CN108754009B - 利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用分子标记快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，利用分子标记烟草于Nicotiana tabacum–N.plumbaginifolia远缘杂交的后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株。经黑胫病抗性鉴定和基因组原位杂交确认，本发明方法能在Nicotiana tabacum– N.plumbaginifolia倍半二倍体植株的回交后代中筛选获得带有外源染色体的抗黑胫病植株，准确率可达100%。这显示，利用本发明分子标记可以筛选获得带有N.plumbaginifolia染色体的抗黑胫病植株，即可替代原位杂交方法进行筛选。

Description

利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体植株的方法
技术领域
本发明涉及烟草育种，具体涉及一种利用分子标记快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法。
背景技术
烟草黑胫病是由烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotianae)引起的一种土传真菌病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一，其发生蔓延很快，往往在1～2周之内可以使整个烟田毁灭，破坏性极强，大田侵染后常造成烟株整株死亡，造成了巨大的经济损失(王万能，肖崇刚.烟草黑胫病的综合防治及其研究进展.广西农业科学,2003(2):42-43.)。防治烟草黑胫病最安全、经济有效的措施之一是培育抗病品种。蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)是烟草属中对黑胫病抗性较强的未被广泛栽培的野生烟草种，其对烟草黑胫病病原菌0号和1号小种均具有较强的抗性，是烟草黑胫病抗性育种的重要亲本。虽然，已有将蓝茉莉叶烟草的黑胫病抗性转入烟草的报道，但该类材料在生产中应用并不广泛，这与非目标基因的渐渗有关。所以利用茉莉叶烟草培育含较少非目标基因的抗黑胫病新株系是烟草抗黑胫病育种的有效方法之一。但目前，烟草远缘杂交的研究并未得到较多关注。所以，利用蓝茉莉叶烟草培育含较少非目标基因的抗黑胫病新株系的工作非常滞后。远缘杂交育种过程中筛选含目标性状的异源染色体植株是主要的内容。因而利用蓝茉莉叶烟草培育优质抗黑胫病植株的主要内容就在获得远缘杂种的基础上筛选抗黑胫病的异源染色体植株。而如何快速筛选获得抗黑胫病的异源染色体株系是其中对育种进程影响较大的关键环节。在常规的远缘杂交育种中，对异源染色体株系的筛选主要通过性状和基因组原位杂交进行，而基因组原位杂交方法过程较为繁琐，费时也较长，对大量材料进行筛选具有一定的难度。
受益于生物全基因组高通量测序技术的发展与大量烟草基因组数据的公布(Sierro N,van Oeveren J,van Eijk M J,Martin F,Stormo K E,Peitsch M C,Ivanov NV.Whole genome profiling physical map and ancestral annotation of tobaccoHicks Broadleaf.Plant J,2013,75(5):880-889；Sierro N,Battey J N,Ouadi S,Bakaher N,Bovet L,Willig A,Goepfert S,Peitsch M C,Ivanov N V.The tobaccogenome sequence and its comparison with those of tomato and potato.NatCommun,2014,5:3833.doi:10.1038/ncomms4833.)，以及大规模烟草SSR标记的开发和高质量烟草遗传连锁图谱的构建(Bindler G,Plieske J,Bakaher N,Gunduz I,Ivanov N,Vander Hoeven R,Ganal M,Donini P.A high density genetic map of tobacco(Nicotianatabacum L.)obtained from large scale microsatellite marker development.TheorAppl Genet,2011,123(2):219-230；Tong Z J,Xiao B G,Jiao F C,Fang D H,Zeng J M,Wu X F,Chen X J,Yang J K,Li Y P.Large-scale development of SSR markers intobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco.BreedingScience,2016,66:381-390.)，使国内外研究者在分子水平上对烟草黑胫病的研究有了很大进展。目前对烟草黑胫病抗性相关的分子研究有一定的进展，但对蓝茉莉叶烟草黑胫病抗性的研究则较为少见。仅见于部分衍生株系中抗性连锁标记的开发和应用，而这类衍生材料多为普通烟草，其基因组与蓝茉莉叶烟草存在差异，且由于蓝茉莉叶烟草的黑胫病抗性经渐渗进入普通烟草后，其与相关分子标记的连锁关系已经发生变化，故该类分子标记不能应用于远缘杂交后代的筛选。鉴于此，寻找一种快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体的质量性状基因(核酸片段)并开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷提供一种与蓝茉莉烟草抗病基因所在染色体紧密连接的SSR分子标记。本发明另一目的在于提供一种利用分子标记快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体植株的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案。
本发明所述的与蓝茉莉烟草抗病基因所在染色体紧密连接的SSR分子标记的编号为PT54199，其上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
具体为：SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：2
GCACTTCGTAGATGCGTTGA TCTCATGAGCAGGCTTCAAA
一种利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，选取普通烟草(N.tabacum)和蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)倍半二倍体后代或普通烟草-蓝茉莉叶烟草抗黑胫病异源单体附加系的后代(自交或回交)为材料，提取基因组DNA，以上述SSR引物PT54199对材料进行扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在约150bp处若出现2个条带，则该植株为阳性植株，即抗黑胫病异源单体植株；若出现1个条带，则为阴性植株，不是抗黑胫病异源单体植株。
上述利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，其特征在于：采用CTAB法提取植株DNA，经核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测无杂质、无降解后进行PCR扩增；以提取的基因组DNA为模板、引物PT54199进行PCR扩增，扩增产物采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，恒压220V进行电泳分离检测，0.1％的硝酸银染色，若在约150bp出若2个条带的植株为阳性植株(即抗黑胫病异源单体植株)；出现1个条带，为阴性植株(不是抗黑胫病异源单体植株)。
上述利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，其特征在于：采用15μL的PCR扩增体系，其中包含有2μL的10×buffer(Takara公司)，MgCl2 1.2μL(25mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(10mmol/L，Takara公司)，rTaq 0.2μL(5U/μL，Takara公司)，1.5μL的DNA模板，正反向引物(10μmol/L)各1.5μl，剩余用水补齐。
上述利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，其特征在于，扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，最后72℃延伸6min。
有益效果：
不意图为任何理论所束缚，尽管国内外研究者在分子水平上对烟草黑胫病有一定的研究，且对烟草黑胫病抗性相关的分子研究有一定的进展，但是这些研究多为普通烟草，其基因组与蓝茉莉叶烟草存在差异，且由于蓝茉莉叶烟草的黑胫病抗性经渐渗进入普通烟草后，其与相关分子标记的连锁关系已经发生变化，故该类分子标记不能应用于远缘杂交后代的筛选。本发明人进行了大量实验，并且出人意料地发现，利用分子标记烟草于Nicotiana tabacum–N.plumbaginifolia远缘杂交的后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株，当蓝茉莉烟草抗病基因所在染色体紧密连接的SSR分子标记的编号为PT54199(其上游扩增引物的核苷酸序列为GCACTTCGTAGATGCGTTGA，下游扩增引物的核苷酸序列为TCTCATGAGCAGGCTTCAAA)时，可以在较短时间内实现大量植株的筛选(每天可实现100-150个样品的筛选)，经黑胫病抗性鉴定和基因组原位杂交确认，本发明方法能在Nicotianatabacum–N.plumbaginifolia倍半二倍体植株的回交后代中筛选获得带有外源染色体的抗黑胫病植株，准确率可达100％。相比原位杂交方法筛选烟草新品种，本发明的利用分子标记快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，可以在较短时间内实现大量植株的筛选(每天可实现100-150个样品的筛选)，且准确度高，可替代原位杂交方法进行筛选。
附图说明
图1是SSR标记PT54199扩增异源单体植株TP-1自交后代不抗病植株和抗病植株基因组DNA产物的电泳图谱。
图2是分子标记检测后呈阳性的植株(异源单体植株自交后代)苗期抗病性的离体鉴定，其中A为叶片，B为茎段；其中a为野生烟草，b为阳性植株，c为阴性植株。
图3是经分子标记筛选后呈阳性的植株(与附图2中为同一植株)经基因组原位杂交鉴定，图中箭头所指为异源染色体植株。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
通过对现有烟草(N.tabacum)的340对SSR引物进行筛选，筛选的过程如下：采用CTAB法提取植株(N.plumbaginifolia、抗黑胫病异源单体附加系TP-1和云烟87)的基因组DNA，经核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测无杂质、无降解后进行PCR扩增；以提取的基因组DNA为模板，利用PT30061、PT30167、PT54199等334对引物进行PCR扩增。扩增体系：采用15μL的PCR扩增体系，其中包含有2μL的10×buffer(Takara公司)，MgCl2 1.2μL(25mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(10mmol/L，Takara公司)，rTaq 0.2μL(5U/μL，Takara公司)，1.5μL的DNA模板，正反向引物(10μmol/L)各1.5μl，剩余用水补齐。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，最后72℃延伸6min。电泳：采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，恒压220V进行电泳，0.1％的硝酸银染色。电泳后，观察能在野生烟草N.plumbaginifolia和异源单体附加系TP-1基因组DNA中扩增出相同条带，而在云烟87基因组DNA中扩增不出该条带的引物。结果显示，PT54199效果良好，适宜用于筛选云烟87基因组背景下的抗黑胫病异源染色体株系。
实施例2
1、提取基因组DNA：采用CTAB法提取植株(抗黑胫病烟草-蓝茉莉叶烟草异源单体附加系自交后代)DNA，经核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测无杂质、无降解后进行PCR扩增；
2、PCR扩增和电泳：以提取的基因组DNA为模板、引物PT54199(PF：GCACTTCGTAGATGCGTTGA，PR：TCTCATGAGCAGGCTTCAAA)进行PCR扩增，扩增体系：采用15μL的PCR扩增体系，其中包含有2μL的10×buffer(Takara公司)，MgCl2 1.2μL(25mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(10mmol/L，Takara公司)，rTaq 0.2μL(5U/μL，Takara公司)，1.5μL的DNA模板，正反向引物(10μmol/L)各1.5μl，剩余用水补齐。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，最后72℃延伸6min。电泳：采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，恒压220V进行电泳，0.1％的硝酸银染色。
3、统计：电泳后，在约150bp出若2个条带的植株为阳性植株，即抗黑胫病异源单体植株；出现1个条带，为阴性植株，不是抗黑胫病异源单体植株。电泳结果见图1，其中前三个泳道自左至右分别为云烟87、异源单体附加系TP-1和野生烟草N.plumbaginifolia基因组DNA扩增产物的电泳结果。自图1中可以看出，引物PT54199能在抗黑胫病异源单体附加系TP-1和野生烟草N.plumbaginifolia的基因组DNA中扩增出2个条带(大小约150bp)，而在云烟87的基因组DNA中只扩增出1个条带。这说明，该2个序列中长度较短的一个被定位于携带有抗黑胫病基因的外源染色体上，引物PT54199可以在云烟87基因组背景下特异识别出携带有抗黑胫病基因的异源染色体。图1中，编号1-3为SSR标记PT54199扩增异源单体植株TP-1自交后代中3株不抗病植株，编号4-14为11株抗病植株基因组DNA扩增产物电泳图谱，其中不抗病植株在150bp左右仅出现1个条带，而抗病植株在150bp左右出现2个条带。
4、结果：筛选植株总数为172株，阳性植株为135株，比例为78.49％。经黑胫病抗性检测，该135株植株均表现出较强的黑胫病抗性。图2是分子标记检测后呈阳性的植株(异源单体植株自交后代)苗期抗病性离体鉴定，其中A为叶片，B为茎段；其中a为野生烟草，b为阳性植株，c为阴性植株。图3是经分子标记筛选后呈阳性的植株(与附图2中为同一植株)经基因组原位杂交鉴定，箭头所指为异源染色体植株。
实施例3
1、提取基因组DNA：采用CTAB法提取植株(抗黑胫病烟草-蓝茉莉叶烟草异源五倍体回交云烟87的后代)DNA，经核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测无杂质、无降解后进行PCR扩增；
2、PCR扩增和电泳：以提取的基因组DNA为模板、引物PT54199(PF：GCACTTCGTAGATGCGTTGA，PR：TCTCATGAGCAGGCTTCAAA)进行PCR扩增，扩增体系：采用15μL的PCR扩增体系，其中包含有2μL的10×buffer(Takara公司)，MgCl2 1.2μL(25mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(10mmol/L，Takara公司)，rTaq 0.2μL(5U/μL，Takara公司)，1.5μL的DNA模板，正反向引物(10μmol/L)各1.5μl，剩余用水补齐。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，最后72℃延伸6min。电泳：采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，恒压220V进行电泳，0.1％的硝酸银染色。
3、统计：电泳后，在约150bp出若2个条带的植株为阳性植株，即抗黑胫病异源单体植株；出现1个条带，为阴性植株，不是抗黑胫病异源单体植株。
4、结果：筛选植株总数为73株，阳性植株为5株，比例为6.85％。经黑胫病抗性检测，该5株植株均表现出较强的黑胫病抗性。
基因组原位杂交方法，四天才能完成一批材料(一批一般为5个)的筛选鉴定，且基因组原位杂交方法包括染色体制片等诸多较为繁琐的过程，成本也较高(由于基因组原位杂交相关试剂的价格高昂)。相对于基因组原位杂交方法，本发明利用分子标记快速筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，可以在较短时间内实现大量植株的筛选(每天可实现100-150个样品的筛选)，经黑胫病抗性鉴定和基因组原位杂交确认，本发明方法能在Nicotianatabacum–N.plumbaginifolia倍半二倍体植株的回交后代中筛选获得带有外源染色体的抗黑胫病植株，准确率可达100％。可见，利用本发明分子标记可以筛选获得带有N.plumbaginifolia染色体的抗黑胫病植株，即可替代原位杂交方法进行筛选。
序列表
<110>西南大学 中国烟草总公司重庆市公司烟草科学研究所
<120>利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体植株的方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>PT54199上游扩增引物
<400>1
gcacttcgta gatgcgttga 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>PT54199下游扩增引物
<400>2
tctcatgagc aggcttcaaa 20

Claims (5)

1.一种利用分子标记筛选烟草抗黑胫病异源染色体的方法，选取普通烟草（N. tabacum）和蓝茉莉叶烟草（N. plumbaginifolia）倍半二倍体后代或普通烟草-蓝茉莉叶烟草抗黑胫病异源单体附加系的后代为材料，提取基因组DNA，以SSR引物PT54199对材料进行扩增，其上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在150bp处若出现2个条带，则该植株为阳性植株；若出现1个条带，则为阴性植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述普通烟草（N. tabacum）和蓝茉莉叶烟草（N. plumbaginifolia）倍半二倍体后代或普通烟草-蓝茉莉叶烟草抗黑胫病异源单体附加系的后代为自交或回交。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用CTAB法提取植株DNA，经核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测无杂质、无降解后进行PCR扩增；以提取的基因组DNA为模板、引物PT54199进行PCR扩增，扩增产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，恒压220 V进行电泳分离检测，0.1%的硝酸银染色，若在150 bp处若2个条带的植株为阳性植株；出现1个条带，为阴性植株。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：采用15 µL的PCR扩增体系，其中包含有2 µL的10× buffer，25 mmol/L的MgCl2 1.2 µL，10 mmol/L的dNTP 0.4 µL，5 U/µL的rTaq 0.2µL，1.5 µL的DNA模板，10 µmol/L的正反向引物各1.5 µl，剩余用水补齐。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30次，最后72℃延伸6 min。
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