -3′。

如图2所示，利用该引物对扩增得到的片段大小为469bp或479bp；所述的469bp片段为含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.1；所述的479bp片段为不含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.2。

扩增本发明所述的烟草黑胫病抗性基因Ph的分子标记TM50的引物对序列为：

TM50F：5′-TCCTCTGAAGGCAGATGGAG -3′；

TM50R：5′-TGCCTTTACGAGATGCTGTG -3′。

如图3所示，利用该引物对扩增得到的片段大小为459bp或433bp；所述的459bp片段为含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.3；所述的433bp片段为不含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.4。

本发明所述分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用，包括如下具体步骤：

（1）CTAB法提取植株DNA；

（2）建立PCR反应体系，PCR反应体系总体积为20μL，包括所述分子标记TM29或TM50的正反向引物各0.8µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10× PCR Buffer（Mg²⁺ plus），0.75~1.0 U Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.），DNA模板30~50ng；

（3）运行PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min；

（4）用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物，硝酸银银染显色；

（5）电泳分离的片段与分子量标记或标准样品作比较，判断是否含有Ph基因。

本发明所述的分子标记在烟草分子辅助育种中的应用，利用所述的分子标记TM29或/和TM50对待检测样品的全基因组DNA进行PCR扩增，依据扩增出的片段大小筛选出含有黑胫病抗性基因Ph的材料，用于培育具有抗性的品种。

本发明所述的分子标记在烟草黑胫病抗性基因Ph定位中的应用，通过染色体步移法接近基因Ph，一方面利用当前距烟草黑胫病抗性基因Ph最近的分子标记TM29和TM50并结合红花大金元基因组数据序列，在介于最近两个标记之间重新开发新的标记；另一方面重新扩大定位群体并利用新开发的标记进行基因型分析，如此反复，逐步缩小连锁标记与目的基因Ph间的遗传距离，从而为基因Ph的克隆奠定基础。

实施例1：验证分子标记TM29检测Ph基因的准确性

选择属于5种不同烟草类型的14份材料：N.plumbaginifolia（野生烟，含Ph基因）；Coker371-Gold（烤烟，含Ph基因）； RBST（烤烟，含Ph基因）； F₁（RBST× 红花大金元，含Ph基因）；红花大金元（烤烟，不含Ph基因）；云烟85（烤烟，不含Ph基因）；云烟87（烤烟，不含Ph基因）； K326（烤烟，不含Ph基因）；Hicks（烤烟，不含Ph基因）；单育二号（烤烟，不含Ph基因）；中烟100（烤烟，不含Ph基因）；Florida301（雪茄，不含Ph基因）；Beinhart-1000（晾晒烟，不含Ph基因）；Samsun（香料烟，不含Ph基因）。

提取14份材料的DNA，建立PCR反应体系，PCR反应体系总体积为20μL，包括分子标记TM29的正反向引物TM29F和TM29R各0.8µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10× PCR Buffer（Mg²⁺ plus），0.75~1.0 U Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.），DNA模板30~50ng。运行PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min；用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物，硝酸银银染显色；电泳分离的片段与分子量标记作比较，判断是否含有Ph基因。

试验结果如图4所示，电泳条带的结果与材料的实际情况完全吻合。其中，基因型检测为阳性的材料，均含有来源于N.plumbaginifolia的基因Ph，且田间抗病鉴定为高抗，并确定是由0号小种引起的烟草黑胫病。4- F₁（RBST× 红花大金元，含Ph基因）是杂合体，故具有2条片段。而12-Florida301和13 -Beinhart-1000虽然田间的抗病鉴定为抗，但二者的黑胫病抗性是受微效多基因控制的而非由Ph基因单独控制，因此，分子标记TM29不能在其二者中检测到阳性谱带。试验证明了本发明所述的分子标记TM29对由Ph基因控制的烟草黑胫病抗性能够进行有效可靠的检测。

实施例2：验证分子标记TM50检测Ph基因的准确性

提取14份材料的DNA，建立PCR反应体系，PCR反应体系总体积为20μL，包括分子标记TM50的正反向引物TM50F和TM50R各0.8µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10× PCR Buffer（Mg²⁺ plus），0.75~1.0 U Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.），DNA模板30~50ng。运行PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min；用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物，硝酸银银染显色；电泳分离的片段与分子量标记作比较，判断是否含有Ph基因。

试验结果如图5所示，电泳条带的结果与材料的实际情况完全吻合。其中，基因型检测为阳性的材料，均含有来源于N.plumbaginifolia的基因Ph，且田间抗病鉴定为高抗，并确定是由0号小种引起的烟草黑胫病。4- F₁（RBST× 红花大金元，含Ph基因）是杂合体，故具有2条片段。而12-Florida301和13 -Beinhart-1000虽然田间的抗病鉴定为抗，但二者的黑胫病抗性是受微效多基因控制的而非由Ph基因单独控制，因此，分子标记TM50不能在其二者中检测到阳性谱带。试验证明了本发明所述的分子标记TM50对由Ph基因控制的烟草黑胫病抗性能够进行有效可靠的检测。

实施例1和2表明，分子标记TM29和TM50的检测结果完全一致。因此，在实际生产过程中，可使用这两种分子标记进行双重检测，以保证检测结果更加准确。再利用分子标记筛选出的含有黑胫病抗性基因Ph的材料，培育具有抗性的品种。

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用

<130> 2014

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 469

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana spp.）

<400> 1

agacggggct aaatttgaca aattatgaca accaccaaat aataaataaa taaaaggaat 60

ttacgaggtt ctaatattgc ctactcctcg gacacaacca atattttatt ccactccaaa 120

aatacaagtg taatactgag agaagataca aatgctgaag ataagaagca agtatgagag 180

gtatgtttaa atcgtctaaa catatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240

tatatatata tatatatata tatatattag gccttctttt ataggagaaa atccccccaa 300

ctctacttcc cgggacaatt tgacatcttc aacatgctta accaccattt gtctgtgttg 360

cggaagccaa atgtatatag tgtaagtatg aatcacagta ctactatacc aaaaattatg 420

gcgtagctac taaataatag taatacgact tgtcctcaac tcttccgct 469

<210> 2

<211> 479

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana spp.）

<400> 2

agacggggct aaatttgaca aattatgaca accaccaaat aataaataaa taaaaggaat 60

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aaaaattatg gcgtagctac taaataatag taatacgact tgtcctcaac tcttccgct 479

<210> 3

<211> 459

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana spp.）

<400> 3

tcctctgaag gcagatggag taatcattgg aaatgtgttg tatgattctc ctttgataag 60

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tcaattccat tgtgaataga aaatggtcaa taaaccatcc tgctgtccta aaggttgtaa 420

gcctgctatc cattgaatac acagcatctc gtaaaggca 459

<210> 4

<211> 433

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana spp.）

<400> 4

tcctctgaag gcagatggag taatcattgg aaatgtgttg tatgattctc ctttgataag 60

ttttaaagcc cttagccaat tttttccatt tgatataatg atatgctttc cattttgctt 120

cctttgtaaa agaggagctg ctctagaatt gttttcatgt cataaggtct aaaggctctc 180

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctattggag 240

tgagcaaatt gtcccgtttt cagtttttct tactacttgc tccttgggca agtgttaaga 300

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tcaataaacc atcctgctgt cctaaaggtt gtaagcctgc tatccattga atacacagca 420

tctcgtaaag gca 433

Claims

1.一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记，其特征在于所述的分子标记为TM29和TM50，在第20号基因连锁群上分别位于基因Ph两侧，与之紧密连锁，分子标记TM29与Ph基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与Ph基因的遗传距离为0.148cM；

分子标记TM29的引物对序列为：

TM29F：5′-AGACGGGGCTAAATTTGACA -3′；

TM29R：5′-AGCGGAAGAGTTGAGGACAA -3′；

分子标记TM50的引物对序列为：

TM50F：5′-TCCTCTGAAGGCAGATGGAG -3′；

TM50R：5′-TGCCTTTACGAGATGCTGTG -3′；

利用分子标记TM29引物对扩增得到的片段大小为469bp或479bp，469bp片段为含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.1，479bp片段为不含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.2；

利用分子标记TM50引物对扩增得到的片段大小为459bp或433bp，459bp片段为含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.3，433bp片段为不含Ph基因的植株所特有，其序列为SEQ ID No.4。

2.一种权利要求1所述的分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用。

3.根据权利要求2所述的分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用，其特征在于包括如下具体步骤：

（1）提取植株DNA；

（2）建立PCR反应体系，PCR反应体系总体积为20μL，包括分子标记TM29或TM50的正反向引物各0.8µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10×PCR Buffer Mg²⁺ plus，0.75~1.0U Taq聚合酶，DNA模板30~50ng；

（5）电泳分离的片段与分子标记TM29或TM50的特征片段或标准样品作比较，判断是否含有Ph基因。

4.根据权利要求3所述的分子标记在检测烟草黑胫病抗性基因Ph中的应用，其特征在于分子标记TM29、TM50的引物对序列如下：

TM29的引物对序列为：

TM29F：5′-AGACGGGGCTAAATTTGACA -3′；

TM29R：5′-AGCGGAAGAGTTGAGGACAA -3′；

TM50的引物对序列为：

TM50F：5′-TCCTCTGAAGGCAGATGGAG -3′；

TM50R：5′-TGCCTTTACGAGATGCTGTG -3′。

5.一种权利要求1所述的分子标记在烟草分子辅助育种中的应用。

6.一种权利要求1所述的分子标记在烟草黑胫病抗性基因Ph定位中的应用。