CN113046464B - 筛选大豆材料的分子标记、筛选方法、育种方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种筛选大豆材料的分子标记、筛选方法、育种方法和应用，所述分子标记包括InDel标记或/和dCAPS标记，利用前述分子标记筛选大豆高蛋白材料的步骤包括：选择所述InDel标记作为引物对；利用所述InDel标记的引物对，选择一个或多个大豆品种DNA进行第一PCR扩增；将所述第一PCR扩增产物进行第一电泳检测，第一电泳检测条带以高带呈现的大豆品种为低蛋白品种，第一电泳检测条带以低带呈现的大豆品种为高蛋白品种。本发明基于全基因组重测序和QTL定位技术，开发靶向明确的高蛋白InDel和dCAPS，通过InDel和dCAPS组合标记的形式为今后大豆高蛋白质资源的筛选和分子标记辅助选育高蛋白、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。

Description

筛选大豆材料的分子标记、筛选方法、育种方法和应用
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及筛选大豆高蛋白材料的分子标记，以及使用该引物筛选大豆高蛋白材料的方法，以及利用所述引物筛选目标株系进行育种的方法。
背景技术
大豆籽粒富含蛋白质，占籽粒干物质的31％～55％，是人类食物蛋白的主要来源之一。其蛋白质产量占生产蛋白作物蛋白质产量的三分之二，更为难得的是它富含多种人体必需氨基酸，世界卫生组织将大豆蛋白质定为一类蛋白。同时，大豆蛋白具有很好的功能特性，能够运用在多种食品体系，提高产品质量。
目前，在大豆所有20个染色体上均发现有蛋白相关的QTL位点，其中利用连锁分析共检测到213个蛋白质含量QTL，利用关联分析共检测到85个蛋白质含量QTL。这些QTL贡献率介于0.002％～80％之间。但是，大豆蛋白含量是多基因控制的数量性状,蛋白相关QTL具有材料特异性，不能通用于特定育种群体的分子标记辅助选择育种。
大豆蛋白含量是典型的多基因控制的数量性状,且蛋白相关QTL具有材料特异性，不能通用于特定育种群体的分子标记辅助选择育种。其次，大豆的品种资源丰富，遗传特性复杂，与整个基因组相比功能性标记较少。
在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：
目前开发的分子标记多基于连锁分析，不能直接靶向目标基因，基因的分离重组会造成标记信息的丢失，对目标性状的选择造成一定的困难。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种标记特异性高分子标记，包括InDel标记和/或dCAPS标记。
本发明的另一目的是提供一种利用本发明提供的InDel标记和dCAPS标记筛选高蛋白大豆材料的方法。
本发明的第三个目的是利用InDel标记和dCAPS标记引物组合筛选大豆繁殖材料进行大豆育种的方法。
本发明的第四个目的是提供一种InDel标记和dCAPS标记引物组合筛选大豆繁殖材料上的应用。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种筛选大豆高蛋白材料的分子标记，所述分子标记包括InDel标记、dCAPS标记中的一个或两个；
所述InDel标记的引物对碱基序列如下：
NC_SAM-InDelF：AAGCCTTTTGAGTTGTGGA；
NC_SAM-InDelR：ATTGCTATTTCCCTTCTGC；
所述dCAPS标记的引物对碱基序列如下：
NC_BET12dCAPSF：ATGTAGAAGCAGGAGCAGAAGAGGGGGATC；
NC_BET12dCAPSR：TAAAGAAGAACTGCTGGAA。
本发明还提供了一种利用前述分子标记筛选大豆高蛋白材料的方法，包括如下步骤：
S1.1选择所述InDel标记作为引物对；
S1.2第一PCR扩增利用所述InDel标记的引物对，选择一个或多个大豆品种DNA进行第一PCR扩增；
S1.3第一电泳检测将S1.2所述第一PCR扩增产物进行第一电泳检测，第一电泳检测条带以高带呈现的大豆品种为低蛋白品种，第一电泳检测条带以低带呈现的大豆品种为高蛋白品种。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，还包括如下步骤：
S2.1选择所述dCAPS标记作为引物对；
S2.2第二PCR扩增利用所述dCAPS标记的引物对，对S1.2所述大豆品种DNA进行第二PCR扩增；
S2.3酶切用限制性内切酶BamHI酶切S2.2所述第二PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；
S2.4第二电泳检测将S2.3酶切所得片段进行第二电泳检测，第二电泳检测条带以高带呈现的大豆品种为低蛋白品种；第二电泳检测条带以低带呈现的大豆品种为高蛋白品种。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，所述第一PCR扩增具体操作如下：
第一PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_SAM-InDelF和10μM反向引物NC_SAM-InDelR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第一PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，所述第一电泳检测具体操作如下：取6μL所述第一PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130V，15分钟。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，所述第二PCR扩增具体操作如下：
第二PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_BET12dCAPSF和10μM反向引物NC_BET12dCAPSR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第二PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，所述酶切的具体操作如下：
酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，第二PCR扩增产物10μL，BamHI限制性内切酶2μL，ddH2O补齐至20μL，37℃酶切反应2h。
根据本发明筛选大豆高蛋白材料的方法进一步的实施方式，所述第二电泳检测的具体操作为：
取6μL酶切所得片段在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130V，60分钟。
本发明还提供了一种大豆育种方法，通过前述方法选择出Gm.SAM基因中的InDel基因型为缺失同时GmBET12基因附近的SNP基因型为C的大豆，即为筛选出的目标株系，对所述目标株系进行育种，即实现提高大豆蛋白含量的分子标记育种。
本发明还提供了一种前述分子标记的应用，所述分子标记用于筛分大豆高含油量材料或高蛋白材料。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本发明提供的InDel和dCAPS标记特异性高：InDel标记的下游引物NC_SAM-InDelR和上游引物NC_BET12dCAPSF，其序列分别经blast比对，在Williams82、Lee、中黄13、PI483463和W05等大豆参考基因组上的位置都是唯一的。
b)本发明基于全基因组重测序和QTL定位技术，开发靶向明确的高蛋白InDel和dCAPS，通过InDel和dCAPS组合标记的形式为今后大豆高蛋白质资源的筛选和分子标记辅助选育高蛋白、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。
c)本发明基于全基因组重测结果结合QTL定位结果，针对特定基因开发基因靶向的InDel标记或dCAPS标记，以标记组合的策略对育种材料进行低世代的标记选择，有助于在低世代对育种材料中的蛋白优异基因聚集，降低高世代育种选择工作量，缩小育种规模，缩短育种年限。
d)本发明提供的InDel和dCAPS分子标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子。利用本标记在大豆苗期就可以鉴定植株的基因型，省去回交渗入过程中每代自交的步骤。此外，InDel和dCAPS分子标记可以根据PCR产物或酶切产物条带特征即可判断蛋白含量高低，无需测序或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作，检测的准确率较高，且具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。
e)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。由于大豆蛋白含量是典型的数量性状，单个遗传位点的贡献率是有限的。本发明利用靶向不同关键候选基因的标记进行组合筛选，大大提高了鉴定的准确性。经过在24个不同遗传背景的品种中检测，这两个标记都能显现出多态性，其适用性很广。对杂交分离后代进行检测，组合标记筛选更加准确。
f)本发明提供的一种InDel和dCAPS标记组合具有重要的应用价值，利用此标记组合可以进行精准的高蛋白分子标记辅助选择育种、可以提高基因聚合育种中的应用效率，大大加快大豆高蛋白分子育种的进程。
g)大豆蛋白含量与含油量呈显著负相关，因此可反向利用本发明标记组合筛选低蛋白、高含油量的材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是QTL定位及QTL-seq定位结果。上部分为连锁分析在20号染色体上检测到的QTL位点；中间为本发明的定位结果与前人研究的结果的比较；下部分为利用QTL-seq分析，通过全基因组重测序生成SNP-index图。
图2是9个候选基因的表达模式分析。图2中，左侧为测序结果热图，右侧为RT-qPCR结果柱状图。
图3是Gm.SAM基因在不同品种间序列比对结果，缺失较大片段的区域为本发明InDel标记的核心位置。
图4是InDel标记和dCAPS标记扩增部分代表性品种的琼脂糖凝胶电泳结果图。a为InDel标记PCR扩增产物的凝胶电泳图；b为dCAPS引物对PCR扩增后经BamHI酶切后的电泳结果图。
图5是InDel标记和dCAPS标记在部分杂交后代中的琼脂糖凝胶电泳结果图。a为InDel标记PCR扩增产物的凝胶电泳图；b为dCAPS引物对PCR扩增后经BamHI酶切后的电泳结果图。
具体实施方式
下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
本实施例主要说明InDel标记与dCAPS标记的开发过程，为避免重复赘述，在本实施例中一同说明了利用InDel标记筛分高蛋白大豆品种。发明人在完成本发明过程中，发现使用InDel标记不能完全准确的通过PCR产物大小判定其蛋白含量的高低，即电泳检测中部分品种出现了杂合带，因此发明人进一步开发了dCAPS标记，同时本实施例中也一同说明了在利用InDel标记筛分高蛋白大豆品种的步骤之后，进一步第利用dCAPS标记筛分高蛋白大豆品种。进而，本发明InDel标记和dCAPS标记具备了筛分高蛋白大豆品种的应用。此外，大豆蛋白含量与含油量呈显著负相关，因此可反向利用本发明中的标记组合筛选低蛋白、高含油量的材料。
InDel标记，即InDel(insertion-deletion)分子标记：插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，这就是InDel标记。
dCAPS标记：针对CAPS标记的不足而优化改进的一种标记，对PCR扩增的DNA片段的限制性内切酶识别位点内引入SNP进行限制性酶切分析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物,将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。
本发明是基于全基因组重测序和QTL定位技术，开发靶向明确的高蛋白InDel和dCAPS，通过InDel和dCAPS组合标记的形式为今后大豆高蛋白质资源的筛选和分子标记辅助选育高蛋白、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。
1、大豆籽粒粗蛋白含量的遗传定位
利用一个高蛋白大豆品种(南夏豆25，蛋白含量50.1％)作母本，一个低蛋白大豆品种(通豆11,蛋白含量40.5％)作父本进行杂交，F2通过单粒法连续自交至F5构建重组自交系群体。通过高通量测序获得高质量的SNP数据构建高密度的遗传连锁图谱，分单株收获、脱粒，自然风干后使用近红外品质分析仪测定籽粒粗蛋白含量。利用构建的高密度遗传图谱结合蛋白含量数据，采用QTL分析软件Windows QTL Cartographer 2.5及复合区间作图(composite interval mapping,CIM)法对籽粒粗蛋白含量进行QTL定位及效应检测。
在除4、12、14、17、18和19号染色体外的14条染色体上共检测到50个蛋白含量QTL，其中，20号染色体上紧密连锁的两个QTL可分别解释20.13％到46.88％的表型变异。
同时利用高蛋白大豆品种(南夏豆25)作母本，一个低蛋白大豆地方品种(荣县冬豆)作父本进行杂交，获得一个包含不同蛋白含量的F2分离群体，F2苗期单株取材-80℃冰箱保存备用，成熟后单株收获、脱粒，自然风干后使用近红外品质分析仪测定籽粒粗蛋白含量。
从F2代分离群体中挑选出高蛋白含量和低蛋白含量的大豆各30株，分别提取叶片基因组DNA构建高低蛋白DNA混池，将高低蛋白DNA混池和亲本DNA混池同时送广州基迪奥生物公司进行QTL-seq。对鉴定出SNP位点进行统计分析计算其SNP-index值，结合高低蛋白混池的SNP-index值，计算Δ(SNP-index)并作图，如图1所示，图1示出了QTL定位及QTL-seq定位结果。图1的上部分为连锁分析在20号染色体上检测到的QTL位点；图1的中间部分为本发明的定位结果与前人研究的结果的比较；图1的下部分为利用QTL-seq分析，通过全基因组重测序生成SNP-index图。如图1所示，在99％的置信水平下，在20号染色体获得一个较大贡献率的QTL，且该QTL与连锁分析检测到的QTL共定位。
2、候选基因分析
利用全基因组重测序技术，对高蛋白大豆品种南豆12(蛋白含量51.7％)、南夏豆25(蛋白含量50.1％)和低蛋白品种十月黄(蛋白含量41.3％)及荣县冬豆(蛋白含量41.7％)进行全基因组重测序。
基于测序结果，根据高蛋白品种一致、低蛋白品种一致的原则对20号染色体QTL置信区间的所有基因进行变异挖掘。其中209个基因存在插入/缺失变异，在这些插入/缺失变异基因中有16个基因因插入/缺失导致移码突变；40个基因存在非同义替换的SNP，其中3个基因提前终止、3个基因终止密码子变为非终止密码子。
为进一步缩小候选基因范围，利用籽粒成熟期的转录组数据对上述变异基因进行进一步筛选，针对筛选出的候选基因，利用RT-qPCR进一步检测其在高低蛋白品种中的表达情况。最终确定9个基因为可能的候选基因，如图2所示。图2示出了9个候选基因的表达模式分析结果，左侧为测序结果热图，右侧为RT-qPCR结果柱状图。
经过蛋白序列同源比对，发明人选择其中的GmSAM和GmBET12做进一步研究。
3、InDel标记和dCAPS标记的开发
利用重测序获得的Gm.SAM在高低蛋白品种间的序列差异，发明人在该基因编码区的第65个碱基后发现存在44个碱基的缺失，且该缺失变异会形成终止密码子导致提前终止，进一步扩增不同蛋白含量品种的该基因发现这种缺失仅存在于高蛋白品种中。图3示出了Gm.SAM基因在不同品种间序列比对结果，缺失较大片段的区域为本发明InDel标记的核心位置。根据InDel序列位点信息，通过引物设计软件Primer Premier5在该InDel位点上下游各100～200bp处分别设计特异性引物，引物对碱基序列如下：
NC_SAM-InDelF(序列表第1号序列):AAGCCTTTTGAGTTGTGGA；
NC_SAM-InDelR(序列表第2号序列):ATTGCTATTTCCCTTCTGC。
该引物对即为本发明开发的InDel标记。
利用InDel标记筛分大豆高蛋白材料的具体操作如下。
利用InDel标记，选择西南地区有代表性的品种及华北和华南各1个品种进行第一PCR扩增，具体品种名及蛋白含量见表1。
表1本实施例所用代表性品种名称及籽粒粗蛋白含量信息
Figure BDA0003015537750000071
所述第一PCR扩增具体操作如下。
第一PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_SAM-InDelF和10μM反向引物NC_SAM-InDelR各1μL，100ng/μL DNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL。
第一PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
取6μL第一PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行第一电泳检测，电泳条件为130V，15分钟。
第一电泳检测结果如图4a所示：不携带所述InDel的品种(即低蛋白大豆品种)第一PCR扩增产物为单一的204bp片段，第一电泳检测条带以高带(图4a的第7、10-11、14-16、20-21、23、25泳道)呈现；携带所述InDel的品种(即高蛋白大豆品种)第一PCR扩增产物为单一的160bp片段，第一电泳检测条带以低带(图4a的第1-6、8-9、12、17-19、22泳道)呈现，其中24泳道存在杂合带。上述结果表明NC_SAM-InDel标记具有很高的特异性和辨识度以及较广的适用性，其能够清晰地将高蛋白品种与低蛋白大豆品种区别开，具有很高的特异性和辨识度。所述图4a是指图4中a部分电泳条带图。
发明人在完成本发明的过程中发现，单一的InDel标记会出现如图4a所示的第24泳道杂合带的情况，不能准确的通过PCR产物大小判定其蛋白含量的高低。
基于此，发明人进一步分析了另一个关键的候选基因GmBET12。
发明人在该基因附近检测到一个SNP位点(T/C)。重测序数据结果中，低蛋白品种在该位点为T，而高蛋白品种在该位点的碱基变为C。
该SNP位点处不存在限制内切酶酶切位点，无法开发CAPS标记，因此发明人利用dCAPS Finder 2.0网站(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计dCAPS标记。提取该SNP位点上下游各30bp序列导入WT序列框，然后手动将该序列中SNP位点的T改为C后导入Mutant序列框，选择错配碱基数目为1，进行引物设计，共获得34条引物信息及其相应的限制性内切酶。
发明人选取限制性内切酶BamHI作为开发对象，引入错配碱基C形成BamHI酶切位点GGATCC,获得NC_BET12dCAPSF引物序列(序列表第3号序列：ATGTAGAAGCAGGAGCAGAAGAGGGGGATC)；在该SNP位点下游100～200bp处设计NC_BET12dCAPSR引物(序列表第4号序列：TAAAGAAGAACTGCTGGAA)。该引物对即为本发明开发的dCAPS标记。
利用dCAPS标记进一步筛分大豆高蛋白材料的具体操作如下。
利用所述dCAPS标记引物对第二PCR扩增表1所述代表性品种DNA，用限制性内切酶BamHI酶切第二PCR扩增产物进行酶切扩增多态性分析。
第二PCR扩增的具体操作如下。
第二PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_BET12dCAPSF和10μM反向引物NC_BET12dCAPSR各1μL，100ng/μL DNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL。
第二PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
第二PCR扩增反应产物用限制性内切酶BamHI酶切的反应体系为：10×FastDigestBuffer 2μL，PCR产物10μL，BamHI限制性内切酶2μL，ddH2O补齐至20μL，37℃酶切反应2h，获得酶切片段。
取6μL酶切所得片段在2.0％的琼脂糖凝胶上进行第二电泳检测，电泳条件为130V，60分钟。检测结果如图4b所示。图4b是指图4中b部分电泳条带图。
所述SNP位点基因型为T的品种PCR扩增产物经BamHI酶切后为单一的124bp片段，电泳检测条带以高带(图4的第7、10-11、14-16、20-21、23、25泳道)呈现；基因型为C的品种(高蛋白)PCR扩增产物经BamHI酶切后为单一的约90bp片段，电泳检测条带以低带(图4的第1-6、8-9、12、17-19、22、24泳道)呈现。在InDel标记中24泳道为杂合带，在dCAPS标记中，24泳道以低带呈现为高蛋白品种，检测其籽粒粗蛋白含量为47％属于高蛋白品种。
上述结果表明NC_BET12dCAPS标记具有很高的特异性和辨识度以及较广的适用性，其能够清晰地将高蛋白大豆品种与低蛋白大豆品种区别开，具有很高的特异性和辨识度。
4、InDel标记和dCAPS标记的应用
用CTAB法提取亲本南夏豆25、荣县冬豆及F2植株DNA，用Nanodrop分光光度计检测DNA浓度，加ddH2O将所有DNA浓度调整为100ng/μL。按InDel标记和dCAPS标记开发中的条件进行PCR扩增，dCAPS标记扩增的PCR产物使用BamHI酶切，分别取6μL用InDel标记引物对扩增的PCR产物以及dCAPS标记引物对PCR扩增后经BamHI酶切的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果发现F2植株的基因型与表型共分离，即在随机挑选的98株F2群体植株中，InDel标记检测到27株带型与高蛋白亲本南夏豆25一致的株系，71株带型与低蛋白亲本荣县冬豆一致或杂合的株系；dCAPS标记检测到34株与高蛋白亲本南夏豆25一致的株系，64株带型与低蛋白亲本荣县冬豆一致或杂合的的株系。两对标记共同检测到26株材料，经近红外品质分析仪检测，上述26份F2材料籽粒粗蛋白含量均大于45％，属于高蛋白材料，部分扩增产物电泳结果见图5。图5示出了InDel标记和dCAPS标记在部分杂交后代中的琼脂糖凝胶电泳结果。图5中，a为InDel标记PCR扩增产物的凝胶电泳图；b为dCAPS引物对PCR扩增后经BamHI酶切后的电泳结果图，第1泳道为高蛋白亲本南夏豆25，第2泳道为低蛋白亲本荣县冬豆，3-14泳道分别代表不同的高蛋白F2单株，15-25泳道分别代表不同的低中蛋白含量F2单株。
利用本发明所述的InDel标记和dCAPS标记按本发明方法检测，可准确预测杂交后代的蛋白含量水平，大大提高大豆高蛋白材料的选择效率。
本发明分子标记是基于基因内部的InDel位点和SNP位点开发的，本发明大豆材料筛分方法是通过检测大豆基因组中Gm.SAM基因编码序列第65个碱基后的InDel基因型以及GmBET12基因附近的SNP基因型实现的。利用InDel标记和dCAPS标记进行育种，选择出Gm.SAM基因中的InDel基因型为缺失(160bp)，同时GmBET12基因附近的SNP为C的大豆，即为筛选出的目标，对该目标株系进行育种，即完成所述的提高大豆蛋白含量的分子标记育种。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南充市农业科学院
<120> 筛选大豆材料的分子标记、筛选方法、育种方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 1
aagccttttg agttgtgga 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 2
attgctattt cccttctgc 19
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 3
atgtagaagc aggagcagaa gagggggatc 30
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 4
taaagaagaa ctgctggaa 19

Claims (9)

1.一种筛选高蛋白大豆材料的分子标记引物组，其特征在于，所述分子标记引物组包括InDel标记引物对和dCAPS标记引物对；
所述InDel标记引物对碱基序列如下：
NC_SAM-InDelF：AAGCCTTTTGAGTTGTGGA；
NC_SAM-InDelR：ATTGCTATTTCCCTTCTGC；
所述dCAPS标记引物对碱基序列如下：
NC_BET12dCAPSF：ATGTAGAAGCAGGAGCAGAAGAGGGGGATC；
NC_BET12dCAPSR：TAAAGAAGAACTGCTGGAA；
其中，InDel标记引物扩增条带为160bp，同时dCAPS标记筛选获得的基因型为C的大豆材料为高蛋白大豆材料。
2.一种利用权利要求1所述引物组筛选高蛋白大豆材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.1选择所述InDel标记作为引物对；
S1.2第一PCR扩增 利用所述InDel标记的引物对，选择一个或多个大豆品种DNA进行第一PCR扩增；
S1.3第一电泳检测 将S1.2第一PCR扩增产物进行第一电泳检测，第一电泳检测条带以204bp片段呈现的大豆品种为低蛋白品种，第一电泳检测条带以160bp片段呈现的大豆品种为高蛋白品种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
S2.1选择所述dCAPS标记作为引物对；
S2.2第二PCR扩增 利用所述dCAPS标记的引物对，对S1.2所述大豆品种DNA进行第二PCR扩增；
S2.3酶切 用限制性内切酶BamHI酶切S2.2第二PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；
S2.4第二电泳检测 将S2.3酶切所得片段进行第二电泳检测，第二电泳检测条带以124bp片段呈现的大豆品种为低蛋白品种；第二电泳检测条带以90bp片段呈现的大豆品种为高蛋白品种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增具体操作如下：
第一PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_SAM-InDelF和10μM反向引物NC_SAM-InDelR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第一PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一电泳检测具体操作如下：取6μL第一PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130V，15分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二PCR扩增具体操作如下：
第二PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物NC_BET12dCAPSF和10μM反向引物NC_BET12dCAPSR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第二PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶切的具体操作如下：
酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，第二PCR扩增产物10μL，BamHI限制性内切酶2μL，ddH2O补齐至20μL，37℃酶切反应2h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二电泳检测的具体操作为：
取6μL酶切所得片段在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130V，60分钟。
9.一种权利要求1所述筛选高蛋白大豆材料的分子标记引物组的应用，其特征在于，所述引物组用于筛分大豆高含油量材料或高蛋白材料。
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