CN109338001B

CN109338001B - 一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法

Info

Publication number: CN109338001B
Application number: CN201811296392.5A
Authority: CN
Inventors: 翟荣荣; 张�林; 张小明; 叶胜海; 何祖华
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; Yangzhou University
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; Yangzhou University
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN109338001A

Abstract

本发明公开了一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法，包括分子标记Sd1SNP和Sd1InDel，分别由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组合而成。还公开了所述功能性分子标记的检测方法及其应用，本发明的功能性分子标记以PCR技术为基础，能区分鉴定稻种资源的矮源类型，不受环境以及人为因素的影响，可以用于水稻矮化育种，改良水稻株型，该方法和标记在水稻育种领域具有广阔的应用前景。

Description

一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法

技术领域

本发明属于水稻选育技术领域，涉及一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法。

背景技术

水稻是人类主要的能源作物，随着全球人口数量的持续增加及耕地面积的急剧减少，粮食安全正成为一个严重的全球问题。株高是水稻重要的农艺性状之一，半矮秆基因sd1的应用极大提高了水稻单产，解决了高秆水稻品种高肥条件下的倒伏问题，在“绿色革命”中起到了关键性的作用。以矮仔占、矮脚南特或低脚乌尖为矮源育成的矮秆品种，已为世界水稻生产做出了举世瞩目的贡献。但是，目前籼稻品种的矮源基因来源过于单一，主要集中在矮脚南特突变类型。因此，目前亟待解决的问题是在育种中如何利用现有品种为亲本，在繁育新品种时不受单一矮源的限制。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法，用于区别鉴定水稻基因矮源，可用于水稻矮化育种，使得改良水稻株型不受单一矮源的限制。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记，该分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel，Sd1SNP由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对组成，Sd1InDel由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对组成；

SEQ ID NO.1:CGCGGTTTGTCCTTGTCG；

SEQ ID NO.2:AAATCGGCTTCTGTTCGTTCC；

SEQ ID NO.3:CGCACGGGTTCTTCCAGGTGT；

SEQ ID NO.4:CTCCAGGAGTTCCATGATCGTCAGC。

所述的分子标记Sd1SNP用于鉴定水稻半矮秆基因sd1第3外显子上的第146位碱基发生C-G突变形成的等位基因；

所述的分子标记Sd1InDel用于鉴定水稻半矮秆基因sd1第1和第2外显子处发生大片段缺失形成的等位基因。

本发明还提供一种水稻矮源基因鉴定方法，包括以下操作：

以提取的水稻总DNA为模板，分别以分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel为引物进行PCR扩增；

Sd1SNP由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对组成，Sd1InDel由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对组成；

对Sd1SNP扩增的产物进行Ncil酶切后电泳检测，根据电泳检测结果进行等位基因的鉴定：

若检测结果只有一个486bp的条带，则表明第146位碱基发生C-G突变；

若检测结果有184bp和302bp的两条带，则表明第146位碱基未发生C-G突变；

对Sd1InDel扩增的产物进行电泳检测，根据电泳检测结果进行等位基因的鉴定：

若检测结果为68bp的条带，则表明水稻半矮秆基因sd1第1和第2外显子处发生大片段缺失形成的等位基因；

若检测结果为451bp的条带，则表明水稻半矮秆基因sd1第1和第2外显子处没有发生大片段缺失形成的等位基因；

若第146位碱基发生C-G突变，则说明其水稻矮源基因含有9311突变类型；若没有发生该突变，提示其水稻矮源基因可以引入9311突变类型进行株高改良；

若第1和第2外显子处发生大片段缺失，则说明其水稻矮源基因含有矮脚南特突变类型；若没有发生该突变，提示其水稻矮源基因可以引入矮脚南特突变类型进行株高改良。

在PCR扩增时PCR反应体系如下：

DNA模板1μl，2.5mM dNTPs 5μl，2×KOD buffer 12.5μl，10μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，1U/μl KOD酶0.5μl，H₂O 4μl；

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性60sec，65℃退火60sec，72℃延伸120sec，共34个循环；最后72℃延伸10min。

进一步提出，所述的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记在培育矮秆水稻品种或品系中的应用。

通过分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel鉴定需要改良的水稻品种或品系的水稻半矮秆基因sd1，若第146位碱基发生C-G突变，则说明其水稻矮源基因含有9311突变类型；若没有发生该突变，提示其水稻矮源基因可以引入9311突变类型进行株高改良；

若水稻半矮秆基因sd1没有相应的突变，则通过杂交回交的方法将水稻9311品系或矮脚南特突变类型品系的水稻半矮秆基因sd1导入到育种品系中，改良新品种或品系的株高性状。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及鉴定方法，是基于本发明对水稻半矮秆基因sd1的研究，通过比较性状筛选出BC₁F₄，然后对BC₁F₄的株高性状调控基因进行分析，结合后代群体表型验证最后将候选基因定位到189kb的范围内，基因组注释信息显示半矮杆基因sd1位于该区间，对浙粳22和9311的sd1基因进行测序，测序结果表明位于第3外显子上146位碱基发生C-G突变导致9311中GA20氧化酶编码提前终止，从而导致蛋白功能缺失，这与9311位点植株变矮效应一致，因此确定sd1就是调控9311株高性状的候选基因。而其BC₁F₄高杆株系中sd1基因为浙粳22片段，所以其表现出高杆的性状。

本发明提供的水稻半矮秆基因sd1分子标记及鉴定方法，通过检测与sd1等位基因连锁的分子标记可以鉴定新的水稻矮源，可用于水稻矮化育种，使得改良水稻株型不受单一矮源的限制。可以利用9311的sd1位点可降低水稻株高，尤其是籼稻株高，也可以进一步改造粳稻株型，使其适应特定地区的栽培条件，从而提高水稻耐肥和抗倒伏能力，并最终增产。

附图说明

图1为BC₁F₄代中获得株高明显超过9311的株系；

图2为遗传背景筛选结果；

图3为9311位点、浙粳22位点及杂合位点对株高的贡献率；

图4为水稻半矮秆基因sd1新等位基因定位图谱；

图5为2个半矮秆等位基因的序列对比图；

图6为特异性分子标记Sd1SNP对48个籼稻品种的DNA检测结果，箭头所指为9311矮源类型；

图7为特异性分子标记Sd1InDel对48个籼稻品种的DNA检测结果，箭头所指为矮脚南特矮源类型。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及鉴定方法，所述的分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel，分别由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQID NO.3和SEQ ID NO.4组成。所述分子标记以PCR技术为基础，能区分鉴定稻种资源的矮源类型，不受环境以及人为因素的影响，可以用于水稻矮化育种，改良水稻株型。

本发明所提供的分子标记是基于水稻半矮秆基因sd1的两个等位基因，一种是sd1基因在位于第3外显子上146位碱基发生C-G突变导致9311中GA20氧化酶编码提前终止，从而导致蛋白功能缺失，产生水稻矮化；另一种是矮脚南特sd1位点则在第1和第2外显子处发生大片段缺失，从而导致导致水稻矮化。

下面对上述的两个等位基因进行具体的说明。

本发明用粳稻品种浙粳22作母本、籼稻品种9311作父本杂交，并将杂交所得F₁代继续与9311回交，随后连续自交4代获得BC₁F₄。在BC₁F₄群体中筛选株高显著高于9311的株系，表型观察显示BC₁F₄群体中的高杆株系株高明显高于9311(如图1所示，BC₁F₄代中中的高杆株系株高明显超过9311)，进一步统计分析发现高杆株系的株高增加是由于每个节长高于9311，但穗长没有明显变化，这表明浙粳22和9311包含独立的株高基因。

因此，对其BC₁F₄高杆株系中的1株极端高杆支植株用遍布水稻基因组的分子标记进行遗传背景筛选(遗传背景筛选方法参见：Mapping of qGL7-2,a grain length QTL onchromosome 7of rice，J.Genet.Genomics 37(2010)523-531)，结果发现该BC₁F₄株系的基因组中大部分已被9311片段替换，仅有7个基因组区域(图2黑色片段标注)包含纯合浙粳22片段，而且对应的后代株高稳定，全部为高杆植株，因此推测浙粳22片段置换区域包含控制株高基因。进一步，利用1号染色体长臂端标记A1和A2对定位群体进行连锁分析，发现该区域与高杆表型连锁(图2)；统计分析显示该1号染色体长臂端连锁片段(图2)对表型的贡献率达到44.5％(图3)，证明其中包含一个株高主效位点，影响高杆表型。通过比对日本晴和9311该位点序列，设计新的连锁标记鉴定定位群体，最终找到4个关键交换个体L30-11-5、L30-14-5、L30-16-1和L31-12-2，根据4个关键交换单株发生重组位置的基因型，结合后代群体表型验证最后将候选基因定位到189kb的范围内(如图4所示，L30-11-5在A147.5-1和A149.1-1标记之间发生交换，L30-14-5、L30-16-1和L31-12-2在A149.1-1和A150.7-1标记之间发生交换，其中L30-11-5和L31-12-2后代表型为高杆，证明黑色区域为高杆调控区域，即A147.5-1和A150.7-1之间)，基因组注释信息显示半矮杆基因sd1位于该区间(图4，左侧代表四个交换单株名称，上部为分子标记名称，右侧数字为交换单株后代数目)。

对浙粳22和9311的sd1基因进行测序，两者在3个外显子上都有SNP差异，而位于第3外显子上146位碱基发生C-G突变导致9311中GA20氧化酶编码提前终止，从而导致蛋白功能缺失，这与9311位点植株变矮效应一致，因此确定sd1就是调控9311株高性状的候选基因。而其BC₁F₄高杆株系中sd1基因为浙粳22片段，所以其表现出高杆的性状。测序结果表明9311的水稻半矮秆基因sd1基因第3外显子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示(下划线处表示发生C-G突变)：

CGCTGTCGAACGGGAGGTATAAGAGCTGCCTGCACAGGGCGGTGGTGAACCAGCGGCGGGAGCGGCGGTCGCTGGCGTTCTTCCTGTGCCCGCGGGAGGACAGGGTGGTGCGGCCGCCGCCGAGCGCCGCCACGCCGCGGCACTAGCCGGACTTCACCTGGGCCGACCTCATGCGCTTCACGCAGCGCCACTACCGCGCCGACACCCGCACGCTCGACGCCTTCACGCGCTGGCTCGCGCCGCCGGCCGCCGACGCCGCCGCGACGGCGCAGGTCGAGGCGGCCAGCTGA。

矮脚南特sd1位点则在第1和第2外显子处发生大片段缺失(参考文献：Greenrevolution a mutant gibberellin-synthesis gene in rice，Nature，volume 416,pages 701–702，2002)，导致蛋白失去功能(图5)，从而导致水稻矮化。

上述2种突变类型都能够产生矮杆表型，由此根据2种突变类型的突变特点分别设计分子标记，用于特异区分2种突变类型。其中引物Sd1SNP扩增包含9311提前终止位点，其SNP导致Ncil酶切位点缺失，因此扩增产物无法被酶切开，引物Sd1SNP序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；而Sd1Indel则直接扩增缺失区域，电泳后能看到条带明显变小，引物Sd1Indel序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示(图5)。通过这2组引物对矮脚南特和9311矮秆突变类型的稻种资源DNA进行扩增，得到扩增产物后进行酶切电泳鉴定，从而可以确定水稻矮源类型。

所述引物对的核苷酸序列如下所示:

SEQ ID NO.1:CGCGGTTTGTCCTTGTCG；

SEQ ID NO.2:AAATCGGCTTCTGTTCGTTCC；

SEQ ID NO.3:CGCACGGGTTCTTCCAGGTGT；

SEQ ID NO.4:CTCCAGGAGTTCCATGATCGTCAGC。

本发明提出的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记，其中，所述的分子标记Sd1SNP用于鉴定水稻半矮秆基因sd1第3外显子上的第146位碱基发生C-G突变形成的等位基因；

下面给出具体的鉴定方法。

利用分子标记区别鉴定矮源的方法，包括以下步骤：

以提取的水稻总DNA为模板，分别以分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel为引物进行PCR扩增；具体的：提取水稻DNA，分别由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4从水稻总DNA中扩增出核苷酸序列，前者经特异性内切酶Ncil酶切后电泳检测，后者则直接电泳检测。

如果引物Sd1SNP的扩增产物不能用Ncil内切酶酶切，则标志着该材料为9311矮源类型，而用引物Sd1InDel扩增后可直接根据条带大小进行区分，矮脚南特突变类型扩增条带较小。

具体的，对Sd1SNP扩增的产物进行Ncil酶切后电泳检测，根据电泳检测结果进行等位基因的鉴定：

若检测结果为451bp的条带，则表明水稻半矮秆基因sd1第1和第2外显子处没有发生大片段缺失形成的等位基因。

进一步的，所述提取水稻DNA的方法包括以下步骤：

(1)取水稻新鲜叶片约5cm，将叶片放入1.5ml的离心管中，加适量液氮将其研磨成粉末；

(2)在1.5ml的离心管中加入500μl预热的CTAB提取液。65℃温育3h(1h以上即可)，冷却至室温后等体积氯仿抽提，上下颠倒均匀，室温下静置10min，13000rpm室温下离心10min；

(3)吸取上清液于另一灭菌的1.5ml离心管中，不可吸到下层氯仿；

(4)用等体积异丙醇或无水乙醇沉淀，混匀，室温下静置10min，13,000rpm室温下离心10min，收集沉淀，并以70％乙醇洗涤；

(5)将洗涤后的沉淀瞬时离心，倒去70％乙醇，自然干燥；

(6)沉淀风干后，离心管中加入50μl已灭菌的TE缓冲液；

(7)-20℃保存备用。

所述的PCR反应体系如下：

作为优选，上述的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性60sec，65℃退火60sec，72℃延伸120sec，共34个循环；最后72℃延伸10min。

下面给出2个sd1等位基因的功能性分子标记在鉴别不同水稻矮源类型中的应用的实施例。

采用含有不同矮源类型的48个籼稻的基因组DNA，并以此为模板，利用分子标记Sd1SNP和Sd1Indel进行PCR扩增、酶切、电泳检测，电泳结果如图6-7所示。图6为特异性分子标记Sd1SNP对48个籼稻品种的DNA检测结果，结果显示只有6个品种的Sd1SNP扩增产物不能用Ncil内切酶酶切，为9311矮源类型，其余品种的Sd1SNP扩增产物能用Ncil内切酶酶切，导致扩增条带变小，说明48个籼稻品种中包含9311SNP突变位点的品种较少；图7为特异性分子标记Sd1InDel对48个籼稻品种的DNA检测结果，结果显示有38个品种的扩增条带较小，说明包含矮脚南特缺失位点的品种有38个。以上结果说明9311位点还没有广泛应用到育种品系中。

结果验证了2对引物在品种鉴定中的作用，含有矮脚南特突变类型和9311突变类型的稻种资源能够被鉴定区分，因此可以利用这2个标记辅助选择鉴定sd1不同等位基因(鉴定sd1位点的SNP或缺失型)并改良株高性状(首先，通过分子标记鉴定需要改良品种或品系的sd1位点类型，如果不存在9311的sd1位点，则可以通过传统杂交回交的方法将9311的sd1位点导入到育种品系中，达到改良株高的目的)。

鉴于本发明提出的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及水稻矮源基因鉴定方法，本发明提出以下应用：

所述的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记在培育矮秆水稻品种或品系中的应用。

本发明可以利用9311的sd1位点降低水稻株高，尤其是籼稻株高，也可以进一步改造粳稻株型，使其适应特定地区的栽培条件，从而提高水稻耐肥和抗倒伏能力，并最终增产。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggtttgt ccttgtcg 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatcggctt ctgttcgttc c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcacgggtt cttccaggtg t 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccaggagt tccatgatcg tcagc 25

<210> 5

<211> 290

<212> DNA

<213> 籼稻品种9311(Oryza sativa L.ssp.Indica)

<400> 5

cgctgtcgaa cgggaggtat aagagctgcc tgcacagggc ggtggtgaac cagcggcggg 60

agcggcggtc gctggcgttc ttcctgtgcc cgcgggagga cagggtggtg cggccgccgc 120

cgagcgccgc cacgccgcgg cactagccgg acttcacctg ggccgacctc atgcgcttca 180

cgcagcgcca ctaccgcgcc gacacccgca cgctcgacgc cttcacgcgc tggctcgcgc 240

cgccggccgc cgacgccgcc gcgacggcgc aggtcgaggc ggccagctga 290

Claims

1.一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记，其特征在于，该分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel，Sd1SNP由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增得到，Sd1InDel由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增得到；

SEQ ID NO.1:CGCGGTTTGTCCTTGTCG；

SEQ ID NO.2:AAATCGGCTTCTGTTCGTTCC；

SEQ ID NO.3:CGCACGGGTTCTTCCAGGTGT；

SEQ ID NO.4:CTCCAGGAGTTCCATGATCGTCAGC。

2.如权利要求1所述的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记，其特征在于，所述的分子标记Sd1SNP用于鉴定水稻半矮秆基因sd1第3外显子上的第146位碱基发生C-G突变形成的等位基因；

3.一种水稻矮源基因鉴定方法，其特征在于，包括以下操作：

以提取的水稻总DNA为模板，分别以扩增分子标记Sd1SNP和Sd1InDel的引物对进行PCR扩增；

Sd1SNP由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增得到，Sd1InDel由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增得到；

SEQ ID NO.1:CGCGGTTTGTCCTTGTCG；

SEQ ID NO.2:AAATCGGCTTCTGTTCGTTCC；

SEQ ID NO.3:CGCACGGGTTCTTCCAGGTGT；

SEQ ID NO.4:CTCCAGGAGTTCCATGATCGTCAGC；

对由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增得到的产物进行Ncil酶切后电泳检测，根据电泳检测结果进行等位基因的鉴定：

对由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增得到的产物进行电泳检测，根据电泳检测结果进行等位基因的鉴定：

4.如权利要求3所述的一种水稻矮源基因鉴定方法，其特征在于，若第146位碱基发生C-G突变，则说明其水稻矮源基因含有9311突变类型；若没有发生该突变，提示其水稻矮源基因可以引入9311突变类型进行株高改良；

5.如权利要求3所述的一种水稻矮源基因鉴定方法，其特征在于，在PCR扩增时PCR反应体系如下：

DNA模板1μl，2.5mM dNTPs 5μl，2×KOD buffer 12.5μl，10μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，1U/μl KOD酶0.5μl，H₂O4μl；

6.权利要求1所述的鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记在培育矮秆水稻品种或品系中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，通过分子标记包括Sd1SNP和Sd1InDel鉴定需要改良的水稻品种或品系的水稻半矮秆基因sd1，若第146位碱基发生C-G突变，则说明其水稻矮源基因含有9311突变类型；若没有发生该突变，提示其水稻矮源基因可以引入9311突变类型进行株高改良；

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，若水稻半矮秆基因sd1没有相应的突变，则通过杂交回交的方法将水稻9311品系或矮脚南特突变类型品系的水稻半矮秆基因sd1导入到育种品系中，改良新品种或品系的株高性状。