CN116837002B - ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用 - Google Patents

ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。本发明采用EMS诱变获得一个玉米雄性不育突变体ddp1，通过图位克隆鉴定出一个控制玉米雄花发育的基因ZmDPP1。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中定点突变该基因，创制出3个ddp1的等位玉米雄性不育突变体，该突变体玉米雄花完全败育，通过后代筛选，可以得到不含转基因成分的不育突变体，进而应用于玉米不育化育种和制种。本发明还针对dpp1的三个等位雄性不育突变体设计了功能分子标记，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值。

Description

ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用
技术领域
本发明属于植物生物技术育种领域，涉及控制育性的ZmDPP1基因和其不育突变基因dpp1，以及ZmDPP1和其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。
背景技术
玉米（Zea mays L.）属禾本科植物，是重要的粮食作物之一，玉米及其副产品均可作为饲料原料的重要来源。此外，玉米籽粒可作为重要的工业原料，用于生产玉米胚芽油、玉米淀粉等，而且玉米在生物医药和工业酒精等工业生产中也具有重要作用。杂种优势是生物界普遍存在的遗传现象，是指植物不同品系之间进行杂交所得到的杂交后代在一种或多种性状上优于其纯合的父本和母本的现象。植物杂交后代的产量显著提高、生产繁殖能力增强，或表现在抗虫害、抗病性、抗逆性等方面的提高，杂种优势已被广泛应用于植物育种中，以提高农作物的产量。
早在1924年，玉米商业化的杂交种就已产生，由于玉米是雌雄同株异花作物，在玉米杂交育种和杂交种生产过程中均需对母本进行去雄。目前，母本去雄的方法主要有四种：人工去雄、机械去雄、化学杀雄和雄性不育技术。人工去雄导致制种成本的大幅度提高，同时去雄不及时；机械去雄将对植株造成物理性伤害，不利于植株生长发育；化学杀雄对植株自身有着较大的毒害作用，同时存在去雄不彻底的情况。雄性不育（male sterility, MS），是指在植物生长过程中，植物营养生殖长阶段正常发育，但在有性生殖发育阶段中雄性生殖器官发育异常，其无法产生具有正常功能的花粉而导致无法授粉结实。具有雄性不育表型的植株由于自身无法产生具有正常功能的花粉，因此，在杂交制种中可作为母本，从而降低了人工去雄的成本，同时有效地保证了杂交种子的纯度，此项技术对环境和植物都无明显副作用。当前，利用雄性不育技术进行玉米杂交育种和制种，是有效提高玉米杂种优势利用率和产量的重要途径。
利用图位克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合，快速鉴定出新的玉米雄性不育基因，并通过系统的细胞学观察雄花发育的形态变化，既可以了解雄花发育机制，同时可以快速丰富玉米核雄性不育基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用，可以用来创制雄性不育系，应用于玉米杂交育种和制种，提高玉米杂种优势利用效率，最终提高玉米单产。
为实现上述目的，本发明提供了一种玉米雄性育性基因ZmDPP1及其不育突变基因dpp1，其特征在于，所述玉米雄性育性基因ZmDPP1核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白ZmDPP1序列为SEQ ID NO.2；玉米雄性不育突变基因dpp1，其特征在于，该突变是由野生型ZmDPP1基因第2个外显子的+247位缺失1个碱基（T）引起，该突变造成ZmDPP1蛋白翻译提前终止，蛋白长度只有71个氨基酸，这导致含有该突变核苷酸序列dpp1突变体虽能正常抽雄，但花药干瘪，花粉败育，最终表现为完全雄性不育表型；所述突变基因dpp1的全长DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在另一方面，本发明还提供了ZmDPP1基因或ZmDPP1蛋白在培育雄性不育植物中的应用；
所述的应用为通过基因编辑或RNA干扰抑制ZmDPP1基因的表达和/或活性获得玉米雄性不育系；
上述应用中所述的ZmDPP1基因为序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子，ZmDPP1蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
在另一方面，本发明还提供了一种创制玉米dpp1等位雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法为基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，对玉米基因组中的ZmDPP1基因进行定点突变，进而使其育性功能丧失，得到不同突变类型的玉米雄性不育系。
上述应用中所述CRISPR-Cas9系统表达Cas9蛋白的基因和sgRNA的基因，所述sgRNA的靶序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，均位于ZmDPP1基因的第1个外显子区域。
进一步本发明提供了玉米dpp1的三种等位雄性不育突变体，其特征在于，dpp1等位突变体包括ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3；其中ZmDPP1-Cas9-1在第1个外显子56 bp-127 bp处缺失72个碱基（TTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGCTCC）；ZmDPP1-Cas9-2在第1个外显子47 bp-124 bp处缺失78个碱基（CCGCCCTCCTTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGC）；ZmDPP1-Cas9-3在第1个外显子36 bp处插入31个碱基（ATACCGCCCAGGCGACATCGTCCAGGCGACA）和37 bp-52 bp处缺失16个碱基（GGCGTCCTCCCCGCCC）和112 bp-123 bp处缺失12个碱基（ATCGTCCCGATG）。
本发明还提供了三种玉米雄性不育突变体ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3的功能标记。
其中所述ZmDPP1-Cas9-1突变体功能分子标记引物ZmDPP1-F1和ZmDPP1-R1的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，该功能标记能同时区分野生型ZmDPP1基因和dpp1-Cas9-1突变型基因。
所述ZmDPP1-Cas9-2突变体功能分子标记引物ZmDPP1-F2和ZmDPP1-R2的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，该功能标记能同时区分野生型ZmDPP1基因和dpp1- Cas9-2突变型基因。
所述ZmDPP1-Cas9-3突变体功能分子标记引物ZmDPP1-F3和ZmDPP1-R3的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，该功能标记能同时区分野生型ZmDPP1基因和dpp1- Cas9-3突变型基因。
本发明的优点及有益效果如下：
ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用是之前没有报道过的。本发明采用图位克隆方法，首先从获得的玉米雄性不育突变材料dpp1中，分离了调控玉米雄花发育的新基因ZmDPP1，发现ZmDPP1突变造成不能正常开花，且花药干瘪，花粉无淀粉填充，最终表现为花粉败育型的完全雄性不育。该基因的克隆为人工创制雄性不育系提供了资源和途径。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法定点突变ZmDPP1蛋白编码基因，可用于玉米育性控制和杂交种子生产。针对CRISPR/Cas9编辑后获得的三个dpp1等位雄性不育突变体开发的功能分子标记，可在玉米不育系育种和制种中应用于等位基因鉴定、目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。因此，本发明在玉米不育化育种和制种上具有重要意义，可以为玉米增产提供重要生物资源。
附图说明
图1为玉米野生型（WT）和突变体dpp1的表型
A和B，WT和突变体dpp1的雄穗表型；C和D，WT和突变体dpp1的花药表型；E和F，WT和突变体dpp1的花药I2-KI染色表型。标尺=5cm （A-B），2mm（C-D），100μm（E-F）。
图2为玉米ZmDPP1基因的精细定位和图位克隆
A，不育 dpp1群体DNA与可育群体DNA的多态性标记比较；B，F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株用于玉米ZmDPP1基因的初定位，初步将ZmDPP1基因定位于6号染色体SSR标记 umc1887和umc1250之间；C，ZmDPP1基因精细定位于SSR标记 P2-3 和P2-7之间，约41.1 kb的区间；D，精细定位区间内预测的5个基因模型；E，野生型和dpp1突变体中ZmDPP1基因结构及测序分析。
图3为野生型（WT）和dpp1突变体中Zm00001d037509基因的序列比对
图4为ZmDPP1基因在玉米花药不同发育时期中的表达模式分析
S5，造孢细胞时期；S6, 小孢子母细胞时期；S7，减数分裂开始时期；S8a，减数分裂Ⅰ，二分体时期；S8b，减数分裂Ⅱ，四分体时期；S9，单核小孢子时期；S10，小孢子空泡化时期；S11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；S12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期；S13，淀粉完全填充。
图5为pCas9-ZmDPP1定点突变表达载体的物理图谱
pCas9-ZmDPP1：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmDPP1基因靶标2（MT2）的表达盒；靶标1（MT1）的表达盒。
图6为野生型ZmDPP1与ZmDPP1-Cas9不育突变体的基因结构和DNA序列分析
野生型ZmDPP1（WT- ZmDPP1）：基因全长2918 bp，包括9个外显子和8个内含子；dpp1突变体ZmDPP1-Cas9-1：在第1个外显子56 bp-127 bp处缺失72个碱基（TTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGCTCC）；突变体ZmDPP1- Cas9-2：在第1个外显子47 bp-124 bp处缺失78个碱基（CCGCCCTCCTTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGC）；突变体ZmDPP1-Cas9-3：在第1个外显子36 bp处插入31个碱基（ATACCGCCCAGGCGACATCGTCCAGGCGACA）和37 bp-52 bp处缺失16个碱基（GGCGTCCTCCCCGCCC）和112 bp-123 bp处缺失12个碱基（ATCGTCCCGATG）。
图7为野生型（WT）与dpp1三个等位纯合突变体的雄穗、花药和花粉粒表型分析
上排为玉米WT与 ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3纯合突变体雄穗的表型比较；第二排为WT及与ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3纯合突变体花药的表型比较；下排为WT与 ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3纯合突变体花粉粒的I2-KI染色比较。
图8为利用共分离标记对ZmDPP1-Cas9-1不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmDPP1-F1/R1对13株ZmDPP1-Cas9-1不育突变体F2代植株的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出267 bp条带；在DPP1/ dpp1杂合型（Aa）植株中扩增出267 bp和195 bp两条带；在dpp1/dpp1纯合突变型（aa）植株中扩增出195 bp条带。
图9为利用共分离标记对ZmDPP1-Cas9-2不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmDPP1-F2/R2对13株ZmDPP1-Cas9-2不育突变体F2代植株的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出276 bp条带；在DPP1/ dpp1杂合型（Aa）植株中扩增出276 bp和198 bp两条带；在dpp1/ dpp1纯合突变型（aa）植株中扩增出198 bp条带。
图10为利用共分离标记对ZmDPP1-Cas9-3不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmDPP1-F3/R3对12株ZmDPP1-Cas9-3不育突变体F2代植株的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出130 bp条带；在DPP1/ dpp1杂合型（Aa）植株中扩增出130 bp和118 bp两条带；在dpp1/ dpp1纯合突变型（aa）植株中扩增出118 bp条带。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：玉米雄性不育突变体dpp1的获得
通过筛选本实验室甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）诱导的玉米自交系郑58突变体库，获得一个完全雄性不育的突变体，将其命名为dpp1。该突变体的雄性不育性状在北京和海南三亚经过与野生型多代杂交均可稳定遗传，不受环境影响。在北京科技大学试验田和海南三亚等多地条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发现无明显差异，仅表现出雄性不育性状。
实施例二：植株表型鉴定及花粉育性观察
dpp1突变体在营养生长和雌穗发育方面，与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而dpp1突变体虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药干瘪不外露（图1）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体花粉干瘪无法被I2-KI染为黑色（图1）。
实施例三：ZmDPP1基因的定位、克隆和突变位点分析
以自交系B73为父本与突变体dpp1杂交，F1代育性正常，F2代出现育性分离，如表1所示，F2群体中正常可育株（F）与不育株（S）的分离符合单基因3:1的分离比，即突变体的雄性不育表型表现为明显的单基因隐性遗传。
表1 玉米dpp1突变体育性分离的遗传分析
F2 群体 植株总数 可育植株数, F 不育植株数, S F/S 比 X2值 显著性检验 P>0.05
dpp1×B73 1165 893 272 3.28:1 2.14(X2 0.05=3.84) ns*
挑选dpp1×B73 F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株，用于玉米ZmDPP1基因的初定位研究。所使用的SSR标记如表2所示，基因定位情况如图2所示。
表2 用于ZmDPP1基因定位的SSR标记
引物名称 引物序列(5'-3')
umc1887-F CTTGCCATTTTAATTTGGACGTTT
umc1887-R CGAAGTTGCCCAAATAGCTACAGT
umc1250-F GAGGCAAGAGCTAGGTCTCGATAG
umc1250-R CTGCTGCTTTTGGTGTTGTCTCT
P1-1-F TCGCCTCTGACCCTATA
P1-1-R GGAGCACGGATTCTCGG
P1-2-F TCCGGCGATCTCGACTC
P1-2-R TCCGGCGATCTCGACTC
P1-3-F AGCGATGTGCAACTCCC
P1-3-R CAGCACCGCAAGATGAG
P2-1-F TGGGATTTAGGGGAGGA
P2-1-R GATGAATGTTATGATATGCTTGA
P2-2-F CTCGGATGTTCAATGTTCT
P2-2-R TTTAGCAGCGCCGTATA
P2-3-F CATCGTCAGGCGTTTCCAG
P2-3-R TCCTTGCGTCGGGTTGC
P2-7-F TGAATCACTGATACACTACGC
P2-7-R AGGAGGAAGGAGACGAGC
结果表明，DPP1基因初步定位在玉米6号染色体上（图2A），粗定位于SSR标记umc1887和umc1250之间（图2B），进一步精细定位于标记P2-3 和P2-7之间约41.1 kb的区间（图2C），在此区间预测有5个候选基因（图2D）；对ZmDPP1（Zm00001d049975）和突变体基因进行克隆、测序分析，发现dpp1突变体在+247 bp位置缺失1个碱基（T），导致氨基酸移码突变，蛋白翻译提前终止（图2E和图3）。ZmDPP1基因包含227个核苷酸，包括9个外显子，编码一个未知功能蛋白，本发明将该基因命名为ZmDPP1。
实施例四：ZmDPP1的时空表达分析
为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系，本发明首先利用qPCR分析了该基因在玉米花药发育不同阶段的表达模式。具体步骤如下：
1、玉米花药的取样与发育时期鉴定
从玉米自交系B73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。
利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。
2、qPCR分析
用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix （ABM，加拿大）合成cDNA；采用TBGreen™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5 QuantStudio 5 Real-Time PCRSystem （ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，扩增引物为：qDPP1-F（5’-TCCTCCCCGCCCTCCTTCT-3’）和qDPP1-R（5’-GTGGTACTGGCCCGAGCGGA-3’）；ZmUbiqutin为参照基因，其扩增引物为：Ubiqutin-F（5’-CGACAACGTGAAGGCGAAGA-3’）和Ubiqutin-R（5’-ACGCAGATACCCAGGTACAGC-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2-ΔΔCt方法进行分析，并以均值±标准差（Means±SD）的形式给出定量结果。
ZmDPP1基因呈现花药发育时期特异表达的模式：在玉米花药发育的S5到S10时期有较低表达，随后从S11时期开始上升， S12时期表达量最高，随后在S13时期相对降低（图4）。
实施例五：ZmDPP1基因的功能验证和利用CRISPR/Cas9方法创制玉米雄性不育突变体
为了明确玉米ZmDPP1在玉米中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法突变 Zm00001d037509基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米杂交种HiII作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因保守区的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域。
1、ZmDPP1的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为pBUE411-MT1T2-Cas9，该载体的基础载体为pBUE411- Cas9，中间载体为pCBCmT1T2，提供gRNA。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过酶切连接到基础载体中，具体的构建流程如下：
（1）靶标gRNA的设计。将ZmDPP1（Zm00001d037509）的基因序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR 进行靶标设计。本发明选择的两个靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明的sgRNA骨架序列从中间载体pCBCmT1T2直接扩增获得。
（2）通过在引物上设计靶点然后PCR扩增获得MT-sgRNA。引物ZmDPP1-MT1-F和引物ZmDPP1-MT2-R扩增中间载体pCBCmT1T2，用于获得包含第一个和第二个靶标的sgRNA的片段，产物长度为965 bp。PCR 体系和条件如下：模板DNA （中间载体pCBCmT1T2 ≥30 ng/μL）1.2 μL；Primer F/R：各1.2 μL；灭菌ddH2O：11.4 μL；2X MCLAB 酶（产品编号：I5HM-200）：15 μL。PCR的温度程序如下：①98 ℃ 2分钟；②98 ℃ 10秒；③58 ℃ 30秒；④72 ℃ 30秒；⑤ 从②－④循环34次；⑥ 72 ℃ 5分钟；⑦ 25 ℃ 10分钟。最后回收PCR产物。载体构建所需的引物序列如下：
ZmDPP1-MT1-F: 5’-ATATATGGTCTCTGGCGATAGGATGAGAAGGAGGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’
ZmDPP1-MT2-R: 5’-ATTATTGGTCTCTAAACACTGGCCCGAGCGGAGCATTGCTTCTTGGTGCCGC-3’
（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将pBUE411-Cas9载体和回收的带有靶标的sgRNA片段用BsaI消化，同时加入T4连接酶将载体和sgRNA片段连接。10 μL的酶切连接体系如下，sgRNA片段：1 μL，pBUE411-Cas9载体（≥60 ng/μL) ：1 μL，10 x NEB Buffer：1 μL，BsaI内切酶（产品编号：#R3733S ）：0.5 μL，T4 连接酶（产品编号：#M0202M ）：0.25 μL，灭菌ddH2O：6.25 μL。
图5所示为目的基因ZmDPP1（Zm00001d037509）的双靶标（对应第一个靶标和第二个靶标），标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411-Cas9构建的表达载体pCas9-ZmDPP1。
2、农杆菌介导的玉米遗传转化
将上述构建的pCas9-ZmDPP1载体分别通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定；然后以1:1的体积农杆菌和甘油混合于-80 ℃保存菌液。以新鲜剥离的1.2-1.5 mm左右的玉米杂交种HiII的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8 mL悬浮液的2 mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43 ℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0 mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23 ℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28 ℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5 mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2 mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28 ℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28 ℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3、T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测
为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：
本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2 mL离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入500 μL CTAB提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1-2次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入500 μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4 ℃条件下，以12000 rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5 mL离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10 min左右；随后将盛有样品的离心管放入4 ℃离心机中，以12000 rpm速度离心10 min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800 μL75 %乙醇，洗涤沉淀两次，以10000 rpm速度离心5 min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到DNA沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解DNA。DNA样品存于-20 ℃保存。用Nanodrop检测DNA浓度，稀释至10 ng/L用作PCR模板。
然后根据ZmDPP1（Zm00001d037509）基因序列设计PCR引物。
检测靶标：MT1和MT2；产物大小：275 bp；引物序列如下：
ZmDPP1-T-F1: 5’-GTCCCCACCATGGCCGCTC-3’；
ZmDPP1-T-R1: 5’-CGACCTCGACTGCAAAACCACC-3’。
提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：
反应体系：15 μL MIX常规PCR体系，0.5 μL forward primer，0.5 μL reverseprimer，1 μL DNA，5.5 μL 灭菌ddH2O，7.5 μL 2x taq mix（产品编号：10103ES ）。
反应程序：常规PCR：58 ℃退火、延伸30 s、35轮循环。
接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T0代独立阳性转化事件靶标区域的DNA序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现3个T0转化事件靶标区域序列发生了变化，且均为纯合突变，编辑前后的序列如图6所示，对应3个dpp1等位纯合突变体：ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3。与野生型序列比对显示，ZmDPP1-Cas9- 1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3均在靶标1和2处发生了缺失突变。
对3个dpp1等位突变体中氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变后的品系ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3，其编码的核苷酸在靶标1或2处的缺失和插入使其氨基酸发生了缺失和移码突变。因此这些转化体中Zm00001d037509蛋白的功能均呈现缺失。
4、F1代植株的基因分型
由于在温室生长的玉米T0代植株，经常雌穗和雄穗发育不协调，同时当编辑的基因与雄性发育相关时也会影响育性，因此为了繁殖T0代植株，并使获得的基因编辑类型遗传下去，本发明使用玉米自交系郑58的野生型花粉为上述获得的ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1- Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3的T0代植株授粉，进而获得F1代种子，生长的植株为F1代植株。
F1代植株包括2种分离类型，一种为Cas9-阳性植株（转基因植株），另一种为Cas9-阴性植株（非转基因植株），为了避免sgRNA和Cas9对杂交授粉引入的郑58野生型等位基因进行持续编辑，从而造成突变类型的复杂性，我们需要通过基因分型从F1代植株中挑选出不含有Cas9基因，但含有T0代突变类型的植株，这类植株自交后可以得到非转基因的F2代。F1代植株的基因分型步骤如下：
按照上述的CTAB法提取叶片DNA后，首先利用Cas9基因的特异引物Cas9-F（5’-CCCGGACAATAGCGATGT-3）和Cas9-R（5’- GAGTGGGCCGACGTAGTA-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系同上；反应程序：常规PCR：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据结果区分出Cas9-阳性植株和Cas9-阴性植株。
进一步针对Cas9-阴性植株，采用上述的检测MT1和MT2靶标的引物ZmDPP1-T-F1和ZmDPP1-T-R1，进行PCR扩增；PCR产物纯化后，连接T载体，进行测序；根据测序结果分析确定T0代突变类型的遗传情况。
实施例六：玉米ZmDPP1-Cas9雄性不育突变体的表型分析
上述实施例鉴定的不含有Cas9基因的F1代植株自交后获得F2代种子，三种突变类型（ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3）各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。三种F2株系中，可育株与不育株的比例，均符合3:1分离，进一步表明ZmDPP1-Cas9不育突变体的不育性状由单个隐性基因控制，然后针对F2代获得的稳定非转基因ZmDPP1-Cas9不育突变体与野生型进行详细的雄穗、花药和花粉活力的观察。
在营养生长和雌穗的发育方面，ZmDPP1-Cas9-1、ZmDPP1-Cas9-2和ZmDPP1-Cas9-3不育突变体的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实， 而三个ZmDPP1-Cas9不育突变体虽能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药明显较小，并且发白干瘪不外露（图7）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图7）。这表明ZmDPP1（Zm00001d037509）基因控制玉米的雄性发育，通过基因编辑方法创制的ZmDPP1-Cas9不育突变体为花粉败育型不育系，呈现完全败育的特点。
实施例七：ZmDPP1-Cas9不育突变体鉴定的共分离功能分子标记开发和应用
1、共分离分子标记的开发
在本发明中，针对获得的三种ZmDPP1-Cas9不育突变体的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出三对共分离功能分子标记：ZmDPP1-F1/R1、ZmDPP1-F2/R2和ZmDPP1-F3/R3，结合PCR与琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
共分离分子标记ZmDPP1-F1/R1包括第一引物ZmDPP1-F1和第二引物ZmDPP1-R1；该标记能够特异性检测玉米ZmDPP1-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因dpp1-Cas9-1，并能同时区分野生型ZmDPP1基因和突变型dpp1-Cas9-1基因；针对突变基因dpp1-Cas9-1中扩增出195 bp的条带，而对野生型ZmDPP1基因扩增出267 bp的条带。引物序列如下：
ZmDPP1-F1：5’-ATGGCCGCTCGCCGGAGCA-3’
ZmDPP1-R1：5’-GTCGAACCACACCGACCTCGA-3’
共分离分子标记ZmDPP1-F2/R2包括第一引物ZmDPP1-F2和第二引物ZmDPP1-R2，该标记能够特异性检测玉米ZmDPP1-Cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因dpp1-Cas9-2，并能同时区分野生型ZmDPP1基因和突变型dpp1-Cas9-2基因；针对突变基因dpp1-Cas9-2中扩增出198 bp的条带，而对野生型ZmDPP1基因扩增出276 bp的条带。引物序列如下：
ZmDPP1-F2：5’-CGCCGGAGCACTAGCCCC-3’
ZmDPP1-R2：5’-GCAATGGCGCCCCACCACG-3’
共分离分子标记ZmDPP1-F3/R3包括第一引物ZmDPP1-F3和第二引物ZmDPP1-R3，该标记能够特异性检测玉米ZmDPP1-Cas9-3突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因dpp1-Cas9-3，并能同时区分野生型ZmDPP1基因和突变型dpp1-Cas9-3基因；针对突变基因dpp1-Cas9-3中扩增出118 bp的条带，而对野生型ZmDPP1基因扩增出130 bp的条带。引物序列如下：
ZmDPP1-F3：5’-CATCCTATGCTCGTCCCTCCC-3’
ZmDPP1-R3：5’-ATACTTGCTGCCTTGGGTAATGG-3’
2、共分离分子标记的应用
为了验证上述标记的有效性，以实施例六中获得的F2株系为材料，进行DPP1等位基因的检测。DNA提取方法、PCR扩增体系和条件同实施例二，PCR产物进行PAGE或琼脂糖凝胶电泳分离。
理论上，ZmDPP1-F1/R1、ZmDPP1-F2/R2和ZmDPP1-F3/R3在DPP1/ DPP1纯合野生型（AA）DNA中能分别扩增出267 bp、276 bp和130 bp的条带，在dpp1/ dpp1纯合突变型材料（aa）DNA中分别扩增出195 bp、198 bp和118 bp的条带，而在DPP1/dpp1杂合型（Aa）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ZmDPP1-F1/R1、ZmDPP1-F2/R2和ZmDPP1-F3/R3 分子标记的验证结果如图8、图9和图10所示，结果显示设计的3个功能性分子标记对F2植株的检测结果完全符合预期，在DPP1/ DPP1纯合野生型（AA）、DPP1/ dpp1杂合型（Aa）和dpp1/ dpp1纯合突变型材料（aa）中分别扩增出对应大小的条带，可以作为DPP1，dpp1等位基因检测的理想标记。
这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

Claims (7)

1.一种玉米雄性不育突变基因dpp1，其特征在于，所述不育突变基因dpp1由玉米雄性育性基因ZmDPP1第2个外显子的+247位缺失1个碱基T引起；所述玉米雄性育性基因ZmDPP1位于玉米6号染色体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白序列为SEQ ID NO.2；所述突变基因dpp1的全长DNA序列为 SEQ ID NO.3，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
2.玉米ZmDPP1基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑方法抑制玉米中ZmDPP1基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株；所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括，在玉米ZmDPP1基因第一外显子处设计CRISPR/Cas9靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述玉米ZmDPP1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白序列为SEQ ID NO.2。
3.一种创制玉米dpp1雄性不育系的方法，其特征在于，所述方法为采用CRISPR/Cas9基因编辑方法，通过对玉米基因组中的ZmDPP1基因进行定点突变，得到不同突变类型的玉米等位雄性不育突变体；所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括，在玉米ZmDPP1基因第一外显子处设计CRISPR/Cas9靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述玉米ZmDPP1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白序列为SEQ ID NO.2。
4.根据权利要求3所述创制玉米dpp1雄性不育系的方法，其特征在于，所述玉米dpp1雄性不育系包括ZmDPP1-Cas9-1，ZmDPP1-Cas9-2 和 ZmDPP1-Cas9-3等3个等位雄性不育突变体；其中，ZmDPP1-Cas9-1在第1个外显子56 bp-127 bp处缺失72个碱基；突变体ZmDPP1- Cas9-2：在第1个外显子47 bp-124 bp处缺失78个碱基；突变体ZmDPP1-Cas9-3：在第1个外显子36 bp处插入31个碱基，在37 bp-52 bp处缺失16个碱基，并在112 bp-123 bp处缺失12个碱基。
5.一种获得玉米dpp1雄性不育系的方法，其特征在于，通过权利要求3所述方法获得的玉米dpp1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得dpp1雄性不育的性状和基因突变。
6.通过权利要求5所述的方法获得的玉米dpp1雄性不育系在玉米杂交育种和制种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，针对玉米突变等位基因dpp1设计3组功能标记，应用于dpp1雄性不育系杂交育种和制种中的分子标记辅助选择：（1）针对玉米雄性不育突变体ZmDPP1-Cas9-1的功能标记，所述功能分子标记引物ZmDPP1-F1和ZmDPP1-R1的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；（2）针对玉米雄性不育突变体ZmDPP1-Cas9-2的功能标记，所述功能分子标记引物ZmDPP1-F2和ZmDPP1-R2的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；（3）玉米雄性不育突变体ZmDPP1-Cas9-3的功能标记，所述功能分子标记引物ZmDPP1-F3和ZmDPP1-R3的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
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