CN116875633B - 雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用 - Google Patents

雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用，ZmSWEET6包括2个旁系同源基因，分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码的蛋白质具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中同时定点突变ZmSWEET6的旁系同源基因，创制了sweet6a/6b突变体，导致完全雄性不育，发现了ZmSWEET6基因对玉米雄性生殖发育的调控功能。本发明还针对获得的sweet6a/6b雄性不育突变体设计了功能分子标记，通过分子标记辅助选择筛选创制出稳定的玉米雄性不育系，对玉米雄性育性控制和杂交种子生产具有重要意义。

Description

雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用
技术领域
本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用。
背景技术
随着人口的快速增长和全球经济的高速发展，人们对食品、饲料、纤维和燃料的需求大幅度增加。近年来，由于城市化和土地退化，用于农业生产的土地面积逐年减少。因此，在有限耕地的条件下，提高粮食单位面积的产量尤为重要。研究表明，杂种优势的利用，是增加作物抗逆性、提高产量和品质的重要手段之一。杂交种的选育，在很大程度上为解决世界粮食安全问题提供保障，但是，在农业生产中，作物杂种优势的发挥受制于制种纯度的影响。在常规杂交种制种过程中，需要有去雄的环节，消耗大量的人力、物力和财力，制种成本高，并且存在去雄不彻底的现象，导致制种纯度降低。利用作物雄性不育系制种，既可以节省人工去雄消耗的人力物力，又能够提高种子纯度，从而更大程度的保持作物的杂种优势。因此，植物雄性不育系的应用，将在作物杂种优势的利用、提高作物产量等方面发挥重要作用。
玉米是雌雄同株异花植物，是研究杂种优势利用最理想的作物之一，植物雄性不育是指植物花药不能正常开裂或产生的花粉和雄配子无活力的现象，雄性不育系是作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料。在自然界中，植物雄性不育现象表现为多种形式，研究人员根据不育表型和基因型进行了不同的分类。根据表型不同，可以将雄性不育分为结构性、孢子性和功能性雄性不育。结构性雄性不育是由于雄性器官异常而引起；孢子性雄性不育表现为小孢子发生过程异常；功能性雄性不育指植株产生无活力的花粉，表现为花粉成熟异常，花粉粒不能在柱头上萌发，或者花粉管不能到达胚珠。根据基因型，植物雄性不育可分为表型受核基因控制且符合孟德尔遗传定律的细胞核雄性不育（Genic malesterility，GMS）以及受细胞核和细胞质基因协同调控的细胞质雄性不育（Cytoplasmicmale sterility，CMS）。研究表明，CMS系可能存在遗传多样性差、潜在病害的易感性增加以及育性恢复不稳定等问题，利用GMS系可以克服这些缺点。因此，在生产应用中，创制更多的GMS系并克隆相应的GMS基因尤为重要。近年来，随着生物技术的进步，通过基因工程和分子设计育种相结合创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，可以有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题。实现上述技术应用的重要前提是获得大量功能明确的控制玉米雄性发育的GMS基因和对应的雄性不育材料。
与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，玉米中已克隆和鉴定的GMS基因和创制的雄性不育材料均相对较少。CRISPR/Cas9（Clustered, Regularly Interspaced, ShortPalindromicRepeats-associated Endonuclease 9）基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定玉米雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富玉米GMS基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用，可以用来创制玉米雄性不育系，从而应用于玉米杂交育种和制种。
为实现上述目的，本发明提供了ZmSWEET6基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述基因包括两个旁系同源基因ZmSWEET6A和ZmSWEET6B，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。一般可以预见这些来自不同植物或不同玉米材料中的同源基因具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些基因的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具有控制植物雄性育性的功能。
在另一方面，本发明还提供了一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制玉米中ZmSWEET6基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株。
在一些实施方案中，上述抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。
在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9方法包括：在ZmSWEET6A基因第三外显子和第四外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点（MT1和MT2），所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；在ZmSWEET6B基因第三外显子处设计两个CRISPR/Cas9载体靶点（MT3和MT4），所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
在另一方面，本发明还提供一种获得sweet6a/6b雄性不育系的方法，将通过上述方法获得的sweet6a/6b雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标
材料获得sweet6a/6b雄性不育的性状和基因突变。
本发明还包括通过上述任一方法获得的sweet6a/6b雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。所述在杂交育种和制种中的应用是指将sweet6a/6b雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交，或是将获得的sweet6a/6b雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得sweet6a/6b雄性不育的性状和基因突变。
更进一步地，本发明还提供了四种针对玉米雄性不育系sweet6a/6b的分子标记引物。引物ZmSWEET6A-F1和ZmSWEET6A-R1序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；引物ZmSWEET6B-F1和ZmSWEET6B-R1序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；引物ZmSWEET6A-F2和ZmSWEET6A-R2序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；引物ZmSWEET6B-F2和ZmSWEET6B-R2序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
本发明的优点及有益效果如下：ZmSWEET6（ZmSWEET6A:Zm00001d044421; ZmSWEET6B:Zm00001d011299）基因及其编码的蛋白调控玉米雄性生殖发育是之前没有报道过的。本发明通过利用CRISPR/Cas9方法同时突变玉米基因ZmSWEET6A（Zm00001d044421）基因和ZmSWEET6B（Zm00001d011299），发现了只有ZmSWEET6两个旁系同源基因同时突变才能造成玉米雄性不育，而单突则对玉米花药和花粉发育无影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后获得的sweet6a/6b雄性不育突变体，可以创制玉米雄性不育系，从而可以应用于玉米杂交育种和制种。针对sweet6a/6b雄性不育系开发共分离分子标记，可用于植株的育性基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
附图说明
图1为ZmSWEET6A和ZmSWEET6B基因在玉米不同发育时期花药中的表达模式分析
S5，造孢细胞时期；S6, 小孢子母细胞时期；S7，减数分裂开始时期；S8a，减数分裂Ⅰ，二分体时期；S8b，减数分裂Ⅱ，四分体时期；S8b-9，四分体-单核小孢子时期；S9，单核小孢子时期；S9-10，单核小孢子-小孢子空泡化时期；S10，小孢子空泡化时期；S11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；S12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期。
图2为pCas9-ZmSWEET6定点突变表达载体的物理图谱
pCas9-ZmSWEET6A：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因
Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmSWEET6A基因靶标2（MT2）的表达盒；ZmSWEET6A基因靶标1（MT1）的表达盒。
pCas9-ZmSWEET6B：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因
Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmSWEET6B基因靶标2（MT4）的表达盒；ZmSWEET6B基因靶标1（MT3）的表达盒。
图3为野生型ZmSWEET6与其突变体的基因结构和DNA序列分析
野生型ZmSWEET6A（WT- ZmSWEET6A）：基因全长2656 bp，包括6个外显子和5个内含子；野生型ZmSWEET6B（WT- ZmSWEET6B）：基因全长2471 bp，包括6个外显子和5个内含子。sweet6a/6b双突变体ZmSWEET6A/6B-Cas9-1：在ZmSWEET6A第4个外显子838 bp-839 bp之间缺失2个碱基（AT）；在ZmSWEET6B第3个外显子402 bp-527 bp之间缺失126个碱基。sweet6a/ 6b双突变体ZmSWEET6A/6B-Cas9-2：在ZmSWEET6A第3个外显子417 bp处缺失1个碱基（C）；在ZmSWEET6B第3个外显子389 bp处缺失1个碱基（A）和528 bp-530bp之间缺失3个碱基（CTC）。
图4为野生型与ZmSWEET6A/6B-Cas9-1的雄穗、花药和花粉粒表型分析
上排为玉米野生型（WT）与ZmSWEET6A-Cas9-1、ZmSWEET6B-Cas9-1单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-1双突变体雄穗的表型比较；第二排为WT与ZmSWEET6A-Cas9-1、ZmSWEET6B-Cas9-1单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-1双突变体花药的表型比较；下排为WT与ZmSWEET6A-Cas9-1、ZmSWEET6B-Cas9-1单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-1双突变体花粉粒的I2-KI染色比较。
图5为野生型与ZmSWEET6A/6B-Cas9-2的雄穗、花药和花粉粒表型分析
上排为玉米野生型（WT）与ZmSWEET6A-Cas9-2、ZmSWEET6B-Cas9-2单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2双突变体雄穗的表型比较；第二排为WT与ZmSWEET6A-Cas9-2、ZmSWEET6B-Cas9-2单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2双突变体花药的表型比较；下排为WT与ZmSWEET6A-Cas9-2、ZmSWEET6B-Cas9-2单突变体和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2双突变体花粉粒的I2-KI染色比较。
图6为野生型与sweet6a/6b纯合突变体的花药扫描电镜（SEM）分析
从左至右依次为：野生型（WT）花药整体；sweet6a/6b花药整体；剥开后的WT（上）和sweet6a/6b（下）花药；WT的成熟花粉粒（上）和sweet6a/6b无法扫描到花粉粒（下）；WT（上）和sweet6a/6b（下）花药的外表皮角质层；WT（上）和sweet6a/6b（下）花药的内表皮乌氏体。
图7为利用共分离标记对ZmSWEET6A/6B-Cas9-1不育系的F2代植株进行ZmSWEET6A的基因分型
共分离标记ZmSWEET6A-F1/R1对7株ZmSWEET6A/6B-Cas9-1不育系F2代植株中ZmSWEET6A基因的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型SWEET6A/ SWEET6A（AA）植株中扩增出74 bp条带；在SWEET6A/sweet6a杂合型（Aa）植株中扩增出74 bp和72 bp两条带；在sweet6a/sweet6a纯合突变型（aa）植株中扩增出72 bp的条带。
图8为利用共分离标记对ZmSWEET6A/6B-Cas9-1不育系的F2代植株进行ZmSWEET6B的基因分型
共分离标记ZmSWEET6B-F1/R1对8株ZmSWEET6A/6B-Cas9-1不育系F2代植株中ZmSWEET6B基因的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型SWEET6B/SWEET6B（BB）植株中扩增出573 bp条带；在SWEET6B/sweet6b杂合型（Bb）植株中扩增出573 bp和447 bp两条带；在sweet6b/sweet6b纯合突变型（bb）植株中扩增出447 bp的条带。
图9为利用共分离标记对ZmSWEET6A/6B-Cas9-2不育系的F2代植株进行ZmSWEET6A的基因分型
共分离标记ZmSWEET6A-F2/R2对5株ZmSWEET6A/6B-Cas9-2不育系F2代植株中ZmSWEET6A基因的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型SWEET6A/ SWEET6A（AA）植株中扩增出120 bp条带；在SWEET6A/sweet6a杂合型（Aa）植株中扩增出120bp和119 bp两条带；在sweet6a/sweet6a纯合突变型（aa）植株中扩增出119 bp的条带。
图10为利用共分离标记对ZmSWEET6A/6B-Cas9-2不育系的F2代植株进行ZmSWEET6B的基因分型
共分离标记ZmSWEET6B-F2/R2对11株ZmSWEET6A/6B-Cas9-2不育系F2代植株中ZmSWEET6B基因的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型SWEET6B/ SWEET6B（BB）植株中扩增出90 bp条带；在SWEET6B/sweet6b杂合型（Bb）植株中扩增出90 bp和87 bp两条带；在
sweet6b/sweet6b纯合突变型（bb）植株中扩增出87 bp的条带。
实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由北京睿博兴科生物技术有限公司份完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一 玉米ZmSWEET6（Zm00001d044421和Zm00001d011299）基因序列和表达模式分析
在maizeGDB 库（https://www.maizegdb.org/）中，查询到玉米SWEET6有2个旁系同源基因，分别为SWEET6A（Zm00001d044421，GRMZM2G157675）和SWEET6B（Zm00001d011299， GRMZM2G416965），在B73中的核酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SWEET6A（Zm00001d044421）基因功能注释为糖转运蛋白SWEET6A（sugars will eventually beexported transporter 6A，SWEET6A)，其编码蛋白包含244个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示；SWEET6B（Zm00001d011299）基因功能注释为糖转运蛋白SWEET6B（sugars willeventually be exported transporter 6B，SWEET6B)，其编码蛋白包含243个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示
ZmSWEET6是糖转运蛋白，在改善植物中源库关系、提高作物产量等方面具有重要意义。但其在玉米中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系以及快速创制雄性不育系，本发明首先利用qRT-PCR分析了该基因在玉米花药发育不同阶段的表达模式，具体步骤如下。
1、玉米花药的取样与发育时期鉴定
从玉米自交系B73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。
利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。
2、qRT-PCR分析用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix （ABM，加拿大）合成cDNA；采用TB Green™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5 QuantStudio5 Real-Time PCR System （ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，ZmSWEET6A的扩增引物为：qSWEET6A-F（5’- GTCGCTGGTGAGCTTCCTCAA-3’）和qSWEET6A-R（5’-TGACGTAGAGGTCGAAGCGG-3’），ZmSWEET6B的扩增引物为：qSWEET6B-F（5’-TTGGCGCCTTCTTCGGTCTC-3’）和qSWEET6B-R（5’- GGTGGGCAGCTCCACATTCTT-3’）；ZmCynase为参照基因，其扩增引物为：Cynas-F（5’- GCTGGTGAGGAGGAGAAACA-3’）和Cynas-R（5’-CAGCAATCATGCCAGGTAGA-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2-ΔΔCt方法进行分析，并以均值±标准差（Means±SD）的形式给出定量结果。
ZmSWEET6A基因和ZmSWEET6B基因在花药发育的不同时期的表达模式为：ZmSWEET6A在玉米花药发育的前期（S5）和后期（S10-S12）有较高表达，而在花药发育的中期维持在低水平的表达（图1）。ZmSWEET6B的表达模式与ZmSWEET6A一致（图1）。
实施例二 玉米ZmSWEET6基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法创制玉米雄性不育系
为了明确玉米ZmSWEET6A（Zm00001d044421）和ZmSWEET6B（Zm00001d011299 ）基因在玉米中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法突变Zm00001d044421和Zm00001d011299基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米杂交种HiII作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因保守区的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域。
1、ZmSWEET6的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为pBUE411-MT1T2-Cas9，该载体的基础载体为pBUE411- Cas9，中间载体为pCBCmT1T2，提供gRNA。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过酶切连接到基础载体中，具体的构建流程如下。
（1）靶标gRNA的设计。将ZmSWEET6（Zm00001d044421和Zm00001d011299）的基因序列输入 http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR进行靶标设计。本发明选择的四个靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。本发明的sgRNA骨架序列从中间载体pCBCmT1T2直接扩增获得。
（2）通过在引物上设计靶点然后PCR扩增获得MT-sgRNA。引物ZmSWEET6-MT1-F和引物ZmSWEET6-MT2-R扩增中间载体pCBCmT1T2，用于获得包含第一个和第二个靶标的sgRNA的片段，同样的步骤使用引物产物ZmSWEET6-MT3-F和引物ZmSWEET6-MT4-R用于扩增获得包含第三个和第四个靶标的sgRNA的片段，长度均为891 bp。PCR 体系和条件如下：模板DNA （中间载体pCBCmT1T2≥30 ng/μL）1.2 μL；Primer F/R：各1.2 μL；灭菌ddH2O：11.4 μL；2XMCLAB 酶（产品编号：I5HMb00）：15 μL。PCR的温度程序如下：① 98 ℃ 2分钟；② 98 ℃ 10秒；③ 58 ℃ 30秒；④ 72 ℃ 30秒；⑤ 从②－④循环34次；⑥ 72 ℃ 5分钟；⑦ 25 ℃ 10分钟。最后回收PCR产物。载体构建所需的引物序列如下：
ZmSWEET6-MT1-F:5’-ATATATGGTCTCTGGCGAGAGCAGCGTCGCCAGGTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA -3’；
ZmSWEET6-MT2-R:5’-ATTATTGGTCTCTAAACGCCTCACCACTCACTATCATGCTTCTTGGTGCCGC-3’；
ZmSWEET6-MT3-F:5’-ATATATGGTCTCTGGCGAGAGCAGCGTCGCCAGGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA -3’；
ZmSWEET6-MT4-R:5’-ATTATTGGTCTCTAAACTTTCGGGCCATCAGAGTAATGCTTCTTGGTGCCGC-3’。
（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将pBUE411-Cas9载体和回收的带有靶标的sgRNA片段用BsaI消化，同时加入T4连接酶将载体和sgRNA片段连接。15 μL的酶切连接体系如下，sgRNA片段：2 μL，pBUE411-Cas9载体（≥60 ng/μL) ：2 μL，10 x NEB Buffer：1.5 μL，BsaI内切酶（产品编号：#R3733S ）：1 μL，T4 连接酶（产品编号：#M0202M ）：1 μL，灭菌ddH2O：6 μL。
图2所示为目的基因ZmSWEET6A（Zm00001d044421）的靶标（MT1和MT2）, 标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411-Cas9构建的表达载体pCas9-ZmSWEET6A；以及目的基因ZmSWEET6B（Zm00001d011299）的靶标（MT3和MT4），标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411- Cas9构建的表达载体pCas9-ZmSWEET6B。
2、农杆菌介导的玉米遗传转化
将上述构建的pCas9-ZmSWEET6A和pCas9-ZmSWEET6B载体通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定；然后以1：1的浓度混合分别含有两种敲除载体的农杆菌，混合后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的玉米杂交种Hi II的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43 ℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0 mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23 ℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28 ℃培养7a4天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2 mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28 ℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28 ℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3、T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测
为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：
本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2 mL离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入700 μL CTAB提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1b次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入700 μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4 ℃条件下，以12000 rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5 mL离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10 min左右；随后将盛有样品的离心管放入4 ℃离心机中，以12000 rpm速度离心10 min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800 μL 75%乙醇，洗涤沉淀两次，以10000 rpm速度离心5 min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到DNA沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解DNA。DNA样品存于-20℃保存。用Nanodrop检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。
然后根据ZmSWEET6A（Zm00001d044421）基因序列设计PCR引物。
（1）检测靶标：MT1和MT2；产物大小：685 bp；引物序列如下：
ZmSWEET6A-T-F:5’- CGGGTTCATCTGGGTGGTTT-3’；
ZmSWEET6A-T-R:5’- TCAAATGAGAGACTGGATAGATGACGG-3’。
然后根据ZmSWEET6b（Zm00001d011299 ）基因序列设计PCR引物。
（2）检测靶标：MT3和MT4；产物大小：573 bp；引物序列如下：
ZmSWEET6B-T-F:5’- TTACCTGTGCAGTCTGACGTTCTG-3’；
ZmSWEET6B-T-R:5’- GTTATCCACGCAACTGAGCAGC-3’。
提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：
反应体系：15 μL MIX常规PCR体系，0.5 μL forward primer，0.5 μL reverseprimer，1 μL DNA，5.5 μL 灭菌ddH2O，7.5 μL 2x taq mix（产品编号：10103ES ）；
反应程序：常规PCR：59 ℃退火、延伸45s、32轮循环。
接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T0代独立阳性转化事件靶标区域的DNA序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现2个T0转化事件两个基因的靶标区域序列都发生了变化，编辑前后的序列如图3所示，对应2个sweet6a/6b纯合双突变体：ZmSWEET6A/6B-Cas9-1、ZmSWEET6A/6B-Cas9-2。与野生型序列比对显示ZmSWEET6A/6B- Cas9-1在靶标2处和靶标4处发生了缺失突变，ZmSWEET6A/6B-Cas9-2在靶标1处、靶标3处和靶标4处均发生了缺失突变。
对ZmSWEET6A/6B-Cas9-1突变体中两个基因的氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变体中的ZmSWEET6A基因在靶标2处发生了缺失突变，使其氨基酸发生了移码并导致氨基酸翻译提前终止；ZmSWEET6B基因在靶标4处发生了缺失突变，使得发生了42个氨基酸的丢失，因此该突变体中两个SWEET6基因的蛋白的功能均表现缺失。对ZmSWEET6A/6B-Cas9-2突变体中两个基因的氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变体中的ZmSWEET6A基因在靶标1处发生了缺失突变，使其氨基酸发生了移码并导致氨基酸翻译提前终止；ZmSWEET6B基因在靶标3处和靶标4处均发生了缺失突变，使其氨基酸发生了移码突变，且随后的氨基酸发生提前终止，因此该突变体中两个SWEET6基因的蛋白的功能均表现缺失。
4、F1代植株的基因分型
由于在温室生长的玉米T0代植株，经常雌穗和雄穗发育不协调，同时当编辑的基因与雄性发育相关时也会影响育性，因此为了繁殖T0代植株，并使获得的基因编辑类型遗传下去，本发明使用玉米自交系郑58的野生型花粉为上述获得的ZmSWEET6A/6B-Cas9-1和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2的T0代植株授粉，进而获得F1代种子，生长的植株为F1代植株。
F1代植株包括2种分离类型，一种为Cas9-阳性植株（转基因植株），另一种为Cas9-阴性植株（非转基因植株），为了避免sgRNA和Cas9对杂交授粉引入的郑58野生型等位基因进行持续编辑，从而造成突变类型的复杂性，我们需要通过基因分型从F1代植株中挑选出不含有Cas9基因，但含有T0代突变类型的植株，这类植株自交后可以得到非转基因的F2代，F1代植株的基因分型步骤如下。
按照上述的CTAB法提取叶片DNA后，首先利用Cas9基因的特异引物Cas9-F（5’-CCCGGACAATAGCGATGT-3’）和Cas9-R（5’- GAGTGGGCCGACGTAGTA-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系同上；反应程序：常规PCR：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据结果区分出Cas9-阳性植株和Cas9-阴性植株。
进一步针对Cas9-阴性植株，对于检测ZmSWEET6A（Zm00001d044421）基因的MT1和MT2采用上述的引物ZmSWEET6A-T-F和ZmSWEET6A-T-R；对于检测ZmSWEET6B（Zm00001d011299 ）基因的MT3和MT4采用上述的引物ZmSWEET6B-T-F和ZmSWEET6B-T-R进行PCR扩增；PCR产物纯化后，连接T载体，进行测序；根据测序结果分析确定T0代突变类型的遗传情况。
实施例三sweet6a/6b双突不育系的表型分析
上述实施例二鉴定的不含有Cas9基因的F1代植株自交后获得F2代种子，两种sweet6a/6b双突变型（ZmSWEET6A/6B-Cas9-1和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2）各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。两种F2株系中，可育株与不育株的比例，均符合15:1分离，进一步表明sweet6a/6b双突不育系的不育性状由2个隐性基因控制，然后针对F2代获得的稳定非转基因sweet6a/6b不育系与野生型进行详细的表型比较。
1、雄穗、花药和花粉活力的观察
在营养生长和雌穗的发育方面，sweet6a/6b双突不育系（ZmSWEET6A/6B-Cas9-1和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2）的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而sweet6a/6b双突不育系虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳基本不能开裂，花药明显较小，并且干瘪皱缩不外露（图4、图5）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体只含有少量花粉粒并且不能填充淀粉（图4、图5）。这表明ZmSWEET6A和ZmSWEET6B基因共同控制玉米的雄性发育，通过基因编辑方法创制的sweet6a/ 6b双突不育系为花粉粒碘败类型，且呈现完全败育的特点。
2、花药的扫描电镜（SEM）观察
为了深入解析sweet6a/6b的细胞学特征，对野生型和纯合双突变体花药内外壁进行扫描电镜（SEM）分析。剥取处于成熟期（S13）的野生型和突变体花药，然后立即固定在FAA（Coolaber，中国）溶液中，固定液的体积不少于所取研究材料体积的20倍；对于突变体花药，可用解剖针在花药壁穿孔以提高固定液的渗透效果，或者反复抽真空至花药沉入固定液底部；室温固定2小时后，将材料置于4℃保存，或依次置于50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中进行脱水，每个梯度保持15分钟；材料可置于70%的乙醇中过夜或保存。脱水后的样品进行二氧化碳临界点干燥，然后镀金即可进行观察。发现sweet6a/6b突变体的花药外表皮光滑，始终不能形成网状的角质层结构，而野生型则形成了致密的网状角质层结构；sweet6a/6b突变体花药的内表皮与野生型一样能形成致密的颗粒状的乌氏小体，且乌氏小体较野生型稍大；sweet6a/6b突变体花粉粒皱缩，花粉外壁较野生型更加粗糙，可能有更多孢粉素的积累（图6）。花药角质层是覆盖在花药表面的细胞外脂质层，保护花药免受外部非生物胁迫、内部组织失水和病原体的侵袭，位于花药内壁的乌氏体，被认为是孢粉素前体从绒毡层细胞到小孢子的转运载体。上述结果表明ZmSWEET6A（Zm00001d044421）基因和ZmSWEET6B（Zm00001d011299 ）基因同时突变后，造成花粉粒不填充淀粉（糖类物质），花粉外壁孢粉素合成增多，花药角质层缺失，脂类物质合成紊乱，最终影响花药发育后期糖类和脂类物质的代谢平衡。
实施例四ZmSWEET6A/6B-Cas9不育系鉴定的共分离分子标记开发和应用
1、共分离分子标记的开发
在本发明中，针对获得的ZmSWEET6A/6B-Cas9不育系的两个基因的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出四对共分离分子标记：ZmSWEET6A-F1/R1、ZmSWEET6A-F2/R2、ZmSWEET6B-F1/R1、ZmSWEET6B-F2/R2，结合PCR与琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
共分离分子标记ZmSWEET6A-F1/R1包括第一引物ZmSWEET6A-F1和第二引物ZmSWEET6A-R1；该标记能够特异性检测玉米ZmSWEET6A/6B-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因sweet6a，并能同时区分野生型SWEET6A基因和突变型sweet6a基因；针对突变基因sweet6a中扩增出72 bp的条带，而对野生型SWEET6A基因扩增出74 bp的条带。引物序列如下：
ZmSWEET6A-F1：5’-ATCCTCTGCGTCATCTTCGG-3’；
ZmSWEET6A-R1：5’-ATAGATGATGGATCACGTACCATG-3’。
共分离分子标记ZmSWEET6B-F1/R1包括第一引物ZmSWEET6B-F1和第二引物ZmSWEET6B-R1；该标记能够特异性检测玉米ZmSWEET6A/6B-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因sweet6b，并能同时区分野生型SWEET6B基因和突变型sweet6b基因；针对突变基因sweet6b中扩增出447 bp的条带，而对野生型SWEET6B基因扩增出573 bp的条带。引物序列如下：
ZmSWEET6B-F1：5’-TTACCTGTGCAGTCTGACGTTCTG-3’；
ZmSWEET6B-R1：5’-GTTATCCACGCAACTGAGCAGC-3’。
分离分子标记ZmSWEET6A-F2/R2包括第一引物ZmSWEET6A-F2和第二引物ZmSWEET6A-R2；该标记能够特异性检测玉米ZmSWEET6A/6B-Cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因sweet6a，并能同时区分野生型SWEET6A基因和突变型sweet6a基因；针对突变基因sweet6a中扩增出119 bp的条带，而对野生型SWEET6A基因扩增出120 bp的条带。引物序列如下：
ZmSWEET6A-F2：5’- ATCTGTGTTCTCGCGTGCCT-3’；
ZmSWEET6A-R2：5’- CACCCAGAGCATGCAGTTGA-3’。
共分离分子标记ZmSWEET6B-F2/R2包括第一引物ZmSWEET6B-F2和第二引物ZmSWEET6B-R2；该标记能够特异性检测玉米ZmSWEET6A/6B-Cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因sweet6b，并能同时区分野生型SWEET6B基因和突变型sweet6b基因；针对突变基因sweet6b中扩增出87 bp的条带，而对野生型SWEET6B基因扩增出90 bp的条带。引物序列如下：
ZmSWEET6B-F2：5’- TCATCGAGGCCATCTACCTCACC-3’；
ZmSWEET6B-R2：5’- GGCATTTGTGCAGCGCCAT-3’。
2、共分离分子标记的应用
为了验证上述标记的有效性，以实施例三中获得的F2株系为材料，进行SWEET6A和SWEET6B基因的检测。DNA提取方法、PCR扩增体系和条件同实施例二，PCR产物进行PAGE电泳分离或琼脂糖凝胶电泳分离。
理论上，ZmSWEET6A-F1/R1、ZmSWEET6B-F1/R1、ZmSWEET6A-F2/R2和ZmSWEET6B-F2/R2在SWEET6A/6B/ SWEET6A/6B纯合野生型（AABB）DNA中能分别扩增出74 bp、573 bp、120bp和90 bp的条带，分别在sweet6a/6b/ sweet6a/6b纯合突变型（aabb）材料DNA中分别扩增出72 bp、447 bp、119 bp和87 bp的条带，而在SWEET6A/6B/ sweet6a/6b杂合型（AaBb）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ZmSWEET6A-F1/R1、ZmSWEET6B-F1/R1、ZmSWEET6A-F2/R2和ZmSWEET6B-F2/R2分子标记的验证结果如图7、图8、图9和图10所示，结果显示设计的4个功能性分子标记对F2植株的检测结果完全符合预期，在SWEET6A/ SWEET6A、SWEET6B/SWEET6B纯合野生型，SWEET6A/ sweet6a、SWEET6B/ sweet6b杂合型，sweet6a/sweet6a、sweet6b/sweet6b纯合突变型材料中分别扩增出对应大小的条带，可以作为SWEET6A和SWEET6B基因检测的理想标记。
这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

Claims (7)

1.一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑方法同时抑制玉米中两个旁系同源基因ZmSWEET6A 和 ZmSWEET6B 的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株；所述ZmSWEET6A 和 ZmSWEET6B 基因的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2，其编码氨基酸序列分别为 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4。
2.根据权利要求1所述创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，所述 CRISPR/Cas9基因编辑方法包括：在ZmSWEET6A基因第三和第四外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6 所示；在ZmSWEET6B基因第三外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
3.利用权利要求1 所述创制玉米雄性不育系的方法获得的 sweet6a/6b 双突变体ZmSWEET6A/6B-Cas9-1和ZmSWEET6A/6B-Cas9-2；其中 ZmSWEET6A/6B-Cas9-1在ZmSWEET6A第 4 个外显子 838 bp-839 bp 之间缺失 2 个碱基，在 ZmSWEET6B 第 3 个外显子 402bp-527 bp 之间缺失 126 个碱基；ZmSWEET6A/6B-Cas9-2 在 ZmSWEET6A 第 3 个外显子417 bp 处缺失 1 个碱基，在 ZmSWEET6B 第 3 个外显子 389 bp 处缺失 1 个碱基，在528bp-530bp 之间缺失 3 个碱基。
4.一种获得雄性不育系sweet6a/6b的方法，其特征在于，通过权利要求 1所述方法获得的 sweet6a/6b 雄性不育突变体与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得sweet6a/6b双突变基因和雄性不育的性状。
5.通过权利要求4所述方法获得的雄性不育系sweet6a/6b在玉米杂交育种和制种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述的杂交育种和制种是指将雄性不育系sweet6a/6b作为母本与其他父本进行杂交。
7.根据权利要求5所述的应用，包括将获得的sweet6a/6b 雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得sweet6a/6b双突变基因和雄性不育的性状。
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"SWEET转运蛋白家族的发现、结构及功能研究进展";孙文杰等;《分子植物育种》;第14卷(第4期);第878-885页 *
"植物非结构性碳水化合物代谢及体内转运研究进展";李婷婷等;《植物生理学报》;第54卷(第1期);第25-35页 *

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CN116875633A (zh) 2023-10-13

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