CN115976266A - 一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07‑InDel及其应用，属于陆地棉育种技术领域。本发明提供的与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07‑InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明分子标记可以在棉花生长早期快速、高效、准确鉴定棉铃大小，提高陆地棉大铃品种的选择效率。
Description
技术领域
本发明属于陆地棉育种技术领域，尤其涉及一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel及其应用。
背景技术
棉花是重要经济和油料作物，是纺织工业的主要原材料。棉花产量是由铃重(Bollweight,BW)、单株铃数(Numbersofperplant,NB)和衣分(Lint percentage,LP)三因素构成。其中，铃重作为棉花产量性状的重要构成因子，是决定棉花产量的重要因素。铃重是用单铃内籽棉的重量表示，即由棉铃内的种子重量和棉纤维的重量相加而成，铃重性状的选择需要通过室内考种确定，具有一定的滞后性，影响田间育种选择效率。而棉铃大小一定程度上可以直观反映铃重大小，因此，育种工作者常把棉铃大小作为田间考察的重要指标。如何快速、高效、准确鉴定棉铃大小需要通过目标性状的精细定位，寻找到与之紧密连锁的分子标记。然而目前有关与棉花棉铃大小(铃重)紧密连锁的分子标记未见报道，且目标性状基因克隆研究的报道较少，不能满足现代快速的分子标记辅助选择育种和分子聚合育种。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel，利用本发明分子标记可以在棉花生长早期快速、高效、准确鉴定棉铃大小，提高陆地棉大铃品种的选择效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel，所述InDel功能分子标记BW07-InDel的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种用于检测上述InDel功能分子标记BW07-InDel的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物。
本发明还提供了一种用于检测陆地棉棉铃大小的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。
本发明还提供了上述InDel功能分子标记BW07-InDel或上述引物对或上述试剂盒在检测陆地棉棉铃大小中的应用。
本发明还提供了上述InDel功能分子标记BW07-InDel或上述引物对或上述试剂盒在棉花高产品种选育中的应用。
本发明还提供了上述InDel功能分子标记BW07-InDel或上述引物对或上述试剂盒在分子聚合育种中的应用。
本发明还提供了上述InDel功能分子标记BW07-InDel或上述引物对或上述试剂盒在陆地棉基因图位克隆中的应用。
本发明还提供了一种检测陆地棉棉铃大小的方法，包括如下步骤：以待测棉花DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；根据扩增产物的长度判断待测棉花棉铃大小：当扩增产物的长度为1820bp时，则待测棉花的棉铃为小铃；当扩增产物的长度为975bp时，则待测棉花的棉铃为大铃。
优选的，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O19μl，模板DNA2.0μl，2×PhantaFlashMasterMix25μl，10μM的正向引物2.0μl，10μM的反向引物2.0μl。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为98℃预热30s；98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次；72℃延伸1min，4℃保存。
本发明的有益效果：
本发明首次提供了一个与陆地棉第07染色体棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel，该分子标记与目标性状紧密连锁，具有目标性状功能。本发明提供的功能分子标记BW07-InDel能够快速、准确鉴定棉铃大小(铃重)，能够大大加快棉花高产品种的选育进程，对棉铃大小(铃重)分子标记辅助选择育种和分子聚合育种具有重要的应用价值，同时为棉铃大小(铃重)QTL/基因的图位克隆奠定基础。
附图说明
图1为亲本棉铃大小及不同年份铃长(Bolllength,BL)和铃宽(Boll weidth,BW)的比较分析；
图2为目标性状棉铃大小的精细定位及紧密连锁分子标记的鉴定；
图3为功能分子标记BW07-InDel对亲本和14份自然群体材料的鉴定结果，其中P1为鲁棉研22号(LMY22)，P2为CSSL7，No:1-14分别为中棉所5号、ASJ-5、长429、遗引85、惠民R-99、徐州1818、PD6189、陕401、晋棉38、中远9114、苏远04-21、冀棉17、库车386-5和新陆早6号；其中No.1、4、5、6、9、10、12和14为小铃材料；其中No.2、3、7、8、11和13为大铃材料；
图4为不同年份2个亲本和14份自然群体材料棉铃铃长数据分布图，其中图(a)为2019年数据，图(b)为2020年数据；P1为鲁棉研22号(LMY22)，P2为CSSL7，No:1-14分别为中棉所5号、ASJ-5、长429、遗引85、惠民R-99、徐州1818、PD6189、陕401、晋棉38、中远9114、苏远04-21、冀棉17、库车386-5和新陆早6号；其中No.1、4、5、6、9、10、12和14为小铃材料；其中No.2、3、7、8、11和13为大铃材料。
具体实施方式
本发明提供了一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel，所述InDel功能分子标记BW07-InDel的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明发现了位于棉花第7染色体上的控制棉铃大小主效基因GhBW1新等位变异，并获得了可用于区分二者的InDel功能分子标记BW07-InDel。只需要检测上述标记的扩增条带特性，便能够判断目标材料中的GhBW1位点是否是新的等位变异，用于指导棉花棉铃大小(铃重)改良的育种工作，能够实现大铃表型品种的筛选。本发明提供的分子标记不仅在苗期就能区别棉花品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现目标基因在棉花种质资源以及育种后代中的鉴定，极大的降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响。
本发明还提供了一种用于检测上述InDel功能分子标记BW07-InDel的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2：ACCTCTCTAAACTTTTAGTGTTCAA所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3：TGGTAAAAATCTGGCACAAG所示的反向引物。
本发明还提供了一种用于检测陆地棉棉铃大小的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。
本发明对于试剂盒中所包含的其他试剂没有特殊限定，采用本领域PCR扩增时常用的试剂均可，如dNTPs、TaqDNA聚合酶和含镁离子的10×Taq buffer等。
本发明还提供了上述InDel功能分子标记BW07-InDel或上述引物对或上述试剂盒在检测陆地棉棉铃大小、棉花高产品种选育、分子聚合育种或陆地棉基因图位克隆中的应用。
本发明还提供了一种检测陆地棉棉铃大小的方法，包括如下步骤：以待测棉花DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；根据扩增产物的长度判断待测棉花棉铃大小：当扩增产物的长度为1820bp时，则待测棉花的棉铃为小铃；当扩增产物的长度为975bp时，则待测棉花的棉铃为大铃。
本发明对于获得待测棉花DNA的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规DNA提取方法即可。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选的为：ddH2O19μl，模板DNA2.0μl，2×PhantaFlashMasterMix25μl，10μM的正向引物2.0μl，10μM的反向引物2.0μl。本发明对于上述各试剂的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选为98℃预热30s；98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次；72℃延伸1min，4℃保存。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
为确定控制棉铃大小的候选基因，利用本课题前期获得的大铃染色体单片段置换系7(Chromsome Single-segment Substitution Line7,CSSL7)(铃重为6.02g)与正常棉铃鲁棉研22号(LMY22，铃重为5.29g)为亲本杂交，获得F1代。具体为：于2015年夏天，在山东省农业科学院临清试验站进行(LMY22×CSSL7)F1的组配，其中亲本鲁棉研22号(LMY22)，棉铃小，铃长(Bolllength,BL)为46.79mm，铃宽(Bollwidth,BW)为33.14mm，铃重(Bollweight,BW)为5.29g；亲本CSSL7，棉铃大，铃长(Bolllength,BL)为52.76mm，铃宽(Bollwidth,BW)为36.39mm，铃重(Bollweight,BW)为6.02g，且2个亲本在铃长、铃宽和铃重均存在显著性差异。亲本棉铃大小及2018年、2019年两个不同年份铃长(Bolllength,BL)和铃宽(Bollweidth,BW)的比较如图1所示。
2015年冬季于海南三亚加代自交，获得次级渐渗F2群体，利用多态性引物对次级渐渗F2群体进行扩增的反应体系为10μl，具体如下：ddH2O4.7μl，模板DNA1.0μl，10×Buffer1.0μl，2.5mMMgCl21.0μl，10mMdNTPs0.2μl，浓度为10μM的正向引物1.0μl，浓度为10μM的反向引物1.0μl，TaqDNA聚合酶0.1μl。扩增反应程序为：预热95℃5min，变性94℃45s，退火55℃45s，延伸72℃1min；循环30次，延伸72℃10min；保存4℃至取出，利用8％非变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳，记录结果。2016年在山东省农业科学院临清试验站进行亲本、次级渐渗(LMY22×CSSL7)F2群体的种植，F2群体大小为3302个单株，同时对两个亲本进行重测序，针对目标区域开发InDel分子标记，筛选亲本多态性标记；2017-2018年连续2年4代进行重组交换个体的鉴定，鉴定得到13种纯合交换重组个体，如图2所示。2019年在山东省农业科学院临清试验站进行亲本和13种纯合交换重组个体的种植，8月下旬进行棉铃大小的测量，由于亲本在铃长和铃宽均存在显著性差异，但铃长增幅(11.31％)较铃宽(8.93％)大，所以在后续进行棉铃大小的精细定位时主要利用铃长的表型数据进行棉铃大小基因的定位(图2)。结合铃长表型数据进行棉铃大小的精细定位，候选区域结果为物理距离54.77kb的InDelBW15和SSR01之间，且与InDelBW02分子标记紧密连锁，同时比对棉花基因组数据库，发现该候选区域仅包含一个基因，功能注释与器官发育相关，命名为GhBW1，该基因基因组大小为4252bp，包含2个外显子和1个内含子。通过亲本重测序发现，目标基因区域，亲本CSSL7与LMY22存在一个大片段的差异。由于目标基因较大，将基因分成3部分进行扩增，第一部分包括启动子500bp+第一个外显子(246bp)+缺失片段到第一个内含子位置(1074bp)，合计约1820bp，第二部分包括缺失片段到第二个外显子位置，约1787bp，第三部分包括第二个外显子+后续500bp序列，合计约1616bp。扩增结果显示，2个亲本在第二部分与第三部分均无差异，第一部分存在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的差异。进一步序列比对分析发现，CSSL7与LMY22相比，在基因内含子上缺失如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，造成2个亲本棉铃大小的差异，确定核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel功能分子标记BW07-InDel与陆地棉棉铃大小紧密连锁。
实施例2
针对实施例1获得的InDel功能分子标记BW07-InDel设计了如表1所示的引物对，2019年与2020年连续2年种植2个亲本和14份自然群体材料，14份自然群体从表型分类包括8份小铃材料，分别为中棉所5号、遗引85、惠民R-99、徐州1818、晋棉38、中远9114、冀棉17、新陆早6号和6份大铃材料，分别为ASJ-5、长429、PD6189、陕401、苏远04-21、库车386-5。均在种植当年8月下旬铃期进行棉铃大小的测量，同时利用表1所述引物对进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为50μl，具体如下：ddH2O19μl，模板DNA2.0μl，2×PhantaFlashMasterMix(DyePlus)25μl，浓度为10μM的正向引物2.0μl，浓度为10μM的反向引物2.0μl。扩增反应程序为：预热98℃30s；变性98℃10s，退火57℃10s，延伸72℃10s，循环30次；延伸72℃1min；保存4℃至取出，利用1％凝胶电泳，记录结果。结果如图3所示。鉴定结果为8份小铃材料与亲本LMY22基因型相同，扩增产物长度为1820bp；6份大铃材料与亲本CSSL7基因型相同，扩增产物长度为975bp。
棉铃大小(铃长)数据结果如图4所示。8份小铃材料铃长与亲本LMY22基本相同，6份大铃材料与亲本CSSL7基本相同，且小铃材料与大铃材料均存在显著性差异。
表1扩增InDel功能分子标记BW07-InDel的引物对
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel，其特征在于，所述InDel功能分子标记BW07-InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于检测权利要求1所述InDel功能分子标记BW07-InDel的引物对，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的反向引物。
3.一种用于检测陆地棉棉铃大小的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物对。
4.权利要求1所述InDel功能分子标记BW07-InDel或权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒在检测陆地棉棉铃大小中的应用。
5.权利要求1所述InDel功能分子标记BW07-InDel或权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒在棉花高产品种选育中的应用。
6.权利要求1所述InDel功能分子标记BW07-InDel或权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒在分子聚合育种中的应用。
7.权利要求1所述InDel功能分子标记BW07-InDel或权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒在陆地棉基因图位克隆中的应用。
8.一种检测陆地棉棉铃大小的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测棉花DNA为模板，用权利要求2所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；根据扩增产物的长度判断待测棉花棉铃大小：当扩增产物的长度为1820bp时，则待测棉花的棉铃为小铃；当扩增产物的长度为975bp时，则待测棉花的棉铃为大铃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 19μl，模板DNA 2.0μl，2×Phanta Flash MasterMix 25μl，10μM的正向引物2.0μl，10μM的反向引物2.0μl。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为98℃预热30s；98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次；72℃延伸1min，4℃保存。
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