CN110004248B

CN110004248B - 芝麻节间长度基因Sidwf1及其SNP标记

Info

Publication number: CN110004248B
Application number: CN201910388525.XA
Authority: CN
Inventors: 张海洋; 苗红梅; 李春; 段迎辉; 魏利斌; 琚铭
Original assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110004248A; WO2020228119A1

Abstract

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个控制芝麻节间长度的基因Sidwf1及其SNP标记。该基因位于芝麻第4条染色体上，属于隐性控制基因，对矮化短节间性状的解释率为100%；该基因长度为1638bp，包含2个外显子和1个内含子，其碱基序列如SEQ ID1所示。通过对该基因及其等位基因SiDWF1/Sidwf1的深入研究，以及利用特定的SNP分子标记SiSNPdwf1，可为芝麻等农作物株高及节间长度等性状调控发育机理研究提供理论基础，同时也可为芝麻的分子辅助育种技术发展、矮化抗倒伏芝麻新品种筛选及新品种培育提供了材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。

Description

芝麻节间长度基因Sidwf1及其SNP标记

技术领域

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个控制芝麻节间长度的基因Sidwf1及其SNP标记。

背景技术

芝麻（Sesame indicum L., 2n=26）是优质特色油料作物，在食品加工中具有重要地位。世界芝麻年种植面积约为800万公顷，年产量约450万吨。印度、苏丹、缅甸和中国是世界芝麻主产国。我国年种植芝麻约为53万公顷，居世界第四位；平均单产为1182公斤/公顷，世界第一位；平均总产量为62万吨，世界第三位（2003-2012，FAO数据）。芝麻属于高杆作物，现有品种多为植株高大、单杆型，不适宜高密度种植，抗倒伏能力差。同时，芝麻植株茎秆过高，也在一定程度上加大了机械化收获的难度。降低植株高度同时提高芝麻产量和机械化适应程度，是近20年来国内外芝麻育种研究工作的重点；选育适于机械化种植与收获的高产稳产新品种已成为当前我国芝麻育种工作的重中之重。在此背景下，自2007年起，发明人积极开展了相关EMS诱变育种和种质创制工作，并于2009年成功创制出了短节间矮化突变体dw607。

该突变体（dw607）在田间表现为：植株单杆，一叶三花，蒴果四棱，节间长度极短，3.8-4.6cm；蒴果排列紧；密始蒴位20cm左右，不受密度影响，株高120-150厘米。在黄淮地区，该品种果节位20个以上，结蒴密。该特性受隐性单基因控制，能稳定遗传，繁殖后代中矮化短节间植株达到98%以上。平均单株结蒴82个；平均蒴粒数61粒，千粒重3.84g，籽粒含油量52.62%，蛋白含量22.28%（2015年海南收获种子）。品种对茎点枯病和枯萎病抗性高；适于密植和机械化管理与收获。

进一步地，利用该突变体选育的短节密蒴型新品种豫芝Dw607，分别于2015年、2016年通过了河南省和安徽省芝麻新品种区试鉴定。2016年，河南省农业科学院分别在新疆精河和河南沈丘开展了豫芝Dw607高产示范和机械化收获现场会，在我国首次应用了芝麻机械化收获技术。目前，该品种已获得新品种权保护（CNA013391E）。

但是需要说明的是，发明人虽然成功诱变培育获得了具有短节间性状的植物新品种，但对于该性状的具体控制基因仍然是缺乏了解的。而如果可以针对性的获得相应的节间长度调控基因，可为芝麻新品种培育、甚至其他植物新品种培育奠定良好的技术基础，因此是具有十分重要的研究价值和应用价值的。

发明内容

本申请中，发明人以现有诱变获得的短节间突变体dw607为材料基础，利用现有的芝麻群体作图、芝麻基因组精细图和重测序等技术，成功克隆了获得了调节芝麻节间长短的节间长度基因Sidwf1（在芝麻基因组注释中，该基因命名为SiGIB1D），并开发设计了针对该基因的SNP位点，可为进一步的芝麻新品种培育甚至其他作物新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

芝麻节间长度基因Sidwf1，该基因位于芝麻第4条染色体上，属于隐性控制基因（相较于正常节间长度表型基因，突变位点位于第1057个碱基上），对矮化短节间性状的解释率为100%（即，该基因控制表现为矮化节间性状）；该基因长度为1638bp，包含2个外显子和1个内含子，其碱基序列如SEQ ID1所示，具体为：

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGGTAATCACGCATATTTTCTTCCTGGGTTCCTCAGAATTCTTGGTTTCTTTGTTTTGCGGTGTGGAATTAGGGTCTTCTCCGATGTGGGTTCCTGAATTTTCTTCGTTTCTTCTCTTAATTTTGGGGTTAATAGTGGGGTTTGTGATGGTTTTCCAAAGAAGATTTTATTTGGAGGAAAGAGTTGTGATTTATGGATAAAGATTGAGTCTTTTGCCTTTGATTTTGAGGGTTTGGGCAGCTGCTTCTCTCTCTCTATATACCTATTTTTGCTATTCGTTCTTTGCCCCCTTTGTTCTCCTCTTTGTTTTTTCTCGCCCAATACTGATTTAGCAGTCCCCATAAACCTGTTTTATGCTTGTTTGTTGGGTTATTTTTAGGTGGTTTCTCCACTTTTCCATTTCCCTTTCTTTTTATAGACTTTCATGTTTTTCTTTTCTTTTCGGCGTTTTCCTTTACAGCTGATTACCTTTACTGGATGTTGATGATACTGATTTGGGATGCATTTGATCAAATTTCATTCTCAATTTCGGTTTATTTTCTATTTTGTGCTGCAATTGATGGATAAGGAAACCATTGGTATATTGAAATTGACTGGCTGTCTTTATGCAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGTCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻节间长度基因Sidwf1所对应的短节间矮化表型cDNA，该cDNA序列长度为1029bp，可编码343个氨基酸；需要注意的是，与野生型（wt）基因（即，正常的长节间性状基因）相比， Sidwf1基因仅在cDNA序列的第448位碱基发生突变，核苷酸由C（wt）突变为T（矮化突变体）；碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGTCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻节间长度基因Sidwf1的等位基因SiDWF1，该基因所对应植株表型为正常型（或者说是长节间表型），碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGGTAATCACGCATATTTTCTTCCTGGGTTCCTCAGAATTCTTGGTTTCTTTGTTTTGCGGTGTGGAATTAGGGTCTTCTCCGATGTGGGTTCCTGAATTTTCTTCGTTTCTTCTCTTAATTTTGGGGTTAATAGTGGGGTTTGTGATGGTTTTCCAAAGAAGATTTTATTTGGAGGAAAGAGTTGTGATTTATGGATAAAGATTGAGTCTTTTGCCTTTGATTTTGAGGGTTTGGGCAGCTGCTTCTCTCTCTCTATATACCTATTTTTGCTATTCGTTCTTTGCCCCCTTTGTTCTCCTCTTTGTTTTTTCTCGCCCAATACTGATTTAGCAGTCCCCATAAACCTGTTTTATGCTTGTTTGTTGGGTTATTTTTAGGTGGTTTCTCCACTTTTCCATTTCCCTTTCTTTTTATAGACTTTCATGTTTTTCTTTTCTTTTCGGCGTTTTCCTTTACAGCTGATTACCTTTACTGGATGTTGATGATACTGATTTGGGATGCATTTGATCAAATTTCATTCTCAATTTCGGTTTATTTTCTATTTTGTGCTGCAATTGATGGATAAGGAAACCATTGGTATATTGAAATTGACTGGCTGTCTTTATGCAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGCCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻节间长度基因Sidwf1的等位基因SiDWF1所对应的正常型（或者说是正常节间表型）cDNA，与突变株（矮化短节间表型）基因序列的唯一不同点在于，正常型基因的cDNA序列中，第448位核苷酸为C；碱基序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGCCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

PCR扩增获得所述芝麻节间长度基因Sidwf1或其等位基因SiDWF1的PCR引物对，具体为：

正向引物DWF1 Primer F：5'- GGGGTGGGGTGAAAGACAA -3'；

反向引物DWF1 Primer R：5'- TCGCCAACACAAATGACAGG -3'。

利用所述PCR引物对制备获得芝麻节间长度基因Sidwf1或其等位基因SiDWF1的PCR扩增方法，包括如下步骤：

（1）提取短节密蒴型新品种豫芝Dw607（新品种权CNA013391E）或正常节间表型的芝麻基因组DNA；

（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，以所述PCR引物对进行PCR扩增。

对芝麻节间长度基因Sidwf1及其等位基因SiDWF1检测用SNP引物组，具体为：

SiSNPdwf1 F1：5'- GTATCTGTGAATTATCGTCGATAGC -3'；

SiSNPdwf1 F2：5'- ATAATGTATCTGTGAATTATCGTCGATAGT -3'；

SiSNPdwf1 R：5' –CTCTCTGATCCTTCCCACTCTG -3'；

其中SiSNPdwf1 F1与SiSNPdwf1 R组合的扩增产物用来检测判定是否含有芝麻节间长度基因Sidwf1的等位基因（正常表型（wt））；SiSNPdwf1 F2与SiSNPdwf1 R组合后的扩增产物用来检测判定是否含有芝麻节间长度基因Sidwf1（矮化突变表型）。

对于所设计的SNP引物组，需要解释的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，设计过程中着重考虑了如下两点情况：

（1）为适应等位基因检测需要，需将SNP引物对设计成3条，并需在特异引物的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；而引入错配的原则为：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的SNP错配碱基形成稳定性互补的错配结构，即强错配型(C／T或G/A)与弱错配型(C/A或G/T)搭配，中等错配型(A/A、C/C、G/G或T/T)与中等错配型搭配；

（2）在含有SNP位点的2个正向或反向引物中，将其中1条引物序列的5’端随机增加5个碱基，其主要目的是为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷地区分开来。

利用所述SNP引物组的芝麻节间长度检测判定方法，包括如下步骤：

（1）提取待测芝麻种质的基因组DNA；

（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，采用三重引物PCR扩增方法或者分别利用SiSNPdwf1 F1与SiSNPdwf1 R组合、SiSNPdwf1 F2与SiSNPdwf1 R组合进行常规PCR扩增；

（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行电泳或者进一步进行测序，结合电泳结果和/或测序结果进行判定，具体判定标准为：

如果扩增产物条带长度仅有121bp一种结果，表明待鉴定种子资源为为显性纯合型，表型为株高和节间正常的wt型；

如果扩增产物条带长度仅有126bp一种结果，表明待鉴定种子资源为隐性纯合型，表型为株高矮化的短节间表型；

如果扩增产物条带产物有121bp和126bp两种结果，表明待鉴定种子资源属于杂合型，表型为株高和节间正常表型。

所述芝麻节间长度基因Sidwf1在植物育种的应用，用于培育矮节间作物新品种。

在现有矮化短节间品种基础上，为确定短节间突变体dw607（dwf1）型和野生型（wt型）的基因序列差异，克隆获得其控制芝麻节间长度的基因，发明人利用已构建的dw607（dw1型）×15N41（wt型）的F6群体，参考芝麻群体作图、芝麻基因组精细图和重测序等技术，最终成功克隆了芝麻节间长度基因Sidwf1，在芝麻基因组注释中，该基因命名为SiGIB1D。基于该基因的克隆和进一步研究，可为下一步探明芝麻株型生长发育调控机理、选育短节密蒴型芝麻新品种、甚至可为其他作物新品种培育奠定坚实基础。总体上，本发明创新点主要体现在以下几个方面：

（1）本发明对短节间型芝麻突变体dw607开展了基因定位，克隆提供了一个芝麻短节间基因Sidwf1，开发了其SNP标记SiSNPdwf1，同时提供了一种鉴定种质资源中是否含有该基因及标记位点的PCR鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速地初步确定待测芝麻品种的株型及节间长度类型，为新品种培育提供参考；

（2）本发明所涉及的短节间基因对芝麻产量、品质及芝麻生产发展等具有重要影响，并对开展芝麻等农作物植株生长发育机理研究以及矮化抗倒伏芝麻新品种筛选、培育适于机械化生产的芝麻新品种具有重要意义；因此，开展该性状基因克隆和SNP标记的开发必将在芝麻分子辅助育种中得到较好地应用；

（3）本发明所提供的芝麻短节间基因Sidwf1及SNP标记SiSNPdwf1的检测方法，技术成熟，检测结果稳定性好，对提高芝麻育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。

总之，本申请所涉及的基因Sidwf1为隐性控制基因，突变位点位于第1057个碱基上，对芝麻矮化短节间性状的解释率为100%。通过对该基因及其等位基因SiDWF1/Sidwf1的深入研究，以及利用特定的SNP分子标记SiSNPdwf1，可为芝麻等农作物株高及节间长度等性状调控发育机理研究提供理论基础，同时也可为芝麻的分子辅助育种技术发展、矮化抗倒伏芝麻新品种筛选及新品种培育提供了材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。

附图说明

图1为本发明涉及的dwf1型短节间芝麻突变体dw607（左侧）及正常株亲本豫芝11号（右侧）田间对照；

图2 为本发明的芝麻矮化短节间基因候选SNP位点在芝麻杂交群体关联分析上的定位；

图3为本发明芝麻短节间基因Sidwf1的基因结构示意图，方框中为外显子，黑色横线为内含子；箭头指示的彩色视图下的红色碱基为Sidwf1基因与正常等位基因SiDWF1的核苷酸序列差异位点；

图4为本发明的芝麻矮化短节间SNP标记SiSNPdwf1的引物对SiSNPdwf1 F1、SiSNPdwf1 F2和反向引物对SiSNPdwf1 R在部分芝麻种质中的PCR扩增结果；

泳道M为DL 2000 marker，显示的条带从上到下分别为250bp和100bp；

泳道1-10为dw607与豫芝11的F_2-3群体材料（短节间矮化型），仅含Sidwf1等位位点1（即dwf1型）；

泳道11-20为dw607与豫芝11的F_2-3群体材料（正常株型）；其中泳道12、13、15、16、17、19和20含有Sidwf1的2个等位位点；泳道11、14、18仅含Sidwf1等位位点1（即dwf1型）；

泳道21-40为20份种质资源（正常株型），仅含Sidwf1等位位点2（即wt型）；

图5为本发明的芝麻矮化短节间SNP标记SiSNPdwf1的引物对在鉴定芝麻种质节间长度类型中的PCR扩增结果；

泳道M为DL 2000 marker，显示的条带从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；

泳道1-10为20份种质资源（正常株型），仅含Sidwf1等位位点2（即wt型）；

泳道11-20为dw607与豫芝11的F_2-3群体材料（正常株型）；其中泳道22、27、和30只含有Sidwf1等位位点2（即wt型）；

泳道21、23、24、25、26、28和29含有Sidwf1等位位点1和2，表现为正常型；

泳道31-40为dw607与豫芝11的F_2-3群体材料（短节间矮化型），仅含Sidwf1等位位点1（即dwf1型）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，首先对本发明中所涉及芝麻种质资源及品种情况简要说明如下。

现有技术中，芝麻品种豫芝11号是我国重要的芝麻育种优异亲本材料；本申请中所采用的芝麻短节间新品种豫芝Dw607，是由河南省农业科学院芝麻研究中心从豫芝11号姊妹系诱变后代中选出的新品种；目前该品种已获得国家新品种权保护（（CNA013391E）；其主要特征为：短节间、耐密植；平均节间长度为3.8-4.6 cm，每叶腋3花，单杆，蒴果四棱，白粒；

下述实施例中所涉及的芝麻资源15N41（主要特征为：节间长度正常，每叶腋单花，分枝，蒴果四棱，黑粒），来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库；实施例中所涉及的豫芝11等其他种质资源，也均来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库；而这些种质材料均可从河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库这一公开渠道或者其他种质资源库等渠道获得。

实施例1

如前所述，在诱变培育获得芝麻短节间新品种豫芝Dw607基础上，为确定其对应的芝麻节间控制基因，发明人对该基因进行了详细的定位分析，具体过程简要介绍如下。

一、节间长度性状遗传背景分析

2012年，发明人首先选用短节间品系dw607与豫芝11号、15N41等节间正常型种质进行正反交组合配置（配置情况如下表1），并对F₁后代进行节间长度性状调查统计。

其中短节间突变体dw607和节间正常型亲本豫芝11号的表型性状对比如图1所示。具体统计结果如下表1所示。

表1，芝麻种质材料配置情况及表型统计结果

表中：χ² _{(0.05, 1)} = 3.84；“*”节间长度低于5.0cm的为短节间类型；节间长度高于5.0cm的为正常节间类型。

结果表明，F₁均为正常株高和节间长度，说明该突变性状受隐性核基因控制。随后，对F₂后代群体在成熟期开展了田间性状调查。数据显示，短节矮化突变体与野生型性状的分离比符合1:3分离比，表明该突变性状受1对隐性基因控制。进一步进行测交后代群体检测的结果显示，突变性状后代分离比例符合1:1分离比，再次表明该突变性状受1对隐性基因控制。

二、芝麻短节间型与正常型亲本的F₂遗传群体构建

2013-2016年间，发明人进一步开展了矮化短节间突变体dw607与15N41的RIL群体构建。并于2016年将上述群体的F₆种子采用营养钵点播，种植于河南省农业科学院芝麻研究中心三亚基地，确保株系数量大于600个。

三、节间长度相关基因Sidwf1定位

（1）F₆群体亲本及113个F₆单株基因组重测序

在上述工作基础上，发明人从F₆群体中随机挑选113个株系，采集113个株系单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，参照魏利斌等（2008）中的改良CTAB法提取各植株DNA（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），采用Illumina测序方法对115份材料进行基因组重测序，测序覆盖度≥30×。

（2）参考豫芝11基因组数据（Zhang et al.，Ultra-dense SNP genetic mapconstruction and identification of SiDt gene controlling the determinategrowth habit in Sesamum indicum L，2016，Science Reports；Zhao et al.，Identification of sesame (Sesamum indicum L.) chromosomes using the BAC‐FISHsystem, 2018, Plant Biology；选用BWA（Burrows- Wheeler Aligner）软件将各株系的测序数据进行比对拼接。

（3）在终花期，对F₆群体113个株系及2个亲本进行节间长度测定，判定长度类型。

结合上述群体数据，采用Tassele 5.0软件，确定了与芝麻节间长度性状紧密关联的变体P值，结果参见图2。

结果显示，与目标性状紧密连锁的最小P值位于第4染色体。对上下游200kb的变体进行统计分析。进一步分析发现，此区间内共包含了58个SNP/InDel多态位点，P值范围为9.08E-05 ~ 2.59E-15。

随后用824份芝麻种质的变体数据库进行变体筛选，结果显示，剩余变体共有12个（图2中彩色视图下的绿点）。

随后用dw607×豫芝11 F_2-3 群体的两个混合池变体数据对上述变体继续进行筛选过滤。结果显示，仅C9_6989486位点与短节间矮化性状紧密连锁（具体结果如下表2所示）。

表2，与短节间性状紧密关联的变体信息

。

实施例2

在实施例1定位基础上，发明人进一步对所定位的节间长度基因进行了克隆和测序分析，具体过程简要介绍如下。

根据上述实施例1中获得的变体位点，利用豫芝11号基因组数据，分析确定了C9_6989486位点为目标SNP位点，将其所在的基因C9.scaffold2.572被命名为Sidwf1。序列分析发现，该基因在芝麻基因组（豫芝11号）被注释为SiGIB1D基因。

随后，根据基因组数据，利用Primer premier 5.0软件设计了PCR扩增用引物对，以便扩增获得该芝麻节间长度基因Sidwf1。

所设计的引物具体序列为：

SiDWF1 F：5'-GGGGTGGGGTGAAAGACAA-3；

SiDWF1 R：5'- TCGCCAACACAAATGACAGG-3'。

进一步地，以dw607的DNA为模板（提取方式参考实施例1），利用上述引物对进行PCR扩增。

PCR反应在PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪上进行，反应程序参考设计为：94℃预变性3分钟；之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；最后72℃延伸5分钟；4℃保存。

回收扩增产物并进行测序（由天津基因芯片生物公司完成）。结果显示，该基因Sidwf1的基因组全长序列为1638bp，共包含2个外显子和1个内含子，序列如SEQ ID.1所示。

进一步地，利用上述引物对以正常节间表型的豫芝11号基因组DNA为模板进行了扩增，并对扩增产物进行了测序。正常节间表型的SiDWF1基因序列如SEQ ID.3所示。

将矮化节间Sidwf1基因及其正常节间表型的等位基因SiDWF1进行序列比对，示意图如图3所示。详细对比分析可以看出：

在正常型和短节间矮化型种质基因组中，Sidwf1序列的差异仅在于基因序列第1057位碱基是否发生了C/T突变；当第1057位的碱基C就突变为了碱基T，导致编码蛋白的第150个氨基酸序列由脯氨酸(P)突变为了丝氨酸(S) ，节间长度类型则由正常型突变为dwf1短节间型。

实施例3

在实施例2结果基础上，为进一步确认Sidwf1基因即是调控芝麻节间长度类型的基因，发明人设计了SNP引物组，并选用了600份种质资源和1个组合F₂群体进行了验证。具体过程简要介绍如下。

首先，所设计的SNP引物组具体如下：

正向引物SiSNPdwf1 F1序列：5'- GTATCTGTGAATTATCGTCGATAGC -3'；

正向引物SiSNPdwf1 F2序列：5'- ATAATGTATCTGTGAATTATCGTCGATAGT -3'；

反向引物SiSNPdwf1 R序列：5' –CTCTCTGATCCTTCCCACTCTG -3'。

需要解释的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，设计引物时至少需考虑如下两个方面：

（1）将SNP引物对设计成3条，并需在特异引物的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；引入错配的原则为：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的SNP错配碱基形成稳定性互补的错配结构；即强错配型(C／T或G／A)与弱错配型(C／A或G／T)搭配，中等错配型(A／A、C／C、G／G或T／T)与中等错配型搭配；

然后，随机从dw607与豫芝11号的F_2-3群体中挑选600个单株，田间调查各单株的节间长度类型；同时采集600个单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，提取其基因组DNA（参考实施例1，采用改良CTAB法提取）。

以所提取的基因组DNA为模板，分别利用上述SNP引物组中不同引物对组合（即，分别以引物对SiSNPdwf1 F1+SiSNPdwf1 R或者SiSNPdwf1 F2+SiSNPdwf1 R为引物对）进行PCR扩增；PCR扩增时，10 µL反应体系参考设置如下：

模板DNA (50ng/µL)，1.0µL；

10×PCR Buffer (Mg²⁺)，1.0µL；

Taqase酶 (5U/µL)，0.2µL；

dNTP (10mmol/L)，0.2µL；

Forward Primer 1 (10µM)，0.5µL；

Forward specific Primer 2 (10µM)，0.5µL；

Reverse Primer (10µM)，1.0µL；

加入超纯水5.6µL。

PCR反应在PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3分钟，之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟，4℃，保存。

对步骤（4）中PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶浓度为8~10%，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒压交流电电泳1.5~2小时。

电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。

部分电泳图谱如图4所示。分析可以看出，表现为短节间的植株，其扩增结果为126bp条带；节间长度正常的亲本扩增结果为121bp条带；杂合型植株扩增出121bp和126bp条带，性状表现为正常型。

综上，我们可以认为该Sidwf1基因是引起芝麻节间长度发生突变的基因，该基因可用于芝麻等作物株高及节间长度性状调控机理研究。

实施例4

在实施例3基础上，以鉴定是否为短节间型优异材料为例，发明人进行了进一步的实验验证。具体过程简要介绍如下。

为快速鉴定出短节间型育种材料，首先从dw607与豫芝11的杂交后代中随机挑选样本100份，从种质资源库中随机选取样本100份进行培育（对于样品材料分别于花期调查确定株高及节间长度类型）。

对200个单株个体提取基因组DNA，利用实施例3中所设计的SNP引物组进行PCR检测，从而评价SNP标记的可靠性。

需要解释的是，PCR扩增过程中，以正向引物1和反向引物扩增的PCR产物大小为121bp；以正向引物2和反向引物扩增的PCR产物大小为126bp。

对PCR扩增产物进行电泳，部分电泳图谱如图5所示。

从前述SiSNPdwf1位点筛选过程我们可以知晓，理论上具有SiSNPdwf1等位位点1（条带大小121bp，即本申请SiSNPdwf1位点）的植株应该表现为节间长度正常；具有SiSNPdwf1等位位点2（条带大小126bp，即SiSNPdwf1位点中的碱基C变为T时位点）的植株应该表现为短节间。具有SiSNPdwf1等位位点1、2（条带大小121bp和126bp，）的植株为杂合体，应该表现为节间长度正常。

检测结果显示，在有SiSNPdwf1等位位点1（条带大小121bp）的植株中，均为正常型，可靠度为100%；在仅有SiSNPdwf1等位位点2（条带大小126bp）的植株中，均为短节间，可靠度为100%。在有SiSNPdwf1等位位点1和2（条带大小为121bp、126bp）的杂合植株中，表型均为节间长度正常，可靠度100%。

综上，我们可以认为该SNP标记即为芝麻短节间基因SNP位点标记，可以用于预测芝麻品种的株高和节间长度类型，用于芝麻分子标记辅助育种和矮化短节间型芝麻新品种的选育。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心

<120> 芝麻节间长度基因Sidwf1及其SNP标记

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 1

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaagg taatcacgca tattttcttc 60

ctgggttcct cagaattctt ggtttctttg ttttgcggtg tggaattagg gtcttctccg 120

atgtgggttc ctgaattttc ttcgtttctt ctcttaattt tggggttaat agtggggttt 180

gtgatggttt tccaaagaag attttatttg gaggaaagag ttgtgattta tggataaaga 240

ttgagtcttt tgcctttgat tttgagggtt tgggcagctg cttctctctc tctatatacc 300

tatttttgct attcgttctt tgcccccttt gttctcctct ttgttttttc tcgcccaata 360

ctgatttagc agtccccata aacctgtttt atgcttgttt gttgggttat ttttaggtgg 420

tttctccact tttccatttc cctttctttt tatagacttt catgtttttc ttttcttttc 480

ggcgttttcc tttacagctg attaccttta ctggatgttg atgatactga tttgggatgc 540

atttgatcaa atttcattct caatttcggt ttattttcta ttttgtgctg caattgatgg 600

ataaggaaac cattggtata ttgaaattga ctggctgtct ttatgcagag ggtggttcca 660

cttaatacat ggatccttat atccaacttc aagcttgctt acaacatgct tcggcggcct 720

gatggtacat ttaatcggga attgaacgag tttcttgacc ggaaagtgac tgcaaatgct 780

aatccagtag atggggttta ctcctttgat gttgtagatc gtgccacgag cctgcttaac 840

cgggtttatt tgaccgccca cgagaatgag cctcaacggg ggatcgtaga agtggaaaag 900

cccttgagta ccactgagat tgtgcctgtg attatattct tccacggtgg aagctttgtt 960

cattcctcag ccaacagtgc tatctatgac acgctctgtc gtcgcctcgt taatacttgc 1020

aaggcagcag ttgtatctgt gaattatcgt cgatcgtcag agcaccggta cccgtgtgcg 1080

tatgatgatg gatggaccgc tcttaattgg gttaactcga gatcatggct tcagagtggg 1140

aaggatcaga gagttcatat atatttggca ggcgatagtt ctggtggtaa tattgcgcat 1200

catgttgctg ttcgagctgc ggaggagggg gtcgaagtat tgggcaatat tcttcttcat 1260

cctttgtttg gtgggcagga gaggacagaa tctgagaaaa aattggatgg gaaatacttt 1320

gtaaggattc aagatagaga ttggtactgg agagcgtatt taccagaagg agaagatagg 1380

gaccatcctg cgtgtaatgt gtttggcccc aggagtagaa gcctcgaggg actaaaattt 1440

ccaaaaagcc ttgttgttgt ggctggatta gatcttcttc aggattggca attgcgttat 1500

gttgaagggc taaagaaatc agggcaagaa gtgaaactcc tttatctcga aaaggcaaca 1560

attgggttct atttcttgcc gaacaatgat catttccagt ccctgatgga tgagatgaaa 1620

agcttcatcc acccttaa 1638

<210> 2

<211> 1029

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 2

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaaga gggtggttcc acttaataca 60

tggatcctta tatccaactt caagcttgct tacaacatgc ttcggcggcc tgatggtaca 120

tttaatcggg aattgaacga gtttcttgac cggaaagtga ctgcaaatgc taatccagta 180

gatggggttt actcctttga tgttgtagat cgtgccacga gcctgcttaa ccgggtttat 240

ttgaccgccc acgagaatga gcctcaacgg gggatcgtag aagtggaaaa gcccttgagt 300

accactgaga ttgtgcctgt gattatattc ttccacggtg gaagctttgt tcattcctca 360

gccaacagtg ctatctatga cacgctctgt cgtcgcctcg ttaatacttg caaggcagca 420

gttgtatctg tgaattatcg tcgatcgtca gagcaccggt acccgtgtgc gtatgatgat 480

ggatggaccg ctcttaattg ggttaactcg agatcatggc ttcagagtgg gaaggatcag 540

agagttcata tatatttggc aggcgatagt tctggtggta atattgcgca tcatgttgct 600

gttcgagctg cggaggaggg ggtcgaagta ttgggcaata ttcttcttca tcctttgttt 660

ggtgggcagg agaggacaga atctgagaaa aaattggatg ggaaatactt tgtaaggatt 720

caagatagag attggtactg gagagcgtat ttaccagaag gagaagatag ggaccatcct 780

gcgtgtaatg tgtttggccc caggagtaga agcctcgagg gactaaaatt tccaaaaagc 840

cttgttgttg tggctggatt agatcttctt caggattggc aattgcgtta tgttgaaggg 900

ctaaagaaat cagggcaaga agtgaaactc ctttatctcg aaaaggcaac aattgggttc 960

tatttcttgc cgaacaatga tcatttccag tccctgatgg atgagatgaa aagcttcatc 1020

cacccttaa 1029

<210> 3

<211> 1638

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 3

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaagg taatcacgca tattttcttc 60

ctgggttcct cagaattctt ggtttctttg ttttgcggtg tggaattagg gtcttctccg 120

atgtgggttc ctgaattttc ttcgtttctt ctcttaattt tggggttaat agtggggttt 180

gtgatggttt tccaaagaag attttatttg gaggaaagag ttgtgattta tggataaaga 240

ttgagtcttt tgcctttgat tttgagggtt tgggcagctg cttctctctc tctatatacc 300

tatttttgct attcgttctt tgcccccttt gttctcctct ttgttttttc tcgcccaata 360

ctgatttagc agtccccata aacctgtttt atgcttgttt gttgggttat ttttaggtgg 420

tttctccact tttccatttc cctttctttt tatagacttt catgtttttc ttttcttttc 480

ggcgttttcc tttacagctg attaccttta ctggatgttg atgatactga tttgggatgc 540

atttgatcaa atttcattct caatttcggt ttattttcta ttttgtgctg caattgatgg 600

ataaggaaac cattggtata ttgaaattga ctggctgtct ttatgcagag ggtggttcca 660

cttaatacat ggatccttat atccaacttc aagcttgctt acaacatgct tcggcggcct 720

gatggtacat ttaatcggga attgaacgag tttcttgacc ggaaagtgac tgcaaatgct 780

aatccagtag atggggttta ctcctttgat gttgtagatc gtgccacgag cctgcttaac 840

cgggtttatt tgaccgccca cgagaatgag cctcaacggg ggatcgtaga agtggaaaag 900

cccttgagta ccactgagat tgtgcctgtg attatattct tccacggtgg aagctttgtt 960

cattcctcag ccaacagtgc tatctatgac acgctctgtc gtcgcctcgt taatacttgc 1020

aaggcagcag ttgtatctgt gaattatcgt cgatcgccag agcaccggta cccgtgtgcg 1080

tatgatgatg gatggaccgc tcttaattgg gttaactcga gatcatggct tcagagtggg 1140

aaggatcaga gagttcatat atatttggca ggcgatagtt ctggtggtaa tattgcgcat 1200

catgttgctg ttcgagctgc ggaggagggg gtcgaagtat tgggcaatat tcttcttcat 1260

cctttgtttg gtgggcagga gaggacagaa tctgagaaaa aattggatgg gaaatacttt 1320

gtaaggattc aagatagaga ttggtactgg agagcgtatt taccagaagg agaagatagg 1380

gaccatcctg cgtgtaatgt gtttggcccc aggagtagaa gcctcgaggg actaaaattt 1440

ccaaaaagcc ttgttgttgt ggctggatta gatcttcttc aggattggca attgcgttat 1500

gttgaagggc taaagaaatc agggcaagaa gtgaaactcc tttatctcga aaaggcaaca 1560

attgggttct atttcttgcc gaacaatgat catttccagt ccctgatgga tgagatgaaa 1620

agcttcatcc acccttaa 1638

<210> 4

<211> 1029

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 4

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaaga gggtggttcc acttaataca 60

tggatcctta tatccaactt caagcttgct tacaacatgc ttcggcggcc tgatggtaca 120

tttaatcggg aattgaacga gtttcttgac cggaaagtga ctgcaaatgc taatccagta 180

gatggggttt actcctttga tgttgtagat cgtgccacga gcctgcttaa ccgggtttat 240

ttgaccgccc acgagaatga gcctcaacgg gggatcgtag aagtggaaaa gcccttgagt 300

accactgaga ttgtgcctgt gattatattc ttccacggtg gaagctttgt tcattcctca 360

gccaacagtg ctatctatga cacgctctgt cgtcgcctcg ttaatacttg caaggcagca 420

gttgtatctg tgaattatcg tcgatcgcca gagcaccggt acccgtgtgc gtatgatgat 480

ggatggaccg ctcttaattg ggttaactcg agatcatggc ttcagagtgg gaaggatcag 540

agagttcata tatatttggc aggcgatagt tctggtggta atattgcgca tcatgttgct 600

gttcgagctg cggaggaggg ggtcgaagta ttgggcaata ttcttcttca tcctttgttt 660

ggtgggcagg agaggacaga atctgagaaa aaattggatg ggaaatactt tgtaaggatt 720

caagatagag attggtactg gagagcgtat ttaccagaag gagaagatag ggaccatcct 780

gcgtgtaatg tgtttggccc caggagtaga agcctcgagg gactaaaatt tccaaaaagc 840

cttgttgttg tggctggatt agatcttctt caggattggc aattgcgtta tgttgaaggg 900

ctaaagaaat cagggcaaga agtgaaactc ctttatctcg aaaaggcaac aattgggttc 960

tatttcttgc cgaacaatga tcatttccag tccctgatgg atgagatgaa aagcttcatc 1020

cacccttaa 1029

Claims

1.芝麻节间长度基因Sidwf1，其特征在于，该基因位于芝麻第4条染色体上，属于隐性控制基因，对矮化短节间性状的解释率为100%；该基因长度为1638bp，包含2个外显子和1个内含子，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述芝麻节间长度基因Sidwf1所对应的短节间矮化表型cDNA，其特征在于，该cDNA序列长度为1029bp；碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3.对权利要求1所述芝麻节间长度基因Sidwf1或其等位基因SiDWF1检测用SNP引物组，其特征在于，具体为：

SiSNPdwf1 F1：5'- GTATCTGTGAATTATCGTCGATAGC -3'；

SiSNPdwf1 F2：5'- ATAATGTATCTGTGAATTATCGTCGATAGT -3'；

SiSNPdwf1 R：5' –CTCTCTGATCCTTCCCACTCTG -3'；

所述等位基因SiDWF1，碱基序列如SEQ ID No.3所示。

4.利用权利要求3所述SNP引物组检测判定芝麻节间表型的检测判定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测芝麻种质的基因组DNA；

（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，采用三重引物PCR扩增方法或者分别利用SiSNPdwf1 F1与SiSNPdwf1 R组合、SiSNPdwf1 F2与SiSNPdwf1 R组合进行PCR扩增；

（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行电泳或者进行测序，结合电泳结果和/或测序结果进行判定，具体判定标准为：

如果扩增产物条带长度仅有121bp一种结果，表明待鉴定种子资源为显性纯合型，表型为株高和节间正常型；

如果扩增产物条带长度仅有126bp一种结果，表明待鉴定种子资源为隐性纯合型，表型为株高矮化短节间表型；

如果扩增产物条带产物有121bp和126bp两种结果，表明待鉴定种子资源属于杂合型，表型为株高和节间正常型。

5.权利要求1所述芝麻节间长度基因Sidwf1在植物育种的应用，其特征在于，用于培育矮节间作物新品种。