CN109517919B - 小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标记的开发 - Google Patents

小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标记的开发 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种广谱抗锈的小麦‑中间偃麦草Ee染色体组T4DL.4DS‑3Ai小片段易位系CH4131及追踪该易位片段的SCAR标记。通过对小麦与中间偃麦草杂交后代进行条锈病和GISH鉴定，获得高抗条锈病的小麦‑中间偃麦草小片段易位系CH4131，并开发特异性追踪SCAR标记1个。该易位系对条锈病具有广谱抗性，农艺性状优良、具有优异亚基14+15，品质性状好，在小麦育种上具有广泛的利用价值。

Description

小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标 记的开发
技术领域
本发明涉及小麦育种技术，尤其涉及小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标记的开发。
背景技术
小麦(Triticumaestivum L.)是中国重要的粮食作物，由小麦条锈菌(Pucciniastriiformis f.sp.tritici,Pst)引起的小麦条锈病是危害我国小麦生产的重要病害，是当前小麦安全生产的重大威胁之一。在流行年份可使小麦减产5％-25％，特大流行年份减产40％以上甚至绝收(见参考文献：康振生,王晓杰,赵杰,汤春蕾,黄丽丽.小麦条锈菌致病性及其变异研究进展.中国农业科学,2015,48(17):3439-3453)。选育和种植抗病品种是防治条锈病最经济、有效、环保的方法。因此，筛选和创制新的、广谱抗性的抗病材料，并将其有效利用是我国小麦抗条锈育种工作的重要任务。
小麦野生近缘属植物中具有丰富的抗锈病基因，利用远缘杂交和染色体异源重组从小麦的近缘种属导入新的抗病基因是实现抗源多样化及培育多抗性抗源的重要途径。中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n＝6x＝42,StEbEe)是利用最为成功的多年生野生近缘植物，蕴含许多能够增强抗性、改善品质的有益基因，是小麦遗传改良的重要基因资源库。人们已经创造了多个小麦-中间偃麦草易位的抗病材料，将中间偃麦草抗病基因转入小麦，如CH223(Yr50)、YU24/YU25(YrYU25)、L693(YrL693)(见参考文献:Liu J,Chang ZJ,Zhang XJ,et al.Putative Thinopyrum intermedium-derived stripe rust resistancegene Yr50 maps on wheat chromosome arm 4BL.Theor Appl Genet,2013,126(1):265-274；Luo PG,Hu XY,Chang ZJ,et al.A new stripe rust resistance gene transferredfrom Thinopyrum intermedium to hexaploid wheat(Triticum aestivum).Phytoprotection,2009,90(2):57-63；Huang Q,Li X,Chen W Q,et al.Genetic mappingof a putative Thinopyrum intermedium-derived stripe rust resistance gene onwheat chromosome 1B.Theor Appl Genet,2014,127(4):843-853)。此外，郝薇薇等报道了来自十倍体长穗偃麦草St基因组的新抗条锈基因的小麦-长穗偃麦草4DS/4St易位系(见参考文献:郝薇薇,汤才国,李葆春,郝晨阳,张学勇.小麦-十倍体长穗偃麦草广谱抗锈易位系的鉴定及分析.中国农业科学,2012,45(16):3240-3248)，目前尚未有含有抗条锈的中间偃麦草的片段易位到小麦4D染色体上的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段，其为如下1)–4)中任一种所示的核酸分子：
1)核苷酸序列包括序列表中序列1所示的核酸分子；
2)核苷酸序列由序列表中序列1所示的核苷酸组成；
3)将1)或2)所限定的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸位点的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核酸分子；
4)与1)或2)任一限定的DNA分子具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的核酸分子。
本发明另一个目的是提供检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质的用途。
本发明提供了检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质在鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性中的应用；
或，本发明提供了检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性产品中的应用。
或，本发明提供了检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质在选育高抗条锈病小麦中的应用；
或，本发明提供了检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质在制备选育高抗条锈病小麦产品中的应用。
上述应用中，所述检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质包括如下1)或2)：
1)检测上述的DNA片段的SCAR标记；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述SCAR标记由序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列3所示的单链DNA分子或其衍生物组成的引物。
上述中，所述单链DNA分子的衍生物为如下a)或b)：
a)在所述单链DNA分子核苷酸序列的5'端添加1-10个碱基得到的单链DNA分子；
b)与所述单链DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性的DNA分子。
本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段；若含有该片段，则所述待测小麦为或候选为高抗条锈病。
本发明第4个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：为检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段；含有该片段的待测小麦的条锈病抗性大于不含有该片段的待测小麦。
本发明第5个目的是提供一种选育高条锈病抗性的小麦的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：为检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段；选育含有该片段的待测小麦，得到高条锈病抗性的小麦。
上述检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段方法包括如下步骤：
用上述SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则待测小麦含有该易位片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则待测小麦不含有该易位片段。
本发明第6个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其为上述检测待测小麦4D染色体中是否含有上述的DNA片段的物质；
所述产品具有如下1)或2)所示功能：
1)鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
2)选育高抗条锈病小麦。
上述的DNA片段在鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性中的应用也是本发明保护的范围。
上述中，待测小麦为中间偃麦草的后代，包括自交或杂交后代。
上述条锈病是由如下病原菌引起的：条中29、31、32、33、34，以及水源4、7等条锈菌种。
本发明的有益效果：
1.本发明所提供的小麦-六倍体中间偃麦草Ee染色体组T4DL.4DS-3Ai小片段易位系CH4131对条锈病混合菌种表现高抗，实现了抗源的多样化；
2.本发明公开的1个SCAR标记可有效地追踪具有条锈病抗性基因的中间偃麦草染色体易位片段，用于分子标记辅助选择；
3.小麦-六倍体中间偃麦草CH4131易位系农艺性状优良、具有优质亚基14+15，品质性状好，在小麦育种上具有广泛的利用价值。
附图说明
图1为小麦-六倍体中间偃麦草杂交后代CH4131、CH4133和CH4134的条锈病抗性鉴定。
图2为小麦-六倍体中间偃麦草T4DL.4DS-3Ai易位系CH4131和中间亲本陕优225、PH82-2-2的细胞学鉴定。
图3为CH4131、CH4133和CH4134材料中中间偃麦草染色体易位片段的AFLP检测。
图4为本发明筛选出的易位片段SCAR标记D05-A4-1F/1R。
图5为中间偃麦草易位片段的染色体组来源检测。
图6为小麦-六倍体中间偃麦草杂交后代CH4131、CH4133和CH4134植株。
图7为不同品系/品种高分子量麦谷蛋白电泳。
图8为SCAR标记D05-A4-1F/1R在DH群体中的PCR扩增。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)是小麦抗病育种的优良抗源，为了利用中间偃麦草中的抗条锈病基因，创制了一个具有条锈病广谱抗性且综合农艺性状优良的小麦-中间偃麦草小片段易位系，并开发了特异片段的SCAR标记。
以下实施例所涉及试验材料的来源如下：
作为亲本的中间偃麦草Z1141、普通小麦品种中国春、台长29、PH82-2-2，以及用于回交的普通小麦品种陕优225都属于本领域技术人员通过常规途径即可获得的植物材料，如可以通过市售渠道购买得到，也可从各育种单位或种质库引进。中间偃麦草Z1141、中国春、台长29、二倍体百萨偃麦草PI531712、二倍体长穗偃麦草PI98526、拟鹅观草PI313960、CH4131、CH4133和CH4134均可自山西省农业科学院小麦研究所得到。
条中29、31、32、33、34，以及水源4、7等条锈菌种可从中国农业科学院作物科学研究所和中国科学院遗传与发育生物学研究所获得(记载在如下文献中：郝薇薇,汤才国,李葆春,郝晨阳,张学勇.小麦-十倍体长穗偃麦草广谱抗锈易位系的鉴定及分析.中国农业科学,2012,45(16):3240-3248；张怀志,谢菁忠,陈永兴,刘旭,王勇,闫素红,杨兆生,赵虹,王西成,贾联合,曹廷杰,刘志勇.利用BSR-Seq定位小麦品种郑麦103抗条锈病基因YrZM103.作物学报,2017,43(11):1643-1649)。
下述实施例中的条锈病抗性鉴定方法：
在温室中用条锈病病原菌对待测小麦进行条锈病抗性鉴定，反应型按0-9级记载(参考文献：Line RF,Qayoum A(1992)Virulence,aggressiveness,evolution anddistribution of races of Pucciniastriiformis(the cause of stripe rust ofwheat)in North America,1968-1987.Technical Bulletin(USA))。0级为免疫，1级为近似免疫，2级为高抗，3-4级为中抗，5-6级为中感，7-8级为感病，9级为高感。
实施例1、检测中间偃麦草Z1141杂交后代抗条锈病的片段的发现
一、小麦-中间偃麦草杂交后代的获得
选用对条锈病免疫的中间偃麦草Z1141作为父本与中国春杂交，中国春小麦去掉雄蕊后套袋防止自交，采用冬季温室培养中间偃麦草Z1141，使Z1141花期提前至5月初，收集花粉与套袋的中国春杂交50穗。杂种后代出现高度不育，50个杂交穗共收获124粒种子后于10月1日正常秋播。
第二年观察杂种后代，有1株F1后代在株高、叶型和籽粒性状接近正常六倍体小麦台长29，且抽穗期正常，命名为A，系谱为中国春/Z1141。抽穗期收集此单株A的花粉，给台长29小麦授粉，共收获杂交籽粒40粒。
杂交籽粒正常秋播，自交后于下一年度进行田间选择，在1000个F2单株中有1株在株高、叶型和籽粒性状接近正常六倍体小麦台长29，命名为B，系谱为中国春/Z1141//台长29。收集B的花粉与优质亲本PH82-2-2的去雄穗杂交，获得杂交籽粒F1共25粒。
将上一代的25粒F1正常秋播，并于下一年度收获F1的种子3000粒，得到F2代种子。将F2代正常秋播，于下一年度在田间接种混合条锈菌株的条件进行田间选择，用条中29、31、32、33，以及水源4、7的混合菌种接种鉴定筛选，铭贤169为诱发及对照材料。在诱发材料及对照材料充分发病时进行抗条锈病调查。发现一株农艺性状为正常六倍体小麦，且对条锈混合菌种高抗(2级)的植株C，系谱为中国春/Z1141//台长29///PH82-2-2。对C进行根尖分生区细胞观察，发现C的染色体为21对，进一步观察200个花粉母细胞的减数分裂过程，证明C的染色体为21对，且能够正常配对稳定遗传。使用中间偃麦草Z1141的基因组DNA为探针进行基因组原位杂交，发现在4D染色体上存在小片段易位。
收集C的花粉，与陕优225连续回交3次，每一世代种植过程中都用田间接种的方法选择抗条锈病植株，获得株系D，系谱为CS/Z1141//TC29///PH82-2-2////3*Shan225，株系D自交5代，获得农艺性状优良的抗病性植株1个和感病植株2个株系，编号为CH4131、CH4133和CH4134。
二、小麦-中间偃麦草杂交后代条锈病抗性鉴定和细胞学鉴定
1、条锈病抗性鉴定
在温室中用条中29、31、32、33和水源4、7等比例混合菌种对小麦-中间偃麦草杂交后代CH4131、CH4133和CH4134进行条锈病抗性鉴定，反应型按0-9级记载(参考文献：LineRF,Qayoum A(1992)Virulence,aggressiveness,evolution and distribution of racesof Pucciniastriiformis(the cause of stripe rust of wheat)in North America,1968-1987.Technical Bulletin(USA))。
鉴定结果如图1所示，A：CH4131；B:CH4133；C:CH4134；CH4131反应型为2级，属于成株期高抗条锈病；CH4133和CH4134反应型为9级，表现为高度感病。
2、细胞学鉴定
1)染色体制片
将小麦-中间偃麦草杂交后代CH4131种子置于垫有2层滤纸的玻璃培养皿内室温浸泡8小时至萌动，倒去水后4℃冰箱过夜，置于室温暗培养，待根长至1-2厘米时剪取根尖，冰水处理36小时。用卡诺氏固定液(95％乙醇：冰醋酸＝3:1)固定根尖12小时，根尖可贮存于-20℃70％乙醇中。将根尖置于37℃酶液(Pectolyase Y-23(1％)and celluloseOnozuka R-10(2％)in citric buffer(sodium citrate 5mmol/L,5mmol/L EDTA,pH5.5))中酶解25-50min。再用45％冰醋酸压片，相差显微镜下观察中期染色体。
2)原位杂交
以中间偃麦草基因组DNA作探针(绿色信号)，中国春小麦基因组DNA作封阻，对CH4131的根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析。具体方法为：
制好的片子于72℃70％甲酰胺(Formamide deionized)中变性2min，立即依次置于-20℃的70％、90％、100％乙醇中各5min，置于室温下待完全干燥。用Fluorescein-12-dUTP(Roche)或地高辛(digoxigenin-11-dUTP,Roche)或生物素(biotin-16-dUTP,Roche)通过切口平移法标记DNA(1×Nick buffer,2-4μg template DNA,0.2mM dNTPs,25μMdigoxigenin-11-dUTP,1.5×10-4U/μLDNase I,1U/μL DNA Polymerase I，15℃标记90min)。用中间偃麦草基因组DNA作为探针时，需以超声打断中国春小麦的基因组DNA(200-500bp)为封阻，而以pAS 1和pSC 119.2(见参考文献:郝薇薇,汤才国,李葆春,郝晨阳,张学勇.小麦-十倍体长穗偃麦草广谱抗锈易位系的鉴定及分析.中国农业科学,2012,45(16):3240-3248)制备探针区分小麦17对染色体时无需加封阻DNA，配制杂交液(50％甲酰胺(deionized formamide)、2×SSC、10％硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、0.5mg/mL鲑鱼精DNA(sheared salmon tester DNA)、100ng标记探针和3.5μg中国春小麦基因组破碎DNA，沸水煮10min后立即放入冰中)。每片加20μL杂交液，盖塑料盖片，37℃杂交过夜。2×SSC 42℃5min，30％甲酰胺42℃5min，0.1×SSC 42℃5min，0.1×SSC42℃5min，2×SSC 42℃5min，2×SSC室温5min，每片加70μL 5％BSA稀释100倍的Anti-dig-FITC(Roche)或Avidin-Rhodamine(Roche)，加塑料盖片，37℃孵育60min；在4×SSC配制的0.2％Tween 20 42℃漂洗2次，每次8min；每张片子加PI或DAPI 20μL复染，在荧光显微镜(Zeiss,Germany)下观察，并用CCD(charge coupled device)照相机(Zeiss AxioCam HRM,Germany)监测，使用配套Axiovision Rel.4.8软件采集并处理图片，最后用Adobe Photoshop CC进行后期处理。
结果如图2所示，A、B、C:易位系CH4131、陕优225、PH82-2-2的GISH图，用Fluorescein-12-dUTP标记的中间偃麦草基因组DNA，用中国春小麦DNA作封阻，白色箭头所示为4D染色体，Scale bar＝10um；D、E、F:易位系CH4131、陕优225、PH82-2-2的FISH图，绿色信号为用digoxigenin-11-dUTP标记的pAs1，红色信号为biotin-16-dUTP标记的pSc119.2，白色箭头所示为4D染色体，Scale bar＝10um；
如图2-A所示，CH4131有一对染色体的端部上发生了小片段易位。进一步利用pAs1和pSc119.2区分小麦染色体，得知该外源染色体易位片段位于小麦4D染色体短臂端部(图2-D)。
如图2-B/E、2-C/F所示，中间亲本陕优225和PH82-2-2没有检测到易位片段，证明CH4131的易位片段来源于中间偃麦草Z1141。
三、AFLP检测易位系CH4131的易位片段
为获得易位系材料中间偃麦草染色体易位片段的序列，对CH4131、CH4133和CH4134进行AFLP检测。
1)限制性酶切及连接
以CH4131、CH4133和CH4134的基因组DNA为模板，利用EcoR I和Mse I两种限制性内切酶进行完全酶切，酶切体系为：基因组DNA 5μL，Buffer 1μL，限制性内切酶EcoR I/MseI 0.2μL，Adapter 1μL，T4连接酶1μL，ddH2O补足至15μL；37℃，酶切30min，得到酶切产物。
注：限制性内切酶EcoR I和MseI为NEB产品。
接头序列为：
EcoR I-Forward CTC GTA GAC TGC GTA CC
EcoR I-Reverse AAT TGG TAC GCA GTC TAC
Mse I-Forward GAC GAT GAG TCC TGA G
Mse I-Reverse TAC TCA GGA CTC AT
2)预扩增反应
以上述1)得到的酶切连接产物为模板，采用预扩增引物EA00和MC00进行PCR扩增。
EA00--GAC TGC GTA CCA ATT CA
MC00--GAC GAT GAG TCC TGA GTA AC
PCR反应体系如下：模板DNA 1μL(25ng/μL)；上下游引物(10μM)各0.2μL；MgCl2(25mM)0.8μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTP(2.5mM)0.8μL；Taq酶(0.5U)0.1μL；ddH2O补足至10μL。
PCR扩增时采用的扩增程序具体为：94℃5min；94℃30s，58℃35s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
3)选择性扩增反应
将上述2)所得PCR产物为模板，采用引物EA和MC进行PCR扩增。
EA--GAC TGC GTA CCA ATT CA
MC--GAT GAG TCC TGA GTA AC
PCR反应体系如下：模板DNA 1μL(25ng/μL)；上下游引物(10μM)各0.2μL；MgCl2(25mM)0.8μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTP(2.5mM)0.8μL；Taq酶(0.5U)0.1μL；ddH2O补足至10μL。
PCR扩增时采用的扩增程序具体为：94℃5min；94℃30s，58℃35s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
选择性扩增产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，如图3所示，1:CH4131；2:CH4133；3:CH4134.A:EcoRI-ACT+Mse I-CAG-258；B:EcoRI-ACT+Mse I-CAG-201；与CH4133和CH4134相比，CH4131经AFLP电泳后得到2个差异片段。切下目的条带，转入装有50μL双蒸水的离心管中，沸水浴5min，12000r/min离心后取上清液5μL作为模板，再次以引物EA和MC，相同条件进行PCR扩增。扩增后电泳检测，切取目标条带回收纯化、连接pMD18-T easy克隆载体，测序，得到长度分别为258bp和201bp的序列。序列Blast发现，258bp的片段A与小麦3B染色体上的HG670306.1相似性高；201bp的片段B在小麦基因组中未发现相似序列，测序片段B的核苷酸序列为序列1，说明片段B为中间偃麦草染色体易位片段。
结合二的1中植株抗病性状和本部分片段B存在情况，发现片段B(序列1)特异存在于高抗条锈病植株的4D染色体中，因此，片段B(序列1)可用于检测中间偃麦草后代是否抗条锈病，具体如下：
检测待测小麦4D染色体中是否含有序列表中序列1所示的DNA片段，含有该片段的待测小麦对本专利提及条锈菌小种引起的条锈病抗性大于不含有该片段的待测小麦。
或，检测待测小麦4D染色体中是否含有序列表中序列1所示的DNA片段，若含有该片段，则待测小麦高抗条锈病。
小麦高抗条锈病指小麦成株期反应型小于等于2级，具体检测方法按照如下文献记载：Line RF,Qayoum A(1992)Virulence,aggressiveness,evolution anddistribution of races of Pucciniastriiformis(the cause of stripe rust ofwheat)in North America,1968-1987.Technical Bulletin(USA))。0级为免疫，1级为近似免疫，2级为高抗，3-4级为中抗，5-6级为中感，7-8级为感病，9级为高感。
四、检测中间偃麦草Z1141杂交后代抗条锈病的易位片段的特异性SCAR标记的获得
1、根据易位片段序列设计SCAR标记
根据上述所得片段B的序列，设计SCAR扩增特异引物，作为SCAR标记，SCAR标记命名为D05-A4-1，引物序列如下：
F:CCG ATG GAG GAC TTT GTA G；
R:GCT TAC TTG TTG GAC CTT G
以小麦基因组DNA为模板，用上述SCAR标记进行PCR扩增。
PCR扩增体系:模板DNA 1μL(25ng/μL)；上下游引物(10μM)各0.2μL；MgCl2(25mM)0.8μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTP(2.5mM)0.8μL；Taq酶(0.5U)0.1μL；ddH2O补足至10μL。
上述PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃35s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，泳道：M：DL2000Marker；1:六倍体中间偃麦草；2:中国春小麦；3:台长29；4:PH82-2-2；5:陕225；6:阳性对照EcoRI-ACT+Mse I-CAG-201；7:CH4131；8:CH4133；9:CH4134；10:H2O；可以看出，D05-A4-1标记在材料间具有特异性，即在易位系材料CH4131和中间偃麦草(Th.intermedium)中能够扩增出163bp的条带，在对照材料和水中未扩增出任何条带，说明标记D05-A4-1能够有效的进行易位片段的追踪。
检测待测小麦4D染色体中是否含有序列表中序列1所示的DNA片段的方法为：直接测序或者SCAR标记扩增。
SCAR标记由如下引物组成：
F:CCG ATG GAG GAC TTT GTA G；
R:GCT TAC TTG TTG GAC CTT G
SCAR标记扩增的方法如下：用SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则待测小麦含有该易位片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则待测小麦不含有该易位片段。
五、SCAR标记检测中间偃麦草易位片段的染色体组来源
分别以二倍体百萨偃麦草(Eb)、二倍体长穗偃麦草(Ee)、拟鹅观草(St)基因组DNA为模板，利用实施例1的四的SCAR标记进行PCR扩增，PCR体系和反应程序同于实施例1的四中SCAR标记扩增。
PCR扩增体系:模板DNA 1μL(25ng/μL)；上下游引物(10μM)各0.2μL；MgCl2(25mM)0.8μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTP(2.5mM)0.8μL；Taq酶(0.5U)0.1μL；ddH2O补足至10μL。
上述PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃35s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，泳道：M：DL2000Marker；1：二倍体百萨偃麦草；2：二倍体长穗偃麦草；3：拟鹅观草；4：六倍体中间偃麦草。可以看出，用SCAR标记在二倍体长穗偃麦草和中间偃麦草基因组中扩增出了163bp的条带，在二倍体百萨偃麦草和拟鹅观草中没有扩增出163bp的条带。
根据上述结果判断，中间偃麦草的易位片段来源于二倍体长穗偃麦草Ee染色体组。
六、小麦-中间偃麦草小片段易位系CH4131的效应分析
为了解该易位片段对主要农艺性状和品质性状的效应，揭示该易位系的利用价值，对小麦-中间偃麦草杂交后代CH4131(易位系)与CH4133、CH4134(非易位系)进行农艺性状和品质性状评价鉴定。
分别于2015年和2016年将3个株系以随机区组设计种植于山西省农业科学院东阳试验基地和小麦研究所韩村试验基地，设3次重复，每个重复2行，收获时拔取单株进行农艺性状调查，每重复调查5个单株(表1)。结果表明，3个株系为半冬性，品系间生育期差异较小，均为220天左右；植株健壮，叶片宽大，叶色偏深；千粒重均在40g左右，株高范围为65-80cm之间。CH4131易位系株高为79.8cm，穗粒数55.3，生物量41.79，均显著高于非易位系；千粒重41.8g，经济系数0.42，与非易位系持平(图6)。
表1易位系与非易位系主要农艺性状差异显著性比较
Figure BDA0001873960080000101
对3个株系蛋白含量、沉降值、湿面筋含量、稳定时间、形成时间、最大拉伸阻力和拉伸面积等品质性状进行检测，结果如表2所示，3个株系间品质性状差异不大，且各性状均优于品质对照品种良星99，说明该易位片段并未对品质性状产生不良影响。
表2该易位片段对品质性状的效应
品系 蛋白含量(％) 沉降值(ml) 湿面筋含量(％)
CH4131 14.36±1.42 29.51±1.34 32.88±2.76
CH4133 14.49±1.16 31.67±3.09 32.86±1.98
CH4134 14.71±1.25 32.05±2.78 33.44±3.02
良星99 13.32±0.84 26.81±1.26 30.61±1.82
品系 稳定时间(min) 形成时间(min) 最大拉伸阻力(E.U.) 拉伸面积(cm2)
CH4131 6.7±0.45 3.7±0.12 212±15.44 47±7.93
CH4133 7.7±0.56 3.6±0.24 214±18.87 47±6.15
CH4134 7.3±0.77 3.5±0.28 209±17.34 46±7.72
良星99 4.1±0.44 2.7±0.23 193±15.27 42±3.72
利用SDS-PAGE对CH4131、CH4133、CH4134和亲本材料PH82-2-2、台长29和陕优225的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)进行了分析(图7；1:中优9507；2:晋麦83号；3:CH4131；4:CH4133；5:CH4134；6:PH82-2-2；7:台长29；8:陕优225)，结果发现CH4131、CH4133和CH4134的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1亚基组成均为null、14+15、2+12。
实施例2、易位片段及其特异SCAR标记在DH群体中的验证
一、DH群体
利用实施例1获得的CH4131和CH4133组合，采用花药培养法构建了一个具有85个株系的DH群体。
二、条锈病抗性鉴定
在温室中用条中32和条中34(参考文献：万安民,吴立人,金社林,姚革,王保通.中国小麦条锈菌条中32号的命名及其特性.植物保护学报,2003(04):347-352；刘博,刘太国,章振羽,贾秋珍,王保通,高利,彭云良,金社林,陈万权.中国小麦条锈菌条中34号的发现及其致病特性.植物病理学报,2017,47(5):681-687)对DH群体单株进行条锈病抗性鉴定，反应型按0-9级记载(参考文献：Line RF,Qayoum A(1992)Virulence,aggressiveness,evolution and distribution of races of Pucciniastriiformis(the cause ofstripe rust of wheat)in North America,1968-1987.Technical Bulletin(USA))。以铭贤169作为感病对照。
鉴定结果如表3所示，
表3.DH群体感病类型
Figure BDA0001873960080000111
可以看出，有44个株系表现高抗条锈病，41个株系表现为高度感病，符合1:1的分离比。
三、易位片段及其特异SCAR标记的应用
分别以85个株系基因组DNA为模板，利用实施例1的四的SCAR标记进行PCR扩增，PCR体系和反应程序同于实施例1的四中SCAR标记扩增。
用SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则待测小麦含有序列1所示的易位片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则待测小麦不含有该易位片段。
根据上述结果判断，含有该片段的待测小麦对本专利提及条锈菌小种引起的条锈病抗性大于不含有该片段的待测小麦；
或根据上述结果判断，若含有该片段，则待测小麦为或候选为高抗条锈病。
PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示，泳道：M：DL2000Marker；1-11:表现为高抗条锈病的DH株系；12-22：表现为不高抗条锈病的DH株系；23:H2O；可以看出，D05-A4-1标记在DH株系间具有特异性，即在高抗条锈病的DH株系中能够扩增出163bp的条带，在不高抗条锈病的DH株系和水中未扩增出任何条带，与条锈病抗性鉴定结果一致。
序列表
<110>山西省农业科学院小麦研究所
<120>小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标记的开发
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcagctgag tcttccgatg gaggactttg tagctcctcc accgagccac cctcttctga 60
gcctgccact cctaagaggc caaggacaga ctccacgcca tgagtcggtg ctactaagta 120
gccaactctg gtggctaaga aggcctgttt caacgtgcca aggtccaaca agtaagcagc 180
atagtgaatt ggtacgcagt c 201
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgatggagg actttgtag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttacttgt tggaccttg 19

Claims (10)

1.一种DNA片段，其核苷酸序列由序列表中序列1所示的核苷酸组成。
2.检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质在鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性中的应用；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)检测权利要求1所述的DNA片段的SCAR标记；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
3.检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性产品中的应用；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)检测权利要求1所述的DNA片段的SCAR标记；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
4.检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质在选育高抗条锈病小麦中的应用；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)检测权利要求1所述的DNA片段的SCAR标记；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
5.检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质在制备选育高抗条锈病小麦产品中的应用；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)检测权利要求1所述的DNA片段的SCAR标记；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性的方法，为检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段；若含有该片段，则所述待测小麦为或候选为高抗条锈病；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的方法包括如下步骤：用SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则所述待测小麦含有权利要求1所述的DNA片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则所述待测小麦不含有权利要求1所述的DNA片段；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦条锈病抗性的方法，为检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段；含有该片段的待测小麦的条锈病抗性大于不含有该片段的待测小麦；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的方法包括如下步骤：用SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则所述待测小麦含有权利要求1所述的DNA片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则所述待测小麦不含有权利要求1所述的DNA片段；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物。
8.一种选育高条锈病抗性的小麦的方法，为检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段；选育含有该片段的待测小麦，得到高条锈病抗性的小麦；
所述检测待测小麦4D染色体中是否含有权利要求1所述的DNA片段的方法包括如下步骤：用SCAR标记对待测小麦扩增，若PCR扩增产物含有163bp的片段，则所述待测小麦含有权利要求1所述的DNA片段；若PCR扩增产物不含有163bp的片段，则所述待测小麦不含有权利要求1所述的DNA片段；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物。
9.一种产品，其为如下1)或2)：
1)检测权利要求1所述的DNA片段的SCAR标记；
所述SCAR标记为由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物；
2)含有所述SCAR标记的PCR试剂或试剂盒。
所述产品具有如下(1)或(2)所示功能：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性；
(2)选育高抗条锈病小麦。
10.权利要求1所述的DNA片段在鉴定或辅助鉴定小麦条锈病抗性中的应用。
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