CN114071993A

CN114071993A - 栽培马铃薯的自交亲和性

Info

Publication number: CN114071993A
Application number: CN202080049260.1A
Authority: CN
Inventors: 阿特·范徳布格特; 厄恩斯特-扬·艾格斯; 米希尔·埃里克·德弗里斯; 阿徳里安·威廉·范赫斯顿; W·H·林德豪特
Original assignee: AGVENTURE BV
Current assignee: AGVENTURE BV
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: WO2020226499A1; CN114071993B; US20220267386A1

Abstract

本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含编码具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列和与所述氨基酸序列有至少70％的序列一致性并赋予马铃薯植物自交亲和性的序列。本发明进一步涉及包含该核酸序列的转化的植物和其部分。本发明进一步涉及用于选择的方法和用于生产含该核酸序列的植物的方法，及涉及通过这些方法获得的植物。所述植物可以进一步包含选自S.avilesii 478‑2Rpi*‑avl1、S.tarinjense 852‑5Rpi‑tar1、S.chacoense 543‑5Rpi‑chc1和S.venturii 283‑1Rpi‑vnt1的每一种Phytophtera infestance抗性基因的至少一种等位基因。本发明进一步涉及由本发明的一部分的植物部分制备的食品。

Description

栽培马铃薯的自交亲和性

技术领域

本发明涉及在植物，特别是在马铃薯植物中配子体控制自交不亲和性(SI)的新基因，以及使用该基因在植物中控制配子体自交不亲和性的方法。更具体地，本发明涉及抑制植物的配子体自交不亲和性的新基因和使用该基因创造自交亲和的植物的方法。本发明进一步涉及从马铃薯克隆的马铃薯自交亲和的基因(PSC)的自交亲和性等位基因及其天然启动子和调控区、含该基因和组成型启动子的构建体、含该构建体的载体、利用该构建体和载体转化的植物的方法，及用该基因构建体转化的植物。本发明进一步涉及用于选择含配子体控制自交亲和性(PSC)的新的自交亲和性等位基因的植物的方法和涉及使用分子标记通过标记辅助选择产生的植物，该分子标记连接至该新基因或在该新基因内或者与自交亲和的或自交不亲和的表型有关。

背景技术

经典的四倍体马铃薯育种是繁琐的。常规四倍体育种向二倍体杂交育种转变的可能性已经研究了50年(Hawkes，1956)。然而，几十年来没有开发出旺盛并可育的纯合二倍体马铃薯基因型。

马铃薯中二倍体纯合子的产生受到两种现象的阻碍：i)自交不亲和性，即通过排斥自交花粉而防止自体受精的遗传系统和ii)近亲繁殖抑制，即在持续自体受精后生育力和活力逐渐下降。

原则上，大多数二倍体(2n＝2x＝24)马铃薯物种是自交不亲和的(self-incompatible，SI)。自交不亲和性系统被认为是由单一的、配子体遗传的、多等位基因座，S基因座控制的(Abdalla&Hermsen，1971，Euphytica 20：345-350)。然而，已经异常地发现了自交亲和的(self-compatible，SC)的变体。通过两个克隆之间的杂交所产生的自交亲和的和自交不亲和的F1植株的完全双列杂交和互交，详细研究了S.tuberosum的两个二单倍体克隆(G254和B16)的意外自交亲和性的遗传基础(Olsder&Hermsen，1976，Euphytica 25：597-607)。尤其，基于在第一近交代的各种自交和相互回交方案中缺乏性状的分离，得出这样的结论：假定易位纯合子是致死的并且易位上的S等位基因仅在花粉中是活跃的，自交亲和性是由携带S等位基因片段的存在引起的，该S等位基因携带片段作为不与S基因座连接的易位存在(即，S-携带易位)(Olsder&Hermsen，1978，Euphytica 27：1-11)。另一种可能性是自交亲和性是由显性抑制基因“I”引起的，该显性抑制基因独立于S基因座并使S等位基因失活(即显性抑制)，该可能性作为假说被抛弃。

在另一个示例中，发现了野生二倍体马铃薯种Solanum chacoense的自交亲和(SC)的变体(Hanneman，1985，Am Potato J 62：428-429)，并且通过自交产生了高度近交系(chc 525-3)(Hosaka and Hanneman，1998，Euphytica 99：191-197)。对该近交系(chc525-3)的自交亲和性的性质和遗传学进行了详细的研究，为此，该近交系作为雌性与SI栽培的二倍体S.phureja杂交(Hosaka and Hanneman 1998，Euphytica 99：191-197)。尤其，基于F2分离比得出这样的结论：自交亲和性是由具有孢子体作用的单一显性基因(‘Sli’)引起的，该基因抑制花粉中S基因的表达。有Sli基因的植物产生的花粉对其亲本和具有相似S基因的植物亲和。所以，Sli基因对于S等位基因依赖的不亲和性来说是显性的，因此被指定为赋予自交亲和性的基因座。由于Sli基因经历8个自交代(S8)保持了杂合状态，并且从未鉴定出纯合子，所以得出这样的结论：显性纯合子可能与致死性相关。值得注意的是，在上面描述的Olsder&Hermsen，1976，1978的SC二单倍体S.tuberosum克隆的研究中特别抛弃了这种自交亲和性的假设机制。

此后更详细地研究了S.chacoense chc 525-3的假定的S基因座抑制剂基因(Sli)(Hosaka&Hanneman，1998，Euphytica 103：265-271.Birhman and Hosaka，2000，Genome43：495-502；Phumichai et al.，2005，Genome 48：977-984；Phumichai et al.，2006，Euphytica 148：227-234；Phumichai&Hosaka，2006，Euphytica 149：251-258)，且该来源的自交亲和性最终成功发展出具有高水平纯合性、生育力和活力的二倍体近交S.tuberosum系(Lindhout et al.2011，Potato Res.54：301-312；Jansky et al.，2014，J.PlantReg.8：195-199)。这种纯合的二倍体马铃薯近交系在二倍体商品化品种的产生和通过标记辅助回交的杂交体的开发中起重要作用，杂交体尤其对Phytophthora infestans有抗性(优选通过堆叠不同的Phytophthora抗性基因)。这种杂交育种方法依赖于自交亲和的纯合近交系。

目前，对马铃薯自交亲和性的遗传基础的详细了解仍然很少。在本领域中，假设二倍体S.chacoense chc 525-3中的SC系统不同于二倍体S.tuberosum克隆G254和B16中的SC系统，这表明不同的系统因此可用于马铃薯的近亲繁殖。虽然自交亲和性的性状现在已成功地用于近交二倍体S.tuberosum系的产生，但尚未鉴定提出的Sli基因，并且该性状的遗传可能性不能完全通过当前的遗传模型(当前的模型预测该基因是孢子体遗传的)预测。

因此，需要对提出的‘Sli’基因进行确定的定位和测序。

为了在育种计划的早期阶段中检测出自交亲和的后代植物，还存在对能够基于马铃薯植物的自交亲和性检测(这种检测优选基于遗传标记)Sli基因的需求。

此外，还存在更容易且更可预测地产生自交亲和的马铃薯植物的方法，从而使得能够实现目标育种，堆叠抗性和其他农艺上有利的性状的可能，并且能够最小化连锁累赘(linkage drag)的需求。

发明内容

发明人目前已经成功地定位了来自S.chacoense的SC性状。他们发现这种自交亲和性不是孢子体遗传的，而是配子体遗传的，并且这种不正确的限定大大妨碍了基因的定位。在F2群体中的初始遗传分析和在这些群体中观察到的性状分离最初似乎不与孢子体遗传冲突，但它也不能支持配子体遗传。然而，对这种假定的单基因性状的定位并不成功。发明人随后发现，使用有两个F1作为亲本的被预先选择为可再生产的自交(不)亲和性的F1群体，代替使用F2群体，带来了突破，并提供了自交亲和性基因是配子体遗传的确凿证据。在F2中定位配子体遗传的性状是不可能的，因为每株F2植物将遗传显性自交亲和的Sli等位基因的至少一个拷贝。这解释了过去定位研究的失败的原因。

不希望受任何理论的束缚，本发明人认为观察到的F2的性状分离是因为近亲繁殖抑制，这导致在很大比例的后代群体中生育力的严重下降或甚至丧失。因此，这种表型可能被错误地划为自交不亲和的。本发明人注意到，分离群体含有许多不可育的植物。只有通过非常详细的表型分析，包括通过使用UV显微镜监测花粉管到花柱的实际生长，发明人才得以清楚地区分自交亲和的植物和自交不亲和的植物。实际上，基于缺乏明确的表型评分，需要去除来自后代群体的所有植物的大约1/3的分析，以成功地定位性状。因此，先前对该基因进行定位的尝试也可能受到不准确的表型分析的影响。

该基因的配子体遗传不同于所谓的Sli孢子体遗传，促使我们将新识别的基因命名为马铃薯自交亲和性(Potato Self Compatibiliy)基因或PSC。类似于Sli，PSC定位于第12号染色体的远端。Sli的所谓孢子体遗传可能是不正确的，在这种情况下Sli和PSC可能是相同的。

本发明人认为，PSC基因的S.chacoense自交亲和性等位基因的功能同系物可以出现在S.tuberosum和其他自交亲和的植物物种中。

根据该发现，本发明的一个目的是提供一种分离的核酸分子，其包含编码具有如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，和与所述氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、90％或甚至至少95％序列一致性并赋予马铃薯植物自交亲和性的序列。

在这方面的优选实施方案中，在所述植物的花粉中表达的情况下，与所述氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、90％或甚至至少95％的序列一致性的所述序列赋予马铃薯植物自交亲和性。

在这方面的另一优选实施方案中，所述分离的核酸分子进一步包含与编码所述蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子，其中，所述启动子在植物细胞中，优选在花粉中启动编码所述蛋白质的所述核酸序列的转录。

在这方面的又一个优选实施方案中，所述启动子包含位于Solyntus 1.0基因组组装的坐标53954293至53532708处的天然PSC基因的截短或非截短启动子区，优选其中，所述启动子至少包含如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示核酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种启动子核酸序列，所述启动子核酸序列包含以下项或由以下项组成：如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的核酸序列，和与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20有至少80％序列一致性并且有在植物花粉中表达基因，优选如所定义的PSC基因的启动子活性的序列。

本发明的另一个目的是提供一种赋予马铃薯植物自交亲和性的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8的序列，及与它们有至少70％，优选至少80％、90％或甚至至少95％的序列一致性并赋予马铃薯植物自交亲和性的序列组成。

另一方面，本发明进一步提供编码PSC的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子选自由以下项组成的组：

(a)含基因的突变的等位基因序列的核酸分子，所述基因具有SEQ ID NO：1或5的野生型核苷酸序列，所述突变的等位基因编码在植物中抑制自交不亲和性的基因产物；

(b)核酸分子，所述核酸分子编码a)中核酸分子的天然存在的等位基因变体并且编码在植物中配子体地抑制自交不亲和性的基因产物。示例性的提供自交亲和性的等位基因是SEQ ID NO：2、3和4，而示例性PSC基因的编码基因序列是SEQ ID NO：6、7和8。

本发明的另一目的是提供一种含马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因的分离的核酸分子，所述马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因是如SEQID NO：1或5所示的基因A的野生型S.tuberosum等位基因的突变序列，所述基因A编码在植物赋予配子体自交不亲和性的产物，所述突变序列与SEQ ID NO：1或5有至少70％，优选至少80％、90％或甚至至少95％的序列一致性，并且其中，所述突变序列编码抑制植物中配子体自交不亲和性的产物。示例性自交亲和性等位基因是SEQ ID NO：2、3和4，而这些自交亲和性等位基因的示例性编码基因序列是SEQ ID NO：6、7和8。

SEQ ID NO：5-8提供PSC基因的基因区序列(包括启动子区和终止子区)。其中的编码序列用大写表示。在SEQ ID NO：5-8(但不在SEQ ID NOs：1-4)中加下划线的是ITAG和PGSC基因模型之间的结构差异(加下划线的小写字母＝被误判为CDS，加下划线的大写字母＝被误判为内含子序列)。SEQ ID NO：1-4和SEQ ID NO：5-8之间(即1/5、2/6、3/7、4/8)的区别在于SEQ ID NO：1-4还包含相邻基因模型(Sotub12g029970)的编码外显子。

根据本发明，优选的核酸分子编码(WT)蛋白(如SEQ ID NO：9所示)的突变蛋白。

本发明还提供一种在植物中抑制配子体自交不亲和性的蛋白质，所述蛋白质包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种在植物中不抑制配子体自交不亲和性的蛋白质，所述蛋白质包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

基于图1的编号，相对于野生型(SI)蛋白质，突变蛋白质中的优选的改变的氨基酸残基选自由G10D、V37A、F42V、L47F、I56N、R69K、N97K、S110T、K146T、S156T、A167S、D169N、D190E、R214C、R235G和R249Q组成的组及它们的组合。更优选地，相对于野生型蛋白质(例如SEQ ID NO：9)，突变蛋白质中的改变的氨基酸残基选自由G10D、I56N、S110T、A167S、D169N、R214C和R249Q组成的组。优选的核酸分子编码含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或至少16个上述的改变的突变蛋白质。

优选的核酸分子包含编码SEQ ID NO：10中描绘的突变蛋白的核酸序列。

本发明的又一目的是提供一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与本发明的核酸分子或其互补序列杂交。

本发明的又一个目的是提供一种重组的核酸构建体，所述重组的核酸构建体包含根据本发明的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至在植物中起作用(优选在花粉中起作用)的启动子。

本发明的又一目的是提供一种载体，所述载体包含本发明所述的重组的核酸构建体。

本发明的又一个目的是提供一种植物原生质体、细胞(例如花粉)或愈伤组织，所述植物原生质体、细胞(例如花粉)或愈伤组织用本发明的重组的核酸构建体或本发明的载体转化，优选所述植物是马铃薯植物，更优选S.tuberosum组Tuberosum植物。

本发明的又一个目的是提供一种转化的植物，所述转化的植物由本发明的原生质体、细胞(例如花粉)或愈伤组织再生。

本发明的又一个目的是提供本发明的转化的植物的后代植物或克隆。

本发明的又一个目的是提供本发明的转化的植物的部分，其中，所述部分是分离的细胞、繁殖材料或分离的器官，优选块茎或种子。

本发明的又一目的是提供一种食品，所述食品由本发明的细胞、繁殖材料和器官中的至少一种制备。

本发明的又一目的是提供一种用于选择植物的方法，所述植物在其基因组中包含PSC的自交亲和性等位基因的至少一个拷贝，所述拷贝的产物在植物中抑制配子体的自交不亲和性，所述方法包含在所述植物的基因组中筛选有SEQ ID NO：1或5的野生型核苷酸序列的突变的等位基因或其天然存在的等位基因变体的存在，其中所述突变的等位基因或其天然存在的等位基因变体编码在所述植物中抑制配子体的自交不亲和性的基因产物。

本发明的又一个目的是提供一种生产植物的方法，所述植物在其基因组中包含PSC的自交亲和性等位基因的至少一个拷贝，所述拷贝的产物在植物中抑制配子体的自交不亲和性，所述方法包含以下步骤：

a)通过执行本发明的方法选择植物，以及将所选择的植物与另一植物或其自身杂交以产生种子，并且任选地将所述种子种植成植物。

b)将所述选择的植物与另一植物或其自身杂交以产生种子；

c)任选地将所述种子种植成植物以产生后代植物；

d)进一步任选地重复步骤b)和c)的杂交及种植步骤，以及

e)任选地从后代植物中选择所述等位基因以纯合或杂合形式存在的植物。

在根据本发明的生产植物的方法的一个优选实施方案中，步骤a)和/或e)中的所述选择通过使用诊断突变的等位基因的DNA标记的标记辅助选择来执行。

在根据本发明的生产植物的方法的另一优选实施方案中，所述植物是马铃薯植物，更优选地是Solanum tuberosum种的植物。

本发明的又一目的是提供一种植物，所述植物能通过根据本发明的生产植物的方法获得。

在本发明的该目的的一个优选实施方案中，根据本发明的方法因此获得的植物进一步包含以下抗性基因(例如一种或更多种Phytophthora infestans抗性基因)的至少一个等位基因：

-S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1，Chr11(位置～1.8Mb)；

-S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1，Chr10(位置～53Mb)；

-S.chacoense 543-5 Rpi-chc1，Chr10(位置～53Mb)；和

-S.venturii 283-1 Rpi-vnt1，Chr9(位置～51Mb)

本发明的又一目的是提供本发明的植物的植物部分，优选块茎或种子。

本发明的又一目的是提供一种食品，所述食品由本发明的植物部分制备。

本发明的又一目的是提供由本发明的核酸分子编码的或有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。

本发明的又一目的是提供如上所述的根据本发明的蛋白质作为抗原的用途。

本发明的又一目的是提供与本发明的抗原蛋白结合的抗体。这种抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。这种抗体可用于在植物中检测SC表型的试验。这种试验可以包含本领域技术人员熟知的ELISA试验或Western印迹分析试验。

本发明的又一方面是提供用于在植物花粉中表达基因的启动子，其中，该启动子是PSC基因的天然启动子。在优选的方面，启动子包含或由以下项组成：如SEQ ID NO：18或20所示的核酸序列和与SEQ ID NO：18或20有至少80％的序列一致性，优选至少90％，更优选至少95％或98％的序列一致性并且有在植物花粉中表达基因的启动子活性的序列。

在本发明的方面，本文中描述的核酸可以采取cDNA序列的形式。本文中所使用的术语“cDNA”是指由RNA逆转录的单链或双链互补DNA，优选mRNA。本发明的cDNA可包含内含子和外显子(例如本文所描述的内含子和外显子)，但优选仅包含外显子。

在本发明的方面，植物可以是转基因的或非转基因的、转化的或非转化的、重组的或非重组的。

本发明的方面也能执行并且还涉及除了马铃薯以外的其他作物。

从下面的描述中，本发明的其他目的和优点将变得更加明显。

附图说明

图1：比较来自SC植物(BL_17SC0100-0002_NODE_4559_lengt[SEQ ID NO：14]和PSC-PGSC0003DMT400043434[SEQ ID NO：10])与自交不亲和的植物(FO_D2_NODE_55467_length_4836_cov[SEQ ID NO：11]、FO_D8_NODE_78731_length_3613_cov[SEQ ID NO：12]、FO_D14_NODE_41388_length_7594_cov[SEQ ID NO：13]和DM-PGSC0003DMT400043434[SEQID NO：9])的F-box PP2-B10蛋白质序列的编号为1-266氨基酸。BL_17SC0100-0002_NODE_4559_lengt和PSC-PGSC0003DMT400043434是来自不同的自交亲和的马铃薯植株的序列，这两个序列是一致的(SEQ ID NO：10)。PSC-PGSC0003DMT400043434中的“PSC”是指该序列是自交亲和的植物序列在DM-PGSC0003DMT400043434(S.tuberosum组Phureja DM1-3中的自交不亲和的野生型基因(SEQ ID NO：1))基因模型上的序列投影。

图2：一种生产F1杂交体的育种方案，该F1杂交体涉及使PSC的自交亲和性等位基因失活。

图3：用于发展定位群体的杂交方案。

图4：两种基因型显示了围绕PSC基因的重组，定义其所必须位于的区间。字母a表示与PSC的自交亲和性等位基因相关的亲本单倍型，而字母b表示与PSC的自交亲和性等位基因无关的单倍型。箭头表示定义629kb区间的标记。

图5：来自群体18SC0011的12株植物显示出伪自交亲和性。字母a表示与PSC的自交亲和性等位基因相关的亲本单倍型，而字母b表示与PSC的自交亲和性等位基因无关的单倍型。来自群体18SC0012的两种基因型显示了围绕PSC基因的重组，定义其所必须位于的区间。箭头表示定义169kb区间的标记。

图6：两种重要重组体的基因型。字母“a”表示与PSC的自交亲和性等位基因相关的亲本单倍型，而字母“b”表示与PSC的自交亲和性等位基因无关的单倍型。箭头表示定义新区间的标记。该区间通过DM坐标表示。

图7：来自马铃薯参考基因组序列DM4.04的基因A(SEQ ID NO：1)的野生型S.tuberosum等位基因的基因组序列；来自自交亲和的马铃薯系DS的对应基因组序列，其包含PSC的自交亲和性等位基因(SEQ ID NO：2)；自交亲和的系BL_17SC0100-0002(SEQ IDNO：3)和自交亲和的系BL_17SC0100-0018(SEQ ID NO：4)。调控序列、内含子和非编码外显子的序列以小写表示，编码序列以大写表示。SEQ ID NO：1-4也以大写字母显示相邻基因的外显子。此外，一个外显子(No.2)看起来太小，并且在大写字母(即ITAG基因模型)中有一个额外的外显子。这已在SEQ ID NO：5-8中改正。

图8：四种不同来源的Phytophthora抗性基因(RPi＝Phytophthora infestans抗性基因)。来源是S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1(A)；S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1(B)；S.chacoense 543-5 Rpi-chc1(C)；和S.venturii 283-1 Rpi-vnt1(D)。

图9：三个亲本系的系谱。基于尽可能多地覆盖整个基因组的67个标记计算P1、P2和P3的纯合水平。(DS)，供体Sli基因，可育，近交耐受性(Hosaka and Hanneman，1998.Euphytica 103：265-271)。D1(黄色果肉，蒸煮品质好)和D16(早期，圆形，黄色)是选自瓦格宁根大学的二倍体育种计划的二倍体马铃薯(Hutten et al.，1994.Thesis，Wageningen University，Wageningen，ISBN 9054852925；Lindhout et al.，2011.PotatoRes.54，301-312)。

图10：一系列没有、有一个或有两个不同的Rpi基因的二倍体马铃薯杂交体的发展(A)。在(B)中描绘了农田试验的结果。

图11：用于制造有小的基因渗入的亲本系的选择步骤的示例。侧翼标记M2和M3用于确认RPi基因的存在。M1和M4用于知道基因渗入的最大尺寸。

图12：显示了六个BC2群体的1-4BC1植物(黑点)的轮回亲本百分比和这些BC2植物中的轮回亲本百分比(蓝点)的示例。

图13：显示了表示所发现的重组体的基因型的精细定位实验的结果。字母“a”表示与PSC的自交亲和性等位基因有关的亲本单倍型，而字母“b”表示与PSC的自交亲和性等位基因无关的单倍型。箭头表示定义区间的标记。该区间通过DM坐标表示。

图14：显示了图13中所描绘的扩展的精细定位实验的结果，其表示了所发现的进一步重组体的基因型。字母“a”表示与PSC的自交亲和性等位基因有关的亲本单倍型，而字母“b”表示与PSC的自交亲和性等位基因无关的单倍型。箭头指示定义区间的标记。该区间通过DM坐标指示。

图15：显示了代表实施例7中所描述的CAPS标记实验的结果的琼脂糖凝胶的照片。

图16：显示了PSC基因座的图示，该基因座包含展示在DM的第12号染色体(4.04版)上的基因PGSC0003DMG400016861的内含子-外显子结构，并从左到右表示终止子区(下游740bp)、3’UTR、外显子(编码序列，CDS)#3、内含子#2、CDS#2、内含子#1、CDS#1、3’UTR和启动子区(上游1563bp)。

图17：显示了实施例8中所描述的克隆到pBINPLUS载体中的合成的PSC基因的序列(SEQ ID NO：17)。

图18：显示了马铃薯植物花柱的UV显微图像，其可视化了实施例8中所描述的转基因和非转基因马铃薯植物中的花粉管生长。A：源自基因型18SC0012-180的PSC转基因的花柱。B：相同基因型但未转化的植物的花柱。

图19：显示了供体植物DS的PSC基因的天然启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。

图20：显示供体植物DS的PSC基因的编码序列(CDS)的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。

图21：显示了供体植物DS的PSC基因的截短的启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。

具体实施方式

本发明涉及马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因的识别和分离、马铃薯中的自交亲和性赋予基因、马铃薯中的PSC自交亲和性等位基因的克隆和功能分析及用编码PSC基因产物的自交亲和性等位基因的核酸转化马铃薯自交不亲和的系。使用本发明的组合和方法，对植物细胞进行遗传操纵，产生携带本发明的自交亲和性基因的植物。本发明的核酸分子、构建体和载体及使用它们的方法能用于生产含自交亲和性基因的植物，并选择自交亲和的马铃薯植物。

定义

本文中所使用的，术语“马铃薯”是指带有块茎的Solanum种。优选的马铃薯种是S.tuberosum。由于如本领域技术人员知晓的S.tuberosum植物的历史，S.tuberosum种的植物可以包括带有其他块茎的Solanum种(例如Solanum chacoense、Solanum phureja、Solanum andigena、Solanum demissum和/或不带有块茎的与S.tuberosum杂交的Solanum种(例如S.palustre、S.fernandezianum和S.etuberosum))的基因渗入片段。

本文中所使用的，术语“自交不亲和的”是指防止自体受精并因此迫使异交和异配的遗传机制。茄科植物，包括S.tuberosum的自交不亲和性，是涉及编码花粉决定因子的S-基因和编码雌蕊决定因子的S-RNase基因的机制的结果。S-RNases与花粉S-等位基因产物相互作用以抑制花柱中自交花粉管的生长。

本文中所使用的，术语“自交亲和的”是指克服了自体受精障碍的机制。

优选的马铃薯植物是Solanum tuberosum植物，优选如所描述的(WO2011/053135)二倍体、旺盛和必需的纯合子S.tuberosum马铃薯植物。

本文中所使用的，术语“纯合的”和“基本纯合的”植物表示所述植物中超过50％的基因组基因座，优选超过60％的基因组基因座，优选超过70％的基因组基因座，优选超过80％的基因组基因座，优选超过90％的基因组基因座，优选95％以上的基因组基因座是纯合的。

本文中所使用的，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸片段”、“分离的核酸片段”在此可互换使用。这些术语包括核酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链的RNA或DNA的聚合物，并且其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由一段或更多段cDNA、基因组cDNA、合成cDNA或它们的混合物组成。

术语“分离的”多核苷酸是指基本上不含其他通常在其天然存在的环境中伴随或与之相互作用的核酸序列(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA)的多核苷酸。然而，分离的多核苷酸可包含最初作为染色体外DNA存在，但在分离的多核苷酸内作为核苷酸插入而存在的多核酸序列。分离的多核苷酸可以从其天然存在的宿主细胞中纯化。优选地，分离的多核苷酸也基本上不含细胞内天然存在的其他物质(例如蛋白质和脂质)。

本领域技术人员公知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组的多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

本文中所使用的，“重组”是指如所描述的(例如Sambrook et al.1989.MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY or DNA Cloning：A Practical Approach，Vol.I and Il(Ed.D.N.Glover)，IRL Press，Oxford，1985.)通过使用限制性内切酶、连接酶和类似的基因工程技术操纵遗传物质而获得的核酸分子。本文中所使用的，术语“重组”并不是指天然存在的基因重组。

本文中所使用的，术语“表达(express)”或“表达(expression)”被定义为意味着转录和优选地还指翻译。调控元件可操作地连接至PSC基因的编码序列，从而使得调控元件能够控制PSC基因的表达。“改变的水平”或“改变的表达”是指在转基因生物中以不同于正常或非转化生物的量或比例生产基因产物。

本文中所使用的，关于启动子活性的短语“驱动...的表达”可与短语“启动...的转录”互换使用。

本文中所使用的，术语“PSC基因”是指编码PSC蛋白(即F-box蛋白PP2-B10)的基因。该基因被定义为以两种等位基因形式出现：PSC和psc。PSC是PGSC0003DMG400016861基因的显性等位基因，该基因负责基因型DS(IVP007-1001/4)中的自交亲和性。在一个实施方案中，PSC等位基因序列提供在SEQ-ID NO：2中。相反，psc是不同于PSC等位基因的PGSC0003DMG400016861基因的任何等位基因。在一个实施方案中，psc等位基因序列提供在SEQ-ID NO：1中。该psc等位基因不能赋予自交亲和性。

本文中所使用的，术语“基因”是指含可表达形式(例如可操作地连接至表达控制序列，并且还可包含终止区)的蛋白质编码或RNA编码序列的多核苷酸。基因的“编码序列”通常不包括表达控制序列，除非它们嵌入编码序列中。任选地，术语“编码序列”(CDS)是指基因的外显子，但可包括指外显子和内含子。

本文中所使用的，术语“等位基因”是指染色体上给定基因座(位置)的多种替代形式中的任何一种。等位基因可用于表示多态性的一种形式(例如双等位基因SNP可能有等位基因A和B)。等位基因也可用于表示给定的基因或染色体片段中两个或更多个SNP的等位基因的特定组合。群体中等位基因的频率是特定等位基因出现的次数除以该基因座的等位基因总数。术语“等位基因”和“基因”可在本发明的上下文中互换使用。

本文中所使用的术语，“编码(encoding)”、“编码(coding)”或“编码的(encoded)”，在特定核酸的语境下，意味着该核酸包含引导核苷酸序列翻译成特定蛋白质的必要信息。编码蛋白质的信息是通过使用密码子来指定的。编码蛋白质的核酸可以包含在核酸的翻译或转录区内的非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少这种介入的非翻译序列(例如cDNA中的)。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的结合，使得一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的影响(例如，在启动子能够影响编码序列的表达的情况下(即，编码序列在启动子的转录控制下))。启动子与编码序列能在有义或反义方向上可操作地连接至调控序列。

在本文中可互换地使用的术语“调控元件”或“调控序列”是指位于编码序列的上游(非编码序列)、内部或下游(非编码序列)的核酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列(5’非翻译区(UTR))、内含子、聚腺苷酸化识别序列和尾端序列(3’UTR)。

除了调控元件，本发明的构建体可包含启动子。术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的下游。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后面的元件通常称为增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性的核酸序列，并且可以是启动子的固有元件或者插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部衍生自天然基因(例如，这里公开的启动子特异性诱导花粉中PSC基因表达)，或由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的核苷酸片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或者在不同的发育阶段，或者响应于不同的环境条件的表达。例如，启动子的组织特异性通过特异性诱导花粉中PSC基因表达的启动子序列(如上所描述的)进行举例说明。使核酸片段在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常称为“组成型启动子”。不断发现可用于植物细胞的各种类型的新启动子；在汇编Okamuro andGoldberg.1989.Biochemistry of Plants 15：1-82.中可以找到许多示例。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全限定，不同长度的核酸片段可有相同的启动子活性。

除了调控元件，本发明的构建体可以包含翻译前导序列。术语“翻译前导序列”是指位于基因启动子序列和编码序列之间的核酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录至mRNA的加工、mRNA的稳定性或翻译效率。

根据本发明的基因产物可以包含RNA转录物。术语“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。在RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝的情况下，它被称为初级转录物，或者它可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且被称为成熟RNA。

“信使RNA(mRNA)”是指不含内含子并能被细胞翻译成多肽的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并衍生自mRNA模板的DNA。cDNA能是单链的，或用诸如DNA聚合酶I的Klenow片段转化为双链形式。

“正义”RNA是指包括mRNA的RNA转录物，因此能被细胞翻译成多肽。在特定核酸序列的上下文中使用的情况下，“反义”是指参考转录产物的互补链。

“反义RNA”是指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补并阻断靶基因表达的RNA转录物。反义RNA的互补性可以与特定核酸序列的任何部分互补，即在5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。

“功能性RNA”是指正义RNA、反义RNA、核酶RNA或其他可能未被翻译但仍对细胞过程有影响的RNA。

本文中所使用的术语“基因渗入(introgression)”、“基因渗入的(introgressed)”和“基因渗入(introgressing)”是指自然和人工过程及由此产生的事件，一个物种、品种或栽培品种的基因通过杂交被转移到另一个物种、品种或栽培品种的基因组中。该过程可任选地通过与回归亲本回交来完成。

“转化”是指转移核酸片段到宿主生物的基因组中，产生遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。植物转化方法的示例包括农杆菌介导的转化(De Blaere et al.1987.Meth.Enzymol.143：277)和颗粒加速的或“基因枪”转化技术(Klein et a/.1987.Nature(London)327：70-73；U.S.Pat.No.4,945,050，通过引用并入本文)。额外的转化方法描述于下文中。因此，本发明的分离的多核苷酸能合并到重组构建体，通常是能够引入到宿主细胞中并在宿主细胞中复制的DNA构建体中。这种构建体能是包括复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列的载体。本文中所使用的术语“载体”是指携带特定基因进入宿主细胞并使用细胞的蛋白质合成机制产生由该基因编码的蛋白质的DNA分子。该术语等同于术语“表达载体”。文献中已经描述了许多适用于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体(例如Pouwels etal.1985.Supp.1987.Cloning Vectors：A Laboratory Manual；Weissbach andWeissbach.1989.Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York；and Flevin et al.1990.Plant Molecular Biology Manual，Kluwer AcademicPublishers，Boston.)。通常，植物表达载体包括，例如，在5’和3’调控序列的转录控制下的一个或更多个克隆植物基因及显性可选择的标记。这种植物表达载体还能包含启动子调控区(例如，控制诱导的或组成的、环境调控或发育调控的或者细胞或组织特异性的表达的调控区)、转录启动起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

“蛋白质”或“多肽”是用过编码多肽的多核苷酸中的编码序列确定的特定顺序排列的氨基酸链。每个蛋白质或多肽有独特的功能。

本发明包括功能性PSC多肽和其功能性片段、及有相同生物学功能或活性的突变体和变体。本文中所使用的术语“功能性片段”、“突变体”和“变体”是指具有通过限定的功能试验识别的生物学功能或活性并且与细胞中特定的生物学、形态学或表型改变相关联的多肽。术语“PSC多肽的功能性片段”是指保留本文中所定义的PSC活性和功能的所有PSC片段。例如，功能性片段的大小能从能够结合抗体分子的小的多肽片段到能够参与细胞内表型变化的特征诱导或编程的大的多肽。此外，PSC的功能或活性能用于生物试验以识别PSC多肽或相关多肽的功能性片段。因此，PSC的两个同源直系物之间可有一定百分比的核苷酸序列一致性和与在其他系中发现的PSC基因的自交亲和性等位基因在氨基酸水平的相似性，并且编码这些多肽的基因优选表达在植物的花粉中，表明这些同源直系物有一部分确实有PSC生物活性的PSC多肽。

PSC一级氨基酸序列的自交亲和性等位基因的修饰可进一步产生有与本文所描述的PSC多肽基本等同的活性的突变体或变体蛋白质。这种修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以通过氨基酸序列的自发变化发生，其中这些变化产生的修饰的多肽有与PSC多肽基本等同的活性。只要存在PSC的生物活性，通过对PSC一级氨基酸序列进行小的修饰而产生的任何多肽都包括在本文中(例如，在产生植物自交亲和性的通路中起作用)。

能使用根据本发明的各种技术克隆编码PSC蛋白的基因。最简单的PSC基因克隆步骤需要从被识别为产生PSC蛋白的生物体中克隆基因组DNA，并将克隆在合适的质粒或载体上的DNA转移到不产生PSC蛋白的宿主生物中，然后识别已赋予产生PSC蛋白能力的转化宿主。转化的赋予PSC的DNA能被切割成更小的片段，并且可以进一步表征保持赋予PSC能力的最小片段。适合通过同源以克隆的技术包括使用源自保守序列的引物通过DNA杂交或聚合酶链反应(PCR)扩增进行标准文库筛选。本文中所定义的使用诸如CLUSTAL或PILEUP的算法，在至少80％(优选至少85％和最优选90％)的核苷酸与序列的定义长度上匹配的情况下，优选在该序列的完整长度上，则两个DNA序列基本上同源或相同。基本上同源的序列能在本领域公知的严格条件下在Southern杂交实验中识别。参见例如Sambrook et al.，上文。Sambrook et al.描述了高度严格的条件，即杂交温度比完美匹配的靶标和探针的Tm低5-10℃；因此，“基本同源”的序列将在这种条件下杂交。

本文中所使用的，“基本相似”是指核酸片段其中的一个或更多个核苷酸碱基的变化产生一个或更多个氨基酸的替换，但不影响由核酸序列编码的多肽的功能性质。“基本相似”还指本发明的核酸片段的修饰(例如不基本影响产生的转录物的功能性质的核苷酸的缺失或插入)。因此，应当理解，本发明不仅包括特定的示例性核苷酸或氨基酸序列，还包括它们的功能等价物。

改变核酸片段使得在给定位点产生化学上等价的氨基酸但不影响编码的多肽的功能性质在本领域中是熟知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一较少疏水性残基(例如甘氨酸)或更多疏水性残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子替代。类似地，使得一个带负电荷的残基替换另一个(例如天冬氨酸替换谷氨酸)或一个带正电荷的残基替换另一个(例如赖氨酸替换精氨酸)的变化也可以预期产生功能上等价的产物。所提出的每一种修饰在本领域的常规技术之内，编码产物的生物活性的保留的确定也是如此。选择影响多肽在病毒或宿主细胞(真核生物，如植物、酵母、真菌或藻类)中表达水平的分离的多核苷酸的方法可包含以下步骤：构建本发明的分离的多核苷酸或本发明的分离的嵌合基因；将分离的多核苷酸或分离的嵌合基因引入宿主细胞；测量含分离的多核苷酸的宿主细胞中多肽的水平；以及将含分离的多核苷酸的宿主细胞中的多肽水平与不含分离的多核苷酸的宿主细胞中的多肽水平进行比较。

此外，基本相似的核酸片段也可通过它们的杂交能力来表征，特别是在严格条件下。在本领域技术人员熟知的严格条件下通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交估计这种同源性(Nucleic Acid Hybridization，1985.Hames and Higgins，Eds.，IRL Press，Oxfbrd，U.K.)。能调控严格条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，筛选高度相似的片段(例如从近缘生物中复制功能酶的基因)。

因此，本发明涵盖编码PSC多肽并在严格条件下与本文公开的PSC核酸序列或其片段杂交的分离的核酸序列。

本发明的基本相似的核酸片段也可以它们编码的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列的如本领域技术人员通常采用的算法所确定的一致性百分比为特征。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。因此，可以使用数学算法来确定任意两个序列之间的一致性百分比。这种数学算法的非限制性示例是Myer和Miller的算法(Myers and Miller，1988.CABIOS 4：11-17)，Smith等人的局部同调算法(1981.Adv.Appl.Math，2：482)；Needleman和Wunsch的同源比对算法(1970.J.MoI.Biol.48：443-453)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法(1988.Proc.Natl.Acad.Sci 85：2444-2448)；Karlin和Altschul的算法(1990.Proc.Natl.Acad.ScL USA 87：2264)，Karlin和Altschul修改的算法(1993.Proc.Natl.Acad.ScL USA 90：5873-5877)。

能够利用计算机实现这些数学算法来比较序列以确定序列一致性。这种实现包括但不限于：PC/基因程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，Mountain View，Calif.获得)；ALIGN程序(2.0版)和GAP、在威斯康星遗传学软件包第8版中的BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可从Genetics Computer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wis.，USA获得)。使用这些程序的比对能用默认参数来执行。

除非另有说明，否则使用Lasergene生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalignment程序或任何等价程序执行序列比对和一致性百分比的计算。除非另有说明，否则使用默认参数(空位罚分(GAP PENALTY)＝IO，空位长度罚分(GAPLENGTH PENALTY)＝I.O)下的Clustal W比对方法(Higgins and Sharp(1989.CABIOS 5：151-153))能够进行序列的多重比对，而使用Clustal W方法的配对比对的默认参数是空位罚分＝IO、空位长度罚分＝LO、慢精确(Slow-Accurate)。还能使用肌肉(Edgar，2004.Nucleic Acids Res 32：1792-7)参数“-clw”进行蛋白质比对，以生成ClustalW格式的输出格式。

本文中所使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列一致性”或“一致性”是指在指定的比较窗口上比对最大对应的情况下，两个序列中的相同残基。在参照蛋白质使用序列一致性百分比的情况下，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基替代，因此不改变分子的功能性质。

本文中所使用的，“序列一致性百分比”意味着通过比较比较窗口上的两个最佳比对的序列(优选在序列的全长上)而确定的值，其中，相较于参考序列(不包含添加或缺失)，比较窗口中的部分的多核酸序列可以包含添加或缺失(即空位(gap))，以实现两个序列的最佳对齐。确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量，以得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得出序列一致性的百分比。

本文中所使用的“参考序列”可以指为了确定序列相似性，用作序列比较的基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体(例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列)。本文中的术语“参考序列”也用于确定基因在参考基因组序列中的位置。基因的位置由参考基因组序列的对应坐标表示。本文中的所有坐标是基于DM4.03和DM4.04。根据本发明，用于突变的等位基因的参考序列是野生型序列，优选DM4.04序列。如本文中所提及的，DM4.04序列是基于v4.04伪分子的双单倍体S.tuberosum组克隆DM1-3(DM)(Hardigan et al.，2016，Plant Cell，doi：10.1105/tpc.15.00538)。

多核苷酸序列的术语“基本一致性”意味着使用标准参数下的一个所描述的对比程序与标准序列进行比较，多核苷酸包含有至少80％序列一致性、优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％序列一致性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框马铃薯等，可以适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应一致性。用于这些目的的氨基酸序列的基本一致性通常意味着至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列一致性。优选地，使用Needleman等人(1970.J.MoI.Biol.48：443)的同源比对算法进行最佳比对。

核苷酸序列基本相同的另一个表示是两个分子是否在严格条件下相互杂交。通常，在定义的离子强度和pH下，严格的条件被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。然而，如本文另外限定的，严格的条件包括在约1℃至约20℃的范围内的温度，这取决于期望的严格程度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分(substantial portion)”包含足以提供该氨基酸或核酸序列所包含的蛋白质或基因的推定识别的氨基酸或核苷酸序列。氨基酸和核苷酸序列能由本领域技术人员手动评估，或者通过使用采用诸如BLAST的算法的基于计算机的序列比较和鉴定工具来评估。通常，必需10个或更多个连续氨基酸的序列或者30个或更多个连续核苷酸的序列来推定地识别多肽或核酸序列与已知蛋白质或基因同源。此外，至于核苷酸序列，含30个或更多个连续核苷酸的基因特异的寡核苷酸探针可用于基因鉴定和分离的序列依赖方法。此外，12个或更多个核苷酸的短寡核苷酸可用作PCR中的扩增引物，以获得含引物的特定核酸片段。因此，核酸序列的“基本部分”包含提供含该序列的核酸片段特定的识别和/或分离的核苷酸序列。本说明书教导了编码包含特定植物蛋白的多肽的氨基酸和核苷酸序列。受益于本文报道的序列，技术人员现在可以出于本领域技术人员公知的目的使用公开的序列的全部或大部分。因此，这种部分代表“基本部分”，并能用于建立“基本一致性(substantial identity)”，即，与参考序列sorghum相比，至少80％的序列一致性。因此，本发明包含如所附的序列列表中所报告的完整序列以及如上定义的那些序列的基本部分。

本发明还包括所公开的核苷酸序列和其编码的蛋白质的片段和变体。“片段”是指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及由此编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可编码保留天然蛋白质的生物活性并因此有PSC样活性(PSC-like activity)的蛋白质片段。可替代地，用作杂交探针的核酸序列的片段可以不编码保持生物活性的片段蛋白。

“变体”是指基本上相似的序列。对于核酸序列，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码本发明的PSC多肽之一的氨基酸序列的那些序列。能够使用众所周知的分子生物学技术来鉴定诸如这些天然存在的等位基因变体(例如，使用聚合酶链反应(PCR)，一种用于扩增特定DNA片段的技术)。通常，本发明的特定核酸序列的变体与通过本文中别处描述的序列比对程序确定的该特定核酸序列的序列一致性通常至少约90％，优选至少约95％，更优选至少约98％。

“变体蛋白质”是指通过缺失(所谓的截短)或在天然蛋白质的N端和/或C端添加一个或更多个氨基酸而衍生自天然蛋白质的蛋白质；在天然蛋白质中的一个或更多个基因座缺失或添加一种或更多种氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或更多个位点替换一种或更多种氨基酸。本发明所包括的变体蛋白质有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的期望的生物活性，即如本文所述的PSC样活性。这种变体可以起因于例如遗传多态性或人类操纵。本发明的天然PSC蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列有至少约90％，优选至少约95％和更优选至少约98％的如本文其他地方描述的序列比对程序确定的序列一致性。本发明的蛋白质的生物活性变体可与那个蛋白质的不同之处仅为1-15个氨基酸残基，或甚至1个氨基酸残基。

本发明的多肽可以用各种方式改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。可以通过组合本发明的蛋白质的元件和片段及与其他蛋白质来创造有感兴趣的特性的新型蛋白质。用于这种操作的方法在本领域中是公知的。因此，本发明的基因和核苷酸序列既包括天然存在的序列，也包括突变形式。

类似地，本发明的蛋白质包括天然存在的蛋白质及其变体和修饰形式。这些变体将继续具有期望的PSC活性。显然，将在编码变体的DNA中进行的突变不得将序列置于阅读框之外，并且优选不会创造能产生二级mRNA结构的互补区。

本文所包括的蛋白质序列的缺失、插入和替换预期不会产生蛋白质特性的根本性变化。然而，在难以预先预测替换、缺失或插入的确切效果的情况下，本领域技术人员将理解，将通过常规筛选分析来评估效果，其中可以观察到PSC蛋白的效果。

“密码子简并性”是指允许核苷酸序列变化而不影响编码多肽的氨基酸序列的遗传密码的差异。因此，本发明涉及含编码全部或大部分的本文所述氨基酸序列的核苷酸序列的任何核酸片段。

应当理解，本文中所使用的术语“转基因”包括其基因型已被异源核酸的存在改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，该异源核酸包括那些最初如此改变的转基因以及那些由来自初始转基因的有性杂交或无性繁殖创造的转基因。本文中所使用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(例如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)对基因组(染色体或染色体外)的改变。

本文中所使用的术语“向导RNA(gRNA)分子或单一gRNA分子(sgRNA)”是指识别感兴趣的靶DNA区并引导相关的核酸酶在那里编辑的特定单一RNA序列。所述gRNA优选包含与靶DNA互补的17-20个核酸序列和相关核酸酶的结合支架。

本文中所使用的，术语“CRISPR相关的核酸内切酶(CAS)”是指由gRNA或CRISPR引导至靶DNA的核酸内切酶。所述靶DNA随后被核酸内切酶切割。所述CRISPR相关的核酸内切酶可以是Cas9(例如从Streptococcus pyogenes中分离的)、Cpf1(例如从Francisellanovicida中分离的)、C2c1、C2c2和C2c3或它们的变体(Nakade et al.，2017.Bioengineered 8：265-273)。

本文中所使用的术语“植物”包括指完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞(包括花粉)和它们的子代。应当理解，在本发明的范围内，部分转基因植物包含例如来源于转基因植物的植物细胞(包括花粉)、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、块茎、叶、根，或它们的先前用本发明的DNA分子转化的因此至少部分由转基因细胞组成的子代，也是本发明的目的。

本文中所使用的术语“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类一般与适于转化技术的高等植物种类一样广泛，包括单子叶植物和双子叶植物。

在我们理解中，PSC的成功克隆是植物自交亲和性调控机制的重要步骤。破译该系统产生可以近交而不会出现近交衰退的植物的机制，将有助于改善马铃薯和许多其他植物物种(例如茄科植物、蔷薇科车前草科和玉蜀黍属)的植物育种。

核酸构建体

在第一个实施方案中，本发明提供了含马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子是含如图7中提供的SEQ ID NO：1所示的基因A的野生型S.tuberosum等位基因的突变序列的核酸分子，所述突变序列与SEQ IDNO：1有至少70％，优选至少80％、90％或甚至至少95％的序列一致性，由此所示野生型基因A编码赋予植物配子体的自交不亲和性的产物，并且其中，所述突变序列编码抑制植物配子体的自交不亲和性的产物。

SEQ ID NO：1描绘了来自马铃薯参考基因组序列DM4.04的参考序列。马铃薯自交亲和性(PSC)基因位于第12号染色体的核苷酸59034522和59042307之间。来自该基因组区的转录物的马铃薯基因组测序联盟(PGSC)注释是PGSC0003DMT400043434，而该基因的名称是PGSC0003DMG400016861。该基因的ITAG注释是Sotub12g029960.1.1。已知的RefSeq序列是蛋白质序列RefSeq XP_015165222.1和mRNA序列RefSeq XM_015309736.1(F-box基因)。

如下面实施例3中所描述的，定位实验将基因的位置缩小为12.6kb的区间(图13和图14)，位于第12号染色体上的核苷酸59030880和59042436之间。两个基因位于该12.6kb区间中，PGSC0003DMG400016861(有作为替代基因模型的ITAG注释Sotub12g029960)和PGSC0003DMG400016860(有作为替代基因模型的ITAG注释Sotub12g029970)。对于基因PGSC0003DMG400016860，认为ITAG注释Sotub12g029970代表最真实的模型，因为ITAG注释是指可以存在额外的外显子的更大的序列，证明PGSC注释是截短的。然而，更详细的定位、变化分析(实施例4)和RNA-seq表达分析(实施例6)显示了Sotub12g029970排除作为PSC基因。在基因模型PGSC0003DMG400016861的情况下，对应的ITAG注释Sotub12g029960.1.1包含一个额外的(不正确的)外显子，而第二外显子被预测为太小。因此，取消了PSC基因的ITAG模型Sotub12g029960..1.1。相反，PGSC注释PGSC0003DMG400016861显示由RNA-seq数据完全支持(实施例6)。因此，这里公开的PGSC0003DMG400016861为正确的基因模型。因此，本发明提供了PGSC0003DMG400016861的序列作为PSC基因。该区位于负链上，以Sotub12g029970(nt：59042307)的最后一个编码序列开始，并包括启动子区、编码序列和包括终止子(终止于nt：59034522)的区，由此，基于DMv4.03/v4.04基因组组合体(参见图16)编号，并以由较高坐标朝向较低坐标的顺序进行。

来自编码PSC的自交亲和性等位基因的自交亲和的马铃薯系的对应基因组序列提供在图7的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中，其中假定的编码基因序列窄化为如图7中提供的对应序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。SEQ ID NO：1的自交不亲和的基因组序列(和不包括仍然存在于SEQ ID NO：1中的相邻基因序列的窄化基因序列SEQ ID NO：5)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的“自交亲和的”(SC)基因组序列之间的变化描绘表1中。

本领域技术人员应当理解SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的基因序列的改变可以发生在编码基因序列中，但也可以发生在启动子或终止子(或任何其他调控)区中。优选地，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的基因序列改变发生在启动子中，已知这对基因的调控或组织特异表达至关重要。更优选地，启动子区由SEQ ID NO：18表示，或者启动子区与有至少70％、80％、90％或更优选95％的序列一致性，并且驱动PSC基因在花粉中的表达。

在本发明的一些优选实施方案中，如图7所示，在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8中提供了PSC的自交亲和性等位基因，更广泛地作为基因序列SEQ ID NO：5中的改变。

编码马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因或其功能部分的优选分离的核酸分子优选包含表1描述的一种或更多种改变，优选至少两种所述改变，优选至少十种所述改变，优选至少二十种所述改变，更优选所有所述改变。

本发明还提供赋予马铃薯植物自交亲和性的分离的核酸分子(编码蛋白质)，所述分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列和与它们有至少70％、至少80％、至少90％或其95％的序列一致性并且(编码蛋白质)赋予马铃薯植物自交亲和性的序列。优选地，所述分离的核酸分子包含在植物中有功能(允许表达)的可操作连接的启动子，优选地在马铃薯植物的花粉中有功能(允许表达)。优选地，所述启动子包含有至少100、200、300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000或至少6000个连续核苷酸残基的核酸序列，所述连续核苷酸残基存在于由DM4.04参考序列的nt：59042307至nt：59034522表示的核酸序列区中，除了所述启动子包含表1中提及的一个或更多个改变，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个所述改变，优选至少15、20、50、100或至少200个所述改变，更优选所有所述改变(其中，表1的改变位于所述启动子中的对应位置)。更优选地，所述启动子(区)中的所述一个或更多个改变选自表1中最后提及的一个或更多个改变(即，位置59042302处的改变，其是位于编码区最上游的改变)，直至并包括表1中位置59036043处的(第310个)改变(在所述表1中从下到上计数的情况下)。在表1中所述最后提及的改变(即在位置59042302处的改变)和表1中位置59036043处的所述第310个改变(即在从下到上计数的情况下)之间的所有改变都明确地包括在所述一个或多个改变的组中。以相同的方式，所述启动子(区)中的所述一个或更多个改变选自表1中最后提及的一个或更多个改变(即位置59042302处的改变)，直至并包括表1中位置59040009处的(第91个)改变(在从下到上计数的情况下)。在表1中最后提及的改变(即，位置59042302处的改变)和表1中位置59040009处的第91个改变(在从下到上计数的情况下)之间的所有改变明确地包括在所述一个或更多个改变的组中。优选启动子区如图16所示，更优选启动子是SEQ ID NO：18。

进一步优选的改变包含存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的一个或更多个改变，优选至少两个存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的所述改变，优选至少十个所述改变，优选至少二十个所述改变，更优选所有存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的改变。

带有编号107061040的基因编码带有UniProt编号M1BEM0(M1BEM0_SOLTU)的蛋白质。M1BEM0编码假定的F-box蛋白PP2-B10样。本文中M1BEM0的参考序列提供为SEQ ID NO：9。

F-box蛋白涉及Skp1-Cullin-F-box(SCF)复合物，该复合物通过识别蛋白质并用泛素标记它们以进行降解而在蛋白酶体降解途径中起作用。F-box蛋白PP2-B10的F-box结构域涉及与SCF复合物中其他蛋白质的相互作用，而PP2结构域涉及糖组分的识别(Stefanowicz et al.，2015.Critical Rev Plant Sci 34：523-552)。在对自交亲和的植物特异的F-box蛋白中总共识别出6个非同义突变(参见SEQ ID NO：10)。在这些突变中的一个，R249Q在类似的F-box蛋白中不常见，并且可能导致识别结构域的特异性改变。此外，在该基因的启动子区发现了多种小和大的插入和缺失以及许多替换。最明显的是，533nt的PSC特异性插入被发现自ATG的位置-108处(在与DM比较的情况下)，而该位置在其他SI-植物中因为193nt的缺失(-85至-278nt)并不存在。已知起始密码子上游的-50nt至-150nt区包含对启动协同转录至关重要的元件。在不希望受任何理论束缚，认为这和启动子区中的其他变化最终导致如实施例6所示的改变的表达模式。在茄科植物自交不亲和性系统中，F-box蛋白涉及在亲和授粉期间花粉管中分泌的花柱S-RNase的解毒(Li et al.，2016.PlantJ 87：606-616)。此外，已知S-RNases是糖基化的(Broothaerts et al.，1991.SexualPlant Reprod 4：258-266)。因此，F-box PP2-B10蛋白的表达改变和可能改变的识别特异性产生自交亲和性也就不足为奇了。该基因在自交花粉管中的表达很可能产生自体S-RNases的识别和降解，从而允许自体受精。

来自SC植物F-box PP2-B10蛋白质序列与自交不亲和的植物的比较参见图1。

含基因A的PSC等位基因的分离的核酸分子，优选编码这样一种蛋白质，该蛋白质在SC序列(BL_17SC0100-0002_NODE_4559_lengt和PSC-PGSC0003DMT400043434)中相对于任何一个SI序列(FO_D2_NODE_55467_length_4836_cov、FO_D8_NODE_78731_length_3613_cov、FO_D14_NODE_41388_length_7594_cov和DM-PGSC0003DMT400043434)包含如图1所示的改变的(替代的)氨基酸残基中的至少一个，更优选如图1所示的改变的氨基酸残基的至少两个，更优选如图1所示的改变的氨基酸残基的至少三个、四个、五个、六个或七个，更优选如图1所示的的所有改变的氨基酸残基。所述分离的核酸分子包含PSC的自交亲和性等位基因，优选编码其中至少第56位的异亮氨酸氨基酸残基被天冬酰胺取代，从而产生I56N的蛋白质。包含PSC等位基因的所述分离的核酸分子优选编码其中至少249位的精氨酸氨基酸残基被谷氨酰胺取代，从而产生R249Q的蛋白质。

含根据本发明的核酸分子的重组的核酸构建体优选可操作地连接至在植物中起作用(优选在生长的花粉管中起作用)的启动子。

优选的重组的核酸构建体存在于载体中。因此，本发明还提供含本发明的重组的核酸构建体的载体。更具体地，本发明提供一种载体，其包含编码蛋白质的分离的、合成的或重组的核酸序列或者其功能性片段或功能高度同源的序列，该蛋白质包含如图1所示的改变的氨基酸序列中的至少一个。合适的载体的示例是细菌人工染色体(BAC)载体(例如BeloBACII、pBINplus、pKGW-MG或任何其他市售克隆载体)。

如下面将概述的，有多种能将本发明的核酸转移到植物的方式。一种合适的转移手段由农杆菌介导的，其中待转移的核酸是二元载体的一部分，因此优选上面描述的载体是二元载体。另一种合适的手段是通过将表达含如图1描绘的至少一个改变的氨基酸序列的蛋白质或其功能性片段或功能高度同源序列的植物与不包含该基因(即，PSC基因的PSC等位基因)的植物杂交，并识别那些遗传了编码含如图1描绘的至少一个改变的氨基酸序列的蛋白质的基因或其功能性片段或功能性高度同源序列的杂交后代。

本发明进一步提供含如本文所描述的核酸或载体的宿主细胞。优选的宿主细胞的示例是适合于BAC克隆(例如DH10B)或农杆菌细胞的大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含植物细胞。优选的植物细胞是源自茄科植物的细胞，甚至更优选的所述植物细胞包含来自S.tuberosum的细胞，优选如所描述(WO2011/053135)的二倍体、旺盛和必需纯合的S.tuberosum马铃薯植株。通过包括例如再生方案的本领域技术人员熟知的方法，可以从这种细胞中获得转基因或基因修饰的植物。

方法

本发明进一步提供了一种用于选择S.tuberosum植物的方法，所述方法包括在所述S.tuberosum植物的基因组中筛选如权利要求1中定义的突变体序列的存在。所述突变体序列优选包含表l中描绘的一个或更多个改变，优选至少两个所述改变，优选至少十个所述改变，优选至少二十个所述改变，更优选所有所述改变。

进一步优选的改变包含存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的一个或更多个改变，优选至少两个存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的所述改变，优选至少十个所述改变，优选至少二十个所述改变，更优选存在于PGSC0003DMG400016861的编码部分中的所有改变。

本发明进一步提供一种生产植物的方法，该植物在其基因组中包含马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因的至少一个拷贝，其产物抑制植物中的配子体自交不亲和性，所述方法包含以下步骤：a)通过执行根据本发明的选择方法来选择植物并将所选择的植物与其自身或另一植物杂交以产生种子，以及任选地将所述种子生长成植物；b)将所选择的植物与另一植物或其自身杂交以产生种子；c)任选地将所述种子种植成植物以产生后代植物；d)进一步任选地重复步骤b)和c)的杂交及种植步骤，以及e)任选地从后代植物中选择所述等位基因在其中以纯合或杂合形式存在植物。

步骤a)和/或e)中的所述选择优选通过使用针对突变的等位基因的多态性标记的标记辅助选择来执行。合适的标记提供在表1中。

在这种方法的优选实施方案中，所述植物是茄科植物的成员，甚至更优选所述植物是马铃薯植物，更优选S.tuberosum种的植物，更优选如所描述(WO2011/053135)的二倍体、旺盛和必需纯合的S.tuberosum马铃薯植株。

本文中描述的含PSC的自交亲和性等位基因的核酸分子的基因渗入可以通过使用传统的育种技术来适当地实现。基因优选通过标记辅助选择(MAS)或标记辅助育种(MAB)导入马铃薯系。MAS和MAB涉及使用一种或更多种分子标记来识别和选择含编码期望的性状的一种或更多种基因的后代植物。在本示例中，这种识别和选择是基于本发明的基因或与其相关联的标记的选择。MAS还能用于发展携带感兴趣基因的近等基因系(NIL)或基因等基因重组体(QIR)的产生，允许对每个基因效应进行更详细的研究，并且也是发展回交自交系(BIL)群体的有效方法。根据该实施方案发展的马铃薯植物可以有利地从受体植物获得它们的大多数特性，并且从供体植物获得PSC的自交亲和性等位基因。

现在可用的标记允许仅渗入自交亲和的马铃薯植株第12号染色体的端粒区的部分。所述区涵盖了如权利要求1所定义的突变基因，但优选不包含来自自交亲和的供体植物的基因组序列，这些序列至SOT12-58962004。优选至SOT12-59016142是着丝粒的，和/或至SOT12-59130723，优选至SOT12-59043512是端粒的。

基于本文中描述的核酸序列，本发明还提供探针和引物，即如本文描述的与DNA链互补的寡核酸序列，或与互补链互补的寡核酸序列。所述引物和探针例如可用于PCR分析。基于本文中描述的核酸序列的引物非常有助于在经典育种和/或通过对植物的核酸含量进行遗传修饰而育种领域中活跃的植物育种者，并有助于选择能够表达PSC或其功能性片段或功能高度同源序列的植物。

优选地，从所述植物中分离待测植物的核酸，并且使获得的分离的核酸与一种或更多种引物和/或探针接触。例如，能使用PCR分析来测试植物在植物基因组中是否存在PSC的自交亲和性等位基因。这种方法在如WO 03/010319中所描述的无标记转换方案中是特别优选的。

植物

本发明进一步提供根据本发明用重组的核酸分子转化，优选根据本发明的重组的核酸构建体或根据本发明的载体的载体转化的植物原生质体、细胞或愈伤组织。所述植物优选地是马铃薯植物，更优选地是S.tuberosum组的马铃薯植物，甚至更优选地是WO2011/053135中所描述的二倍体、旺盛和必需纯合的S.tuberosum马铃薯植株。

包含PSC基因的自交亲和性等位基因或其PSC-赋予部分的核酸分子可以通过任何可用的方法转移到合适的受体植物。例如，所述核酸分子可以通过杂交含PSC的自交亲和性等位基因的植物与所选择的育种系来转移，即通过基因渗入、通过转化、通过原生质体融合、通过双单倍体技术或通过胚挽救或通过任何其他核酸转移系统，任选地随后通过评估标记，和/或表现出自交亲和性，选择含PSC的自交亲和性等位基因的后代植物。

对于转基因转移方法，可以通过使用本领域公知的方法从供体植物中分离含PSC的核酸分子，并且可以通过转基因方法(例如通过载体、配子或任何其他合适的转移元件(例如用包覆有所述核酸序列的颗粒轰击))，将如此分离的核酸分子转移到受体植物中。

所述核酸分子优选包含如权利要求1所定义的编码PSC的分离的核酸分子。所述核酸分子优选包含编码具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质的重组的核酸构建体。所述核酸分子优选包含具有SEQ ID NO：2、3和/或4、或SEQ ID NO：6、7和/或8或者它们的组合或部分的重组的核酸构建体。

植物转化通常涉及构建有在植物细胞中起作用的表达盒的载体。在本发明中，这种载体由含PSC的自交亲和性等位基因的核酸序列组成，该基因可以在调控元件(例如启动子)的控制下或可操作地连接到调控元件。表达载体可以包含一个或更多个这样的可操作连接的基因/调控元件组合，只要组合中包含的基因中的至少一个赋予自交亲和性。载体可以是质粒的形式，并且能单独或与其他质粒结合使用，使用本领域公知的转化方法(例如农杆菌转化系统)，以提供展现出自交亲和性的转基因植物。

表达载体能包括至少一个标记基因，该标记基因可操作地连接至调控元件(例如启动子)，允许通过阴性选择(通过抑制不包含可选择标记基因的细胞的生长)或通过阳性选择(通过筛选标记基因编码的产物)恢复含标记的转化细胞。本领域中公知许多常用的用于植物转化的可选择标记基因，并且包括例如编码酶的基因，所述酶的代谢解毒选择性化学剂可以是抗生素或除草剂，或者编码对抑制剂不敏感的改变的靶点的基因。本领域公知几种正选择方法(例如甘露糖选择)。可替代地，无标记转化能用于获得没有提及的标记基因的植物，该技术是本领域公知的。合适的标记基因描述于Miki和McHugh，2004中(Mikiand McHugh，2004.J Biotech 107：193-232)。

将表达载体引入植物的一种方法是基于农杆菌的天然转化系统(参见例如Horschet al.，1985.Science 227：1229-1231)。A.tumefaciens和A.rhizogenes是对植物细胞进行遗传转化的植物致病菌。A.tumefaciens和A.rhizogenes的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。将表达载体引入植物组织的方法包括植物细胞与Agrobacteriumtumefaciens的直接感染或共培养。US专利编号5591616中提供了用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述。在Gruber和Crosby，1993中能找到植物表达载体和报告基因的大致描述及农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移的方法的转化方案和描述(Gruber and Crosby，.1993，Vectors for plant transformation，in Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology(Glick，B.R.and Thompson，J.E.，eds.)，CRC，Boca Raton，FL)。培养植物组织的一般方法由例如Miki等人(Miki et al.，1993.In：B.R.Glick and J.E.Thompson，eds.Techniques in plant molecular biology andbiotechnology.CRC Press Inc.)和Tavazza等人，1989(Tavazza et al.，1989.PlantScience 59：175-181)提供。用于分子克隆技术和合适的表达载体的适当参考手册是Sambrook和Russell，2001(Sambrook J and Russell DW(2001)Molecular cloning：alaboratory manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)

将表达载体引入植物的另一种方法是基于微投射介导的转化(粒子轰击)，其中，在微投射表面携带DNA。将表达载体引入植物组织中，其具有使微射弹加速至300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜。利用生物装置将微射弹加速到足以穿透植物细胞壁和细胞膜的300至600m/s的速度，将表达载体引入植物组织中。

将DNA引入植物的另一种方法是通过靶细胞的超声处理。可替代地，脂质体或球质体融合已经用于将表达载体引入植物。使用CaCl₂沉淀、聚乙烯基酒精或聚-L-鸟氨酸将核酸直接摄取到原生质体中也有报道。原生质体及整个细胞和组织的电穿孔也有描述。

其他熟知的技术，例如使用BACs，其中将部分马铃薯基因组引入细菌人工染色体(BACs)，即用基于在大肠杆菌中发现的自然发生的F因子质粒在大肠杆菌细胞中克隆DNA片段(100-300kb插入大小；平均150kb)的载体，可以与BIBAC系统结合使用，以产生转基因植物。

在马铃薯靶组织转化之后，上面描述的可选择标记基因的表达允许使用本领域熟知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物。

在用于生产展现出自交亲和性的马铃薯植物的替代实施方案中，原生质体融合能用于将核酸从供体植物转移到受体植物。原生质体融合是两个或更多个原生质体(其细胞壁通过酶处理被去除)之间的诱导或自发联合(例如体细胞杂交)，以产生单个双核或多核细胞。甚至可以用自然界中不能杂交的植物物种获得融合的细胞，通过组织培养，形成一种展现出理想的性状组合的杂交体植物。更具体地，能从自交亲和的马铃薯植物中获得第一原生质体。第二原生质体能从第二马铃薯植物中获得，优选包含商业上有价值的特性的马铃薯系(例如但不限于抗病性、抗虫性、有价值的块茎特性等)。然后使用本领域熟知的传统原生质体融合方法融合原生质体。

可替代地，胚挽救可采用于将含如本文所描述的PSC的自交亲和性等位基因的核酸从供体植物转移到受体植物中。胚挽救能用作从杂交分离胚的步骤，其中植物不能产生活种子。在该过程中，组织培养植物的受精子房或未成熟种子以创造新植物。

本发明进一步提供根据本发明从原生质体、细胞或愈伤组织再生的转化的植物。所述转化的植物包含本发明的重组的核酸分子，优选权利要求10中所述的重组的核酸构建体或权利要求11中所述的载体，优选以同源重组取代S.tuberosum植物的内源基因组序列的形式存在。

本发明进一步提供了转化的植物的一部分，其中，所述部分优选是分离的细胞、繁殖材料或分离的器官，优选块茎或种子。

本发明进一步提供一种植物，所述植物通过用于生产在其基因组中含根据本发明的马铃薯自交亲和性(PSC)的自交亲和性等位基因的至少一个拷贝的植物的方法获得，或能通过该方法获得。

本发明的方法允许来自自交亲和的植物的单个突变的等位基因或一定数量的突变的等位基因的基因渗入。所述植物包含如前述权利要求1中定义的突变基因，但是所述植物优选不包含存在于基因组标记SOT12-58962004、优选SOT12-59017500与SOT12-59130723、优选SOT12-59041500之间的基因组区中且与如权利要求1中定义的突变基因相关联的一种或更多种等位基因。

所述基因组区包含至少四个基因，包括Sotub12g029930.1.1、Sotub12g029940.1.1、Sotub12g029950.1.1和PGSC0003DMG400016861(PSC)。本发明的植物优选包含如权利要求1所定义的突变体基因，和/或Sotub12g029930.1.1、Sotub12g029940.1.1、Sotub12g029950.1.1的突变的等位基因，但不包含非S.tuberosum基因组序列，这些序列至SOT12-58962004是着丝粒的，优选至SOT12-59016142是着丝粒的，和/或至SOT12-59130723是端粒的，优选至SOT12-59043512是端粒的。

在另一个实施方案中，本发明提供一种S.tuberosum马铃薯植物，其中，PSC的自交亲和性等位基因(由SEQ ID NO：1表示的基因A的野生型S.tuberosum等位基因的突变序列)通过优选地使用CRISPR-CAS、TALEN和CRE-LOX中的任一种被功能性失活。PSC的自交亲和性等位基因的失活使所得产生植物的是自交不亲和的。

自交不亲和性可能是有利的，例如在产生马铃薯的杂交种子的情况下，该杂交种子是从两个独立的亲本二倍体和基本纯合的系获得的。PSC的自交亲和性等位基因敲除的纯合的转化株是自交不亲和的。即使没有去雄，用作母本的PSC敲除母系也会产生少量的自种。

对于自交亲和的植物，两个亲本系可以在同一田间或温室中栽培，并且在母本的花去雄之后人工杂交，从而产生100％F1杂交种子。可替代地，通过使用雄性不育基因或源自S-基因的自交不亲和性系统，可以使雌性植物的花为雄性不育。

修饰PSC的自交亲和性等位基因，从而使得表达减少或消除，允许将S等位基因固定在纯合状态的两个自交马铃薯系杂交。由于群体内的个体植物将是自交的产物，并且被选择为纯合的和包含相同的S等位基因，因此与来自其他自交群体的个体的交配相比，群体内不会发生杂交。该结果将使得每株植物产生100％的杂交种子。生产F1杂交的合适育种方案的实施例提供在图2中，该育种方案涉及PSC的自交亲和性等位基因的失活。

PSC的自交亲和性等位基因的失活可以通过本领域技术人员熟知的同源重组(例如通过在PSC的自交亲和性等位基因的编码区中引入移码突变)、通过缺失基因组区(例如调控序列、外显子的一部分或一个或更多个外显子)和/或通过用DNA识别位点特异性重组酶在基因组区中插入一个或更多个核酸残基(例如调控序列、外显子的一部分或一个或更多个外显子)来实现。所述插入可包括激活或失活PSC的自交亲和性等位基因的特定序列。

所述DNA识别位点特异性重组酶优选选自锌指核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、拓扑异构酶I类重组酶(例如来自P1噬菌体的Cre重组酶)、源自酿酒酵母的翻转酶(Flp重组酶)，λ整合酶、γ-δ解析酶、Tn3解析酶、

整合酶和/或成簇规则区间的短回文重复序列(CRISPR)引导的核酸酶。优选的位点特异性重组酶是锌指核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)和/或簇状规则区间的短回文重复(CRISPR)引导的核酸酶。

TALEN、锌指核酸酶或CRISPR-CAS介导的PSC自交亲和性等位基因的破坏通过将核酸酶靶向至PSC自交亲和性等位基因上的至少一个特定位置，优选至少两个特定位置来介导。所述靶向通过TALE-DNA结合结构域或通过CRISPR单一嵌合引导RNA序列介导。核酸酶(在TALEN的情况下为FOK1核酸酶，而对于CRISPR是CAS蛋白，优选CAS9蛋白)，介导PSC基因的基因组中的双链断裂。在存在合适的供体DNA以缺失部分或全部PSC基因的情况下，DNA双链断裂的引入增加了通过同源重组的基因编辑效率(Gaj et al.，2013.TrendsBiotechnol 31：397-405)。

锌指蛋白是DNA结合基序并且由5个与核酸酶偶联的模块化锌指结构域组成。每一个结构域都能被设计成识别PSC基因中的特异DNA三联体。三个或更多个结构域的组合使得识别PSC特异序列。在相关植物细胞中表达所述偶联的锌指蛋白-核酸酶将导致PSC的自交亲和性等位基因的限制，并因此沉默PSC的自交亲和性等位基因。

类似地，合成转录因子DNA结合域(DBDs)能被编程以识别特异的DNA基序。这种转录激活物样效应器(TALE)DNA结合结构域(DBD)优选包含7至34个高度同源的直接重复，每个重复由33-35个氨基酸组成。特异性包含在每个重复的位置12和13的两个氨基酸残基中。由于DNA：所述两个氨基酸残基的蛋白质结合编码已经被破译，因此可以通过设计合适的DBD来设计结合任何期望的靶DNA序列的TALEs。通常，TALEs被设计成识别15-20个DNA碱基对，平衡特异性和潜在的靶向性(Boettcher and McManus，2015.Mol Cell 58：575-585)。然后将PSC特异的TALE偶联到核酸酶(例如Cas9)。在相关植物细胞中表达所述偶联的TALE-核酸酶将导致PSC的自交亲和性等位基因的限制，并因此沉默PSC的自交亲和性等位基因。

优选的位点特异的重组酶是CRISPR相关蛋白9(Cas 9)。Cas9是一种RNA引导的核酸内切酶，它能切割与含CRISPR的引导RNA中的核酸序列互补的任何序列。该系统的靶向特异性来源于gRNA：DNA互补，不依赖于对蛋白质本身的修饰(如TALE和锌指蛋白)。

作为替代，本发明提供一种S.tuberosum马铃薯植物，其中基因A的野生型S.tuberosum等位基因，如权利要求1所定义和SEQ ID NO：1所示，在功能上被恢复，优选通过使用CRISPR-CAS、TALEN和CRE-LOX中的任一种。恢复基因A的野生型S.tuberosum等位基因使得植物自交不亲和的，因此有效地允许F1杂交种子的产生。

如上文所表示的，DNA识别位点特异性重组酶能用于在细胞中执行靶向基因组编辑。在PSC的自交亲和性等位基因内的两个位置处采用靶向模块的靶向基因缺失和取代将有效地产生不同长度的靶向缺失。在存在同源修复供体的情况下，该系统可以通过将PSC的自交亲和性等位基因或其相关部分交换为自交不亲和的基因的对应部分(例如SEQ ID NO：1中所提供的)来引导精确的基因取代。

本发明进一步提供植物部分，包括叶、块茎、果实或种子，或如本文所描述的改良植物的部分或后代。植物的优选植物部分是块茎或种子。

优选的抗性基因

尽管有些低碳水化合物食物流行，马铃薯在全世界仍变得越来越受欢迎。马铃薯的种植相对便宜，块茎全年可用。已经描述了食用马铃薯的许多潜在的有益健康的效果。全世界有超过4000个马铃薯品种，但是对于数千个不同的马铃薯市场，仍然有马铃薯品种更多样化的空间。超过70％的携带马铃薯亲缘关系的野生块茎是二倍体；然而，栽培的马铃薯是同种异体的、自身四倍体，有四组染色体(2n＝4x＝48)。这使得特定性状的目标育种极其复杂，如果不是不可能的话。育种项目需要超过100000株植物的起始群体，仍然有很小的机会获得一个明显优于所有现有品种的新品种。例如，美国在20世纪推出的马铃薯品种的产量并没有提高。在过去的几十年中，诸如标记辅助选择和全背景选择的基于序列的新育种技术被发展以支持育种。然而，这并不使得改进品种加速生产。目前仍然难以培育出有特定性状组合的品种(例如对生物和非生物压力的抵抗或存在与健康相关的成分)。

Phytophthora infestans是危害马铃薯的最重要的病原体，并且是晚疫病的致病因素。晚疫病破坏了叶和块茎，导致低经济的块茎产量。目前，由于频繁使用杀菌剂(每季至多20次)，晚疫病感染的危害受到限制。在荷兰，约50％的农业中的所有作物保护化学品用于控制马铃薯田中的Phytophthora。有效的综合虫害管理(IPM)是可操作的，并且基于关于疾病流行病学的信息和产生的应用建议。有一定抗性水平的马铃薯品种能改善IPM的结果。20世纪初，以Solanum demissum为供体，通过种间杂交发展有提高的抗P.infestans的水平的新品种已经开始。在1950年代和1960年代，第一个品种被引入市场。然而，与快速进化的效应器R基因结合的无性和有性的Phytophthora infestan的有效繁殖是成功感染所必需的(Haas et al.2009)，使其成为快速进化的病原体，容易产生新的致病种族。即使几个来自S.demissum的抗性基因组合在单个品种中也不会产生持久的抗性(Fry，2008.Mol PlantPathol 9：385-402)。P.infestans的快速适应使得培育持久的抗病马铃薯品种变得非常困难(Black et al.，1953.Euphytica2：173-179；Fry，2008.Mol Plant Pathol 9：385-402；McDonald and Linde，2002.Annu Rev Phytopathol 40，：349-379)。对特定区和分离物聚合不同作用的P.infestans抗性基因可能是提高耐久性和抗性水平的解决方案。已经识别了许多P.infestans的抗性基因，并且在定位研究中已经确定了它们在马铃薯基因组上的位置，并且通常已经克隆了R-基因(例如van der Vossen et al.，2005.Plant J.44：208-222；van der Vossen et al.，2003.Plant J 36：867-882；Pel et al.，2009.Mol Plant-Microbe Interactions 22：60l-615；Song et al.，2003.Proc Natl Acad SciU.S.A.100：9128-9133.；Park et al.，2005.TheorAppl.Genet111：591-597)。在传统的马铃薯育种中，不可能在不破坏其遗传组成的情况下，在商业品种中堆叠来自不同来源的不同抗性基因。因此，遗传修饰用于在商业品种Desirée中堆叠Phytophthora抗性基因(Haverkort et al.，2016.Pot Res 59：35-66)。在该DuRPh(对Phytophthora的持久抗性)计划中，仅使用来源于可杂交野生种的马铃薯(顺遗传(cis-genesis))的抗性基因。这是一种成功的方法，并且由于存在多个抗性基因组合，使得多堆叠品种在接种后保持不受影响。然而，立法阻止了遗传修饰的马铃薯的生产和消费，并且成功的应用超出了欧盟的现实范围。在美国，一种有耐晚疫病能力的基因修饰的先天马铃薯植物于2014年获得美国农业部(USDA)的批准。

随着越来越多的纯合子二倍体马铃薯自交系的发展，堆叠不同抗性基因进入马铃薯的替代方法最近变得可用(Lindhout et al.，2011.Potato Res 54：301-312；Lindhoutet al.，2018.“Hybrid potato breeding for improved varieties”.In：Achievingsustainable cultivation of potatoes Vol.1Breeding improvedvarieties.Edt.Burleigh Dodds，Science Publishing，Cambridge，UK.ISBN：978 1 78676100 2)。这些自交系通过标记辅助回交产生双堆叠抗性杂交体，其方法如下：(1)杂交优质纯合二倍体系与携带Phytophthora抗性基因的二倍体供体；(2)重复回交与标记辅助选择相结合的优质亲本；(3)自交获得含有一个抗性基因的纯合二倍体系；(4)杂交有不同抗性基因的亲本系以产生F1杂交种子；(5)通过田间试验的与堆叠的抗性基因杂交来确认持久的耐性。这种杂交方法依赖于自交亲和的和旺盛的马铃薯自交系(Lindhout et al.，2011.Potato Res 54：301-312；Lindhout et al.，2018.“Hybrid potato breeding forimproved varieties”.In：Achieving sustainable cultivation of potatoesVol.1Breeding improved varieties.Edt.Burleigh Dodds，Science Publishing，Cambridge，UK.ISBN：978 1 78676 100 2)。尽管最初，第一个自交系非常弱，但是通过连续的育种逐渐显著地改进它们，从而产生第一个可接受的杂交品种(Lindhout et al.，2018.“Hybrid potato breeding for improved varieties”.In：Achieving sustainablecultivation of potatoes Vol.1Breeding improved varieties.Edt.Burleigh Dodds，Science Publishing，Cambridge，UK.ISBN：978 1 78676 100 2；De Vries et al.，2016.Open Agriculture 1：151-156)。传统四倍体育种向二倍体杂交育种转变的可能性已经研究了50年(Hawkes 1956)，然而，没有发展出可接受的纯合二倍体马铃薯克隆。这可能是由于在四倍体中有负效应的等位基因的水平高，并且在重复自交期间越来越多的这些等位基因变为纯合子，导致近亲繁殖抑制(Lindhout et al.，2018.“Hybrid potatobreeding for improved varieties”.In：Achieving sustainable cultivation ofpotatoes Vol.1Breeding improved varieties.Edt.Burleigh Dodds，SciencePublishing，Cambridge，UK.ISBN：978 1 78676 100 2)。为了良好驯化二倍体马铃薯，寻找去除有害的等位基因的最有效的方法是重要的。虽然大多数二倍体马铃薯是自交不亲和的，但偶尔发现自交亲和的例外。Solynta育种计划的一些二倍体创始系是部分自交亲和的，此外，自交亲和性的另一个来源是二倍体、自交的Solanum chacoense基因型(命名为DS)(Hosaka and Hanneman，1998.Euphytica 103：265-271)。自交亲和性使得可能发展有高纯合性水平的二倍体系。

因此，本发明提供了一种植物，其包含根据本发明的PSC的自交亲和性等位基因，进一步包含抗性基因(例如选自S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1，Chr11(位置～1.8Mb)；S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1，Chr10(位置～53Mb)；S.chacoense 543-5 Rpi-chc1，Chr10(位置～53Mb)和S.venturii 283-1 Rpi-vnt1，Chr9(位置～51 Mb)的Phytophtorainfestans抗性基因)的至少一个等位基因。

Phytophtora infestans抗性基因S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1，Chr11(位置～1.8Mb)是一个公知的抗性基因，例如在Verzaux et al.，Am.J.Pot.Res.，88：511-519(2011)中描述的，该文的内容，特别是关于S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1的描述通过引用并入本文。

Phytophtora infestans抗性基因S.tarinjense 852 Rpi-tar1，Chr10(位置～53Mb)和S.chacoense 543Rpi-chc1，Chr10(位置～53Mb)是公知的抗性基因，例如在WO2011034433A中描述的，该文内容，特别是关于S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1和S.chacoense 543-5 Rpi-chc1的描述通过引用并入本文。

Phytophtora infestans抗性基因S.venturii 283-1 Rpi-vnt1，Chr9(位置～51Mb)是公知的抗性基因，例如在Foster et al.，Mol.Plant Microbe Interact，22：589-600(2009)and Pel et al.，Molecular Plant-Microbe Interactions，22：601-615(2009)中描述的，该文内容，特别是关于S.venturii 283-1 Rpi-vnt1的描述通过引用并入本文。

食品

本发明还提供由根据本发明的植物(优选根据本发明的基因修饰的植物)的植物部分制备的食品。所述植物部分是本发明的细胞、繁殖材料和器官中的至少一种。

合适的食品包括ajiko、aligot、香辣马铃薯菜花(aloo gobi)、batates、印度式烩羊肉马铃薯(aloo goht)、aloo posto、炸马铃薯饼(aloo tikki)、白酒什锦锅(baeckeoffe)、batata harra、batata vada、bauernfrühstück、孟加拉马铃薯(bengalpotatoes)、bonda、马铃薯蛋糕(boxty)、

、bryndzové

、炸马铃薯和洋白菜(bubble and squeak)、加那利群岛的皱纹马铃薯(canarian wrinklypotatoes)、墨西哥风格薯条(came asada fries)、立陶宛饺子(cepelinai)、chapalele、奶酪薯条(cheese fries)、薯片、chorrillana、

、clapshot、coddle、马铃薯卷心菜泥(corned beef pie)、crocchè、croquette、dabeli、公爵夫人土豆(duchess potatoes)、腰果土豆咖喱(dum aloo)、far far、鱼肉馅饼(fish pie)、薯条(french fries)、油炸馅饼(fritter)、funeral potatoes、gamja ongsimi、gamjajeon、猪骨汤(gamjatang)、德式薯条(german fries)、团子(gnocchi)、奶油烤菜(gratin)、土豆泥焗牛绞肉(hachisparmentier)、halal snack pack、土豆煎饼(hash browns)、hasselbackspotatis、家常炸土豆片(或块)(home fries)、hot hamburger plate、hutspot、janssons frestelse、kapsalon、馅饼(knish)、

、kouign patatez、kroppkaka、kugel、kugelis、kyselo、拉芙兹饼(lefse)、llapingacho、lyonnaise potatoes、马铃薯泥(mashed potato)、马沙文咖喱(massaman curry)、肉和马铃薯馅饼(meat and potato pie)、munini-imo、奥利维耶沙拉(olivier salad)、panackelty、papa a la huancaína、papa rellena、papaschorreadas、pasty Cornish、patatas bravas、patatnik、

aux pommes de terre、pattie、péla、pickert、pitepalt、pommes anna、pommes dauphine、pommes sarladaise、pommes soufflées、巴布卡蛋糕(potato babka)、马铃薯面包(potato bread)、马铃薯蛋糕(potato cake)、炸马铃薯片(potato chip)、马铃薯油炸甜甜圈(potato doughnut)、马铃薯馅(potato filling)、马铃薯饼(potato pancake)、马铃薯沙拉(potato salad)、马铃薯司康(potato scone)、马铃薯皮(potato skins)、马铃薯华夫饼(potato waffle)、薯角(potato wedges)、potatoes o′brien、potatonik、poutine original、raclette、rappiepie、raspeball、rewena bread、

、rumbledethumps、salchipapas、盐马铃薯(saltpotatoes)、咖喱角(samosa)、scotch pie、silesian dumplings、

、西班牙煎饼蛋(spanish omelette)、香料袋(spice bag)、仰望星空派(stargazy pie)、牛排炸薯条(steak frites)、stegt

、stoemp、stovies、sweetened potato casserole、甜味马铃薯片(sweetened potato chips)、

、tartiflette、tater tots、tombet、trinxat、truffade、batata vada、woolton pie和xogoi momo。

所述食品还包括包含马铃薯淀粉或其衍生物的食品。所述马铃薯淀粉或其衍生物可以作为水粘合剂、增稠剂、抗结块成分、膨胀成分和/或胶粘剂存在。马铃薯淀粉和马铃薯淀粉衍生物用于许多食谱中(例如面条、葡萄酒胶(wine gums)、鸡尾酒坚果、马铃薯片、热狗香肠、面包奶油和速溶汤和酱汁、无麸质食谱、逾越节的犹太食品和亚洲料理)。

根据本发明的植物的植物部分的残留物将存在于所述食品中，例如基因组重组工艺的痕迹(例如，可以通过如本领域技术人员公知的对含PSC的自交亲和性等位基因的基因组区进行扩增来可视化所述残留物)。

现在已经大致描述了本发明，通过参考某些特定的实施例将更好地理解本发明，这些实施例仅被包括在本文中以进一步说明本发明，而不旨在限制如权利要求所定义的本发明的范围。

实施例

实施例1用于寻找合适标记物的生物信息学方法

将表型性状精细定位到单个感兴趣基因(GOI)的工艺的成功取决于许多方面。两个最关键的技能涉及以尽可能高的特异性和最低错误率的表型正确确定基因型。对于基因分型部分，在获得(亲本)植物的下一代测序(NGS)数据的情况下，发展高度特异性标记似乎是一项很容易的任务。然而，至少对于马铃薯来说，远非如此。在大的、复杂的、重复的、多倍体和杂合的基因组(如马铃薯基因组)中，开发标记是非常具有挑战性的。一种额外的复杂情况是：单一的可获得的马铃薯参考基因组序列(DM4.04)远不足以代表在分子基因分型的典型靶标的单核苷酸多态性(SNP)水平上，正确地对再测序数据进行解读。

为了克服这些障碍，基于重测序数据(NGS短读(short-reads))开发了标记开发平台，所述重测序数据高度有助于马铃薯自交亲和性基因(PSC)的快速、准确和成功的精细定位，如下文所描述。

应用的严格策略深入到：

a)考虑到所有祖先基因型的累积和穷尽性变化，使得标记分析有在所有Solynta种质系中成功扩增的高机会；

b)避免任何基因组区，其中任何祖先基因型对参考基因组的再测序数据的解读是或可能是模棱两可的。这些包括，例如，低复杂度序列、重复序列和经历拷贝数变化的位点；

c)丢弃任何有侧翼变化的亲本基因型的任何SNP；以及

d)用一套已知的产生成功的分子试验的机会相关的特性对所有剩余的SNP进行评分。

该方法足够灵活以与不同的标记平台兼容，其中(c)和(d)中应用的阈值将取决于试验类型/标记平台。因为在(a)中考虑了累积变化，所以标记对于任何后代基因型(即，给定祖先基因型集合的排列)是特异的。虽然主要基于标准(b)，并且依赖于测定类型、标准(c)，但排除了绝大多数生物学相关的SNP。在应用于由许多个体组成的隔离群体上的情况下，与(d)所暗示的优先级结合的剩余的SNP将有极高的成功率。

这种方法的最终结果是高度定制的可优先排序的基因型标记组，其是为代表被考虑的(祖先)基因型的(子)集而量身定制的。通过内部发展的数据库和网络接口存储和访问结果，使得基因研究人员能够成功地管理用于他们自己的实验的标记发展，而不受生物信息学家的干扰。

在实施例2-4中提供的定位实验中使用的所得标记提供在表10中。

实施例2开发用于定位PSC基因的群体

为了开发PSC基因的定位群体，我们必须调查我们的材料以寻找合适的对照亲本。我们识别的亲本用于创造确定PSC基因位置的的定位群体。我们将PSC定义为负责自交亲和性的PGSC0003DMG400016861基因(SEQ-ID NO：6)的显性等位基因。相反，psc是PGSC0003DMG400016861基因的与PSC等位基因不同的任何等位基因。

材料和方法

植物材料

DS(IVP07-1001/4)是源自杂交[S.stenotomum×S.phureja]×[S.chacoense×S.phureja]的近交系。DS显示中度至良好的开花并且是自育的。DS的自交亲和性源自Hosaka和Hanneman1998年用于定位Sli基因(Hosaka and Hanneman 1998.Euphytica 103：265-271)的S.chacoense材料。DS是S-基因座抑制剂基因(Sli)的纯合子。DS是PSC基因的纯合子。

D2(IVPAA-096-18)是Solynta的育种计划的二倍体Solanum tuberosum创始基因型之一(参见WO2011/053135)。它产生大量的花，这些花产生许多可育的花粉并有规律地结交叉浆果，但它们是自交不亲和的。D2(RH88-025-50)是由二倍体育种系DB-207(母本)与SH_76-128-1865(父本)之间的杂交产生的二倍体。父系是由原始四倍体品种“Chippewa”、“Fennema”、“Maritta”、“Minn-20-20-34”、“Merrimack”、“Grata”、“PriMura”、“Sirtema”和野生近缘种“S.andigena”产生的二倍体的后代。

D14(IVP06-155-155)是一种二倍体S.tuberosum、S.tarjense的杂交物，是Solynta育种计划的创始基因型(参见WO2011/053135)。D14花丰富，产生许多可育的花粉，从不结自浆果，也只偶尔结交叉浆果。D14是由二倍体母本IVP92-057(母本CE 1062和父本SUH 4567，也称为SH70-104-1353的后代)与二倍体父本S.Taljense 852-1353(TAR852-5，来源于CGN22729，参见US9551007B2)之间的杂交产生的二倍体克隆。IVP92-057的双单倍体种质根植于四倍体MPI 44.1016/10、H 50FRD、S.vernei EBS 1984、MPI 49.540/2、Chippewa、Katahdin、PriMura、Fennema、Merrimack和Grata。

D16(IVPAA-134-16)是Solynta育种计划的另一个二倍体S.tuberosum创始基因型(参见WO2011/053135)。它产生大量的花，这些花产生许多可育的花粉并有规律地结交叉浆果，但它们是自交不亲和的。D16是由二倍体母BE(母本USW1 5295-7和父本VPH477.2102.37的后代)与二倍体父本SH 76-128之间的杂交产生的二倍体克隆。BE的双单倍体种质根植于四倍体H 50FRD、MPI 44.1016/10、MPI 49.540/2、S.vernei EBS 1984和Katahdin中，而SH76-128的双单倍体种质根植于如D2所描述的四倍体中。

二倍体马铃薯系D2、D14和D16是荷兰瓦格宁根大学植物育种系二倍体马铃薯育种计划的杂合系。该项目跨越超过50年的时期，并且使用从1960年代的四倍体马铃薯品种产生的广泛范围的二单倍体来启动。可从公共马铃薯系谱数据库(Van Berloo et al.，2007.Potato research 50，45-57)获得系谱信息。

16HP0001-0066(HP66)是在Solynta的育种计划中获得的二倍体S.tuberosum基因型。它生长旺盛，花丰富，产生许多可育的花粉，容易结出自交和杂交浆果。HP66是马铃薯自交亲和性基因(PSC)的杂合子。

16BL5033-2702是在Solynta的育种计划中获得的二倍体S.tuberosum F3基因型。它是在一个选择场地被识别到的，在那里它在一棵植物上产生了超过300个浆果。它生长旺盛，开花丰富，产生许多可育的花粉，并且容易结出自交和杂交浆果。虽然这种植物不再存在，但自交和杂交种子是可用的。16BL5033-2702是PSC的自交亲和性等位基因的纯合子。

17SC0025-0008是源自杂交16BL5033-2702×D14的二倍体S.tuberosum F1基因型。它生长旺盛，花丰富，产生许多可育的花粉，容易结出自交和杂交浆果。17SC0025-0008是PSC的杂合子。

17SC0011-0021是源自杂交HP66×D16的二倍体S.tuberosum F1植株。它生长旺盛，花丰富，产生许多花粉和容易结交叉浆果，但是自交不亲和的。

17SC0011-0027是来源于杂交HP66×D16的二倍体S.tuberosum F1植株。它生长旺盛，花丰富，产生许多花粉和容易结杂交浆果。17SC001-0027不包含PSC的自交亲和性等位基因，但是它偶尔结出含有少量种子的自交浆果，表示该植物是伪自交亲和的。

用于定位和克隆PSC的杂交方案提供在图3中。用于识别PSC的合适的杂交方案可以通过将任何自交亲和的马铃薯植物与自交不亲和的马铃薯植物杂交开始。所述马铃薯植株优选为二倍体、基本纯合的S.tuberosum植株。合适的起始植物由自交亲和的马铃薯系NCIMB登录号41663、NCIMB登录号41664、NCIMB登录号41665或NCIMB登录号41765提供，所述系的代表性种子已分别以育种者参考号AGVD1、AGVD2、AGVD3和AGVD17下保藏于苏格兰阿伯丁的NCIMB。

温室条件

所有植物种植在荷兰的温室中。在温度下降到低于14℃的情况下加热温室隔室，在温度上升到高于19℃时通过打开窗户冷却温室隔室。在光强度下降到低于85W/M2的情况下，人工照明补充了自然光。植物种植在来自Lentse Potgrond(Lentse Potgrond B.V，Katwijk，the Netherlands)的特殊马铃薯基质混合物中。所使用的基质混合物由用于平衡吸水的泥炭混合物、碱性缓释肥料和石灰组成以确保所需的pH水平。使用电导率(EC)为1.5的20氮∶20磷∶20钾的溶液对基质混合物进行施肥。

自交亲和性的评估

花和芽每周计数一次，并且以级别1-9每月对活力进行一次评分，其中1是非常不旺盛的植物，9是非常旺盛的植物。将来自一棵植物的多朵花的花粉收集在Eppendorf管中，并使用在第一时间对相同的花进行自花授粉，每棵植物每周最多十朵花。结出两个以上自浆果，每个自浆果至少有35粒种子的植物被归类为自交亲和的。为了确定雌性的生育力，用来自马铃薯育种计划的至少三个无关基因型的混合花粉(bulked pollen)授粉植物。在至少15次自花授粉后没有结出自交浆果，但结出了至少一个混合浆果(bulk berry)并且在自花花柱的显微分析中显示出可育花粉的植物被归类为自交不亲和的。观察在没有产生足够花以完成表型分型方案的植物和产生每颗浆果含少于35个种子的自浆果的植物中自交花粉管和混合花粉管生长，以将这些植物归类为自交亲和的或自交不亲和的。

花柱成像

为了观察花粉管生长，在授粉后24小时除去授粉的花柱，然后在3乙醇∶1乙酸中固定至少24小时。然后在65℃下在8M NaOH中浸渍该花柱10分钟，并用去矿物质水冲洗两次。将花柱置于显微镜载玻片上，使用溶于0.1M K4P2O7(pH＝7)的0.1％苯胺蓝(CarlRothGmbH)染色2-5分钟，然后使用盖玻片在甘油中压扁，并使用用过滤器组01(BP 365/12、FT395和LP 397)的Zeiss Axiolab荧光显微镜观察。使用两个参数观察和评分所有花柱：1)对花柱的最深渗透，以最大渗透百分比表示，2)达到最深渗透的花粉管的百分比。

提取DNA

将叶样品送至VHLgenetics(瓦格宁根，荷兰)。根据制造商提供的方案使用sbeadextm试剂盒(LGC genomics GmbH，柏林，德国)进行DNA提取。

KASP分析

Kompetive等位基因特异的PCR(KASP^TM)分析是由VHLgenetics(瓦格宁根，荷兰)使用KASP试验执行的，KASP试验被设计为特异的针对在我们的材料中分离的SNP。根据制造商提供的方案(LGC Genomics GmbH，柏林，德国)进行KASP试验。使用SNPviewer(可在lgcgroup.com/products/genotyping-software/snpviewer处获得)可视化来自KASP试验的结果以确认正确的分离和基因型调用。

连锁分析

通过分析不同SNP之间的重组率，从基因型数据中重建自交亲和的母本的单倍型。该数据用于将SNP调用转换为“axb”格式，其中“a”单倍型与PSC的自交亲和的等位基因相关，而“b”单倍型与PSC的自交不亲和的等位基因相关。使用有DH群体类型和默认设置的JoinMap 4.1创建连锁图谱(van Ooijen，2006.

4.Software for thecalculation of genetic linkage maps in experimental populations.Kyazma BV，Wageningen.33(10.1371))。

QTL定位

通过将1分配给每个自交亲和的基因型、将0分配给每个自交不亲和的基因型和将*分配给不能确定亲和性的基因型，将表型数据转换为数值性状。使用MapQTL6(vanOoijen，1992.Theor Appl Genet 84：803-811；van Ooijen，2006.

4.Softwarefor the calculation of genetic linkage maps in experimentalpopulations.Kyazma BV，Wageningen.33(10.1371))执行QTL定位。

结果

自交不亲和的亲本

目前Solynta的大多数种质是自交亲和的(SC)，要求我们返回到我们的育种计划的创始基因型以找到自交不亲和的(SI)亲本。在这17种创始基因型中，3种因其丰富的开花和自交不亲和性而脱颖而出：D2(IVPAA-096-18，又名RH88-025-50)、D14(IVP06-145-145)和D16(IVP06-149-12；参见WO2011/053135表6)，全部可从瓦格宁根大学植物育种实验室的Dr.Ronald Hutten处获得。

D2在基于杂交DS×D2的F2定位群体中用作SI亲本。结果揭示了QTL，在染色体2上中度LOD评分的自交亲和性增加(参见下文)。接下来，使用D14来创建几个定位群体，这些群体经检查显示出较高的授粉花败育率，使得我们怀疑D14的遗传学对浆果结实是不利的。最初，D16不被认为是一个好的候选植株，因为它偶尔结出含有少量种子的自交浆果。然而，当我们对获得自D16作为父本和HP66作为母本之间杂交的F1群体(17SC0011)进行测试时，我们发现该群体表现出1∶1的分离并且表现良好。从该F1群体中，我们获得了两个SI基因型，然后我们将其用作新定位群体的SI亲本。

SC亲本

我们尝试使用几种SC基因型作为定位群体的亲本。一种基因型16HP0001-0066(HP66)显示出丰富的开花、良好的花粉产生和高浆果结实率。在分析了来自HP66的几个自交群体之后，我们决定将其与D16杂交以产生定位群体。该群体为自交亲和性分离，表示HP66是自交亲和性基因的杂合子。第二个SC基因型16BL5033-2702在田地中被识别，显示出巨大的浆果结实。在我们分析来自16BL5033-2702的定位群体时，我们发现所有后代植物都是自交亲和的，这表示16BL5033-2702是自交亲和性等位基因的纯合子。

定位群体

为了确定自交亲和性基因的位置，我们测试了几个群体的自交亲和性分离。Hosaka和Hanneman指出，有孢子体作用的单一显性S-基因座抑制剂基因(Sli)存在于第12号染色体上(Hosaka and Hanneman，1998.Euphytica 99：191-197)。

为了定位Sli基因，分析来自杂交DSxD2的F2群体的自交亲和性。在这里，我们发现了有中等显著的QTL，其负责第2染色体上的自交亲和性基因。该QTL在F2群体中分离的事实表明该QTL在第2染色体上孢子体地起作用。

当时，我们假设第12号染色体上缺乏高度显著的QTL可能是由于D2亲本的杂合性产生的遗传背景噪声所致。

当第一次识别出HP66时，我们分析了来自它的自交群体，该群体似乎为自交亲和性分离。进行靶向第1、2和12号染色体的遗传分析，因为存在与这些染色体的自交亲和性有关的理论证据：含S-基因座的第1号染色体(Gebhardt et al.，1991.Theor Applied Genet83：49-57)；含有Nicotiana alata 120K基因的马铃薯同源物的第2号染色体(Hancock etal.，2005.Plant J 43：716-723)；和含有HT-B基因的第12号染色体(O’Brien et al.，2002.Plant J 32：985-996)。120K和HT-B都被证明是自交不亲和性所必需的(O’Brien etal.，2002.Plant J 32：985-996)。然而，该靶向遗传分析没有揭示有孢子体自交亲和性活性的任何显著QTL。

用源自HP66的几个系继续近亲繁殖，认为如果可以降低遗传背景噪声，则可以识别自交亲和性基因。然而，最终证明这是徒劳的。

令人惊讶的是，对源自HP66xD16的F1的QTL分析揭示了有配子体活性的第12号染色体上LOD评分＞60的高度显著的QTL。该非常高的LOD评分表示可能存在于HP66中的遗传背景噪声不会对定位造成问题。由于该基因配子体地起作用，因此该基因可能不同于Sli，并且暂时被称为马铃薯自交亲和的(PSC)基因。第12号染色体上的基因座可以被定位到大约600KB的区间(PSC肯定定位在其中)。所有可用的数据支持第12号染色体上存在有配子体作用的单一显性基因。

通过将17SC0025-0008与在群体17SC0011中识别的两个SI新基因型17SC0011-0021和17SC0011-0027杂交，生长了两个大的分离F1群体，用于确认PSC在第12号染色体上的位置，这也允许我们将PSC所在的区间缩短至～170KB(参见实施例4)。

定位群钵的表型分析

在分析来自杂交DS×D2的F2群体时，识别出自交亲和的(SC)和自交不亲和的(SI)植物两者。然而，由于我们现在知道因为PSC基因的配子体作用，所有的F2植物都应该已经有PSC的自交亲和性等位基因，所以我们想知道为什么在这个群体中识别出SI植物。我们假设那些植物的SI表型是由于其他育性问题(例如花粉质量或浆果结实)。为此，我们制定了一种新的表型分析方案，该方案不仅强调自交亲和性的测量，而且强调其他育性相关性状的测量。使用该方案，我们确定开花、花粉质量、体内花粉管生长和混合浆果结实。因为由于缺乏育性而无法准确评估自交亲和性评分，以这种方式，我们可以通过将有育性问题的所有植物指定为“未确定”(ND)分类来从SI分类中排除混杂的不育特征。不幸的是，这显著减小了定位群体的有效大小，意味着需要更多的个体来获得相同的分辨率。例如，群体17SC0011由252株植物组成，其中，86株SC、78株SI和88株ND，有效的定位群体从252株减少到164株植物。

实施例3基因组DNA的精细定位与分析

为了识别PSC的自交亲和性等位基因，我们对三个定位群体17SC0011、18SC0011和18SC0012进行了基因型和表型分析，并进行了自交亲和性QTL分析。这允许我们在第12号染色体上定义PSC必须定位在其中的169kb区间。然后，我们从群体17SC0011中进一步筛选出1374株幼苗，在该区间内进行重组，允许我们将该区间减少到27.4kb。

材料和方法

植物材料

实施例2中所描述的D14、D16、16HP0001-0066、16BL5033-2702、17SC0025-0008、17SC0011-0021和17SC0011-0027。

定位群体

17SC0011是源自杂交HP66×D16的F1群体。为定位研究，总共种植了252株植物，其中，自交亲和的86株，自交不亲和的78株和模棱两可的(不确定的)88株。

18SC0011是源自杂交17SC0025-0008×17SC0011-0027的F1群体。为定位研究，总共种植了161株植物，其中，自交亲和的95株，自交不亲和的40株和不确定的26株。该群体显示自交亲和的植物与自交不亲和的植物显著偏离1∶1分离。这可能是由于来自亲本17SC0011-0027的伪自交亲和性。

18SC0012是源自杂交17SC0025-0008×17SC0011-0021的F1群体。为了定位研究，总共种植了250株植物，其中自交亲和的97株，自交不亲和的85株和模棱两可的(不确定的)68株。

其他方法

执行实施例2中所描述的温室条件、自交亲和性的评估、花柱成像、提取DNA、KASP分析、连锁分析和QTL定位。

结果

第12号染色体自交亲和性QTL

在较早的研究中，在来自杂交DS×D2的F2群体的第2号染色体上识别了孢子体自交亲和性的QTL(参见实施例2)。然而，其他研究指出了第12号染色体上的孢子体自交亲和性基因(Hosaka and Hanneman，1998.Euphytica 103：265-271)。因此，我们选择了第2号染色体上的18个SNP和第12号染色体上的6个SNP，它们在亲本HP66中是杂合的，在亲本D16中是纯合的。在我们在第2号染色体上选择的18个SNP中，14个按预期1∶1分离，2个1∶2∶1分离和2个根本不分离。在第12号染色体上选择的6个SNP中，5个按预期1∶1分离为，1个按预期1∶2∶1分离。未按预期分离的所有SNP不用于进一步分析。使用基因型数据，第2和第12染色体的图谱分别由70.5和69.7cM构建。QTL定位揭示了在第12号染色体上存在高度显著的QTL，但在第2号染色体上不存在。因此，我们从如实施例1中所述的我们的标记数据库中选择了另外25个SNP，其中23个按预期分离。使用这些数据，我们能够在标记SOT12-58601503和SOT12-59230363之间(见图4)确定PSC位于的629kb区间。

群体18SC0011和18SC0012的遗传定位确认了PSC在第12号染色体上的位置

为了确认在群体17SC0011中存在用于自交亲和性的基因，在群体18SC0011和18SC0012中执行遗传分析。在第12号染色体上选择15个标记，这些标记在自交亲和的母本17SC0025-0008中是杂合的，在祖父母亲本HP66和D16中都是纯合的。所有标记显示出预期的1∶1分离，并且遗传分析确认PSC在两个群体中的位置。令人感兴趣地，群体18SC0011的LOD评分远低于群体18SC0012的LOD评分，这可能是由于亲本17SC0011-0027中存在伪自交亲和性。实际上，人工检查基因型和表型数据之间存在矛盾的植物子集揭示了12株植物没有PSC的自交亲和性等位基因，但仍然被评分为自交亲和的，因为它们的确结出了自浆果。没有结出自浆果的无PSC的自交亲和性等位基因的植物可能有基于S等位基因的效率较低的自交不亲和性系统，例如由于S-RNase表达的天然水平较低，允许它们偶尔结出自浆果。群体18SC0012的两株植物在PSC周围显示出重组，该重组将区间减少到169kb(参见图5)。

PSC基因的区间缩短至27kb

为了进一步缩小PSC的位置，对来自群体17SC0011的1374苗进行取样，并用629kb区间(图4中的区间I，629kb)附近的四个标记对其进行基因分型。不幸的是，在群体17SC0011的遗传定位中产生良好结果的一个标记在重组筛选中产生不良结果，允许在两个外部标记之间选择81个重组体。在重组基因型达到足够的长度的情况下，产生来自每个基因型的两个插条以提高表型分型的准确性。然后用169kb区间(图5中的区间II，169kb)中的28个标记对所有81个重组体进行基因分型，其中24个按预期分离。两株有明确SI表型的植物显示出重组，这允许我们将区间从169减少到27kb(图6)，其中，至少保留四个候选基因。

PSC基因区间缩短至12.6kb

为了确定哪一个候选基因是PSC基因，我们用27kb区间(图6中的区间III，27kb)周围的四个标记(SOT12-59003185；SOT12-59016142；SOT12-59043512；SOT12-59043574)筛选了另外的10165株幼苗。我们识别出了在27kb区间中具有明显重组的53株植物。然后，我们用16个标记(表11)包括我们用于初始筛选10165株幼苗的内部标记，对53株重组体进行基因分型。两个标记(SOT12-59022612和SOT12-59030235)不分离，不用于进一步分析。利用剩余的标记，我们识别了14株真正的重组体。初始筛选中的基因分型错误而包括其他39种基因型。尽管如此，我们对在初始筛选中识别的所有53株植物进行表型分析，并且发现6株植物定义了12.6kb的新区间(图13中的区间IV，12.6kb)。有SC表型的两株植物和有SI表型的一株植物确认了先前27kb区间的远端边界，而有SI表型的三株其他植物限定了在59030880bp处的新的近端边界，产生了12.6kb的新的区间(图13)。两个基因位于该12.6kb区间中，PGSC0003DMG400016861和Sotub12g029970(对于后者，由于本发明人认为PGSC注释可能被截短，因此使用了涉及更大的序列的ITAG注释ITAG注释其中附加的外显子由RNA-seq数据支持的这一事实证明了这一点。对应的PGSC模型是PGSC0003DMG400016860)。

实施例4PSC自交亲和性等位基因的识别

材料与方法

植物材料

基因型DS、D16、16HP0001-0066和17SC0025-0008描述在实施例2和实施例3中。

基因型17SC0100-0018是源自16HP0001-0066的二倍体F4马铃薯基因型。由于在与17SC0011-0021杂交时，所有子代都是SC或未确定的，因此基因型17SC0100-0018是PSC的自交亲和性等位基因的纯合子。对17SC0100-0018的基因组进行测序。

基因型17SC0100-0002是源自16HP0001-0066的二倍体F4马铃薯基因型。因为在与17SC0011-0021杂交时，所有后代植物都是SC或未确定的，所以基因型17SC0100-0002是PSC的自交亲和性等位基因的纯合子。对17SC0100-0002的基因组进行测序。

候选基因的生物信息学分析

为了在本文中所指的初始27kb区间(区间III，并且该区间随后如实施例3中所解释的可减少到12.6kb(区间IV))中识别正确的基因模型，我们研究了DM 4.04参考基因组的两个单独的基因注释，PGSC注释和ITAG注释(另见Hirsch et al.，2014.Plant Genome 7：1-12)。为了确认注释的正确性，我们使用来自两个注释的预测蛋白质序列进行blastp搜索。通过比较blastp搜索中的最佳匹配与我们的查询，我们确定预测的蛋白质序列中的所有经注释的外显子和结构域是否由马铃薯和其他植物物种中的类似蛋白质支持。此外，使用SPUD DB上公开使用的RNA-seq文库(可在万维网solanaceae.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/potato/获得)和NCBI基因组数据查看器(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/获得)来决定假定外显子是否有表达证据。这两种方法一起使我们能够在两种注释中验证基因模型的内含子-外显子结构，使得在知情的情况下选择一个或多个基因模型的异构体来代表所讨论的基因。基于这些方法，候选基因PGSC0003DMG400016862被识别为可能是部分的和不显著表达的，并且从进一步的分析中被丢弃。基因模型Sotub12g029970被认为是正确的，而其PGSC对应物PGSC0003DMG400016860可能被截短。因为它主要位于指定的区间之外，并且在SC和SI植物之间不能识别相关的氨基酸替换，所以从进一步的分析中丢弃该基因。

变化分析

为了识别在对自交亲和的基因型特异的27kb区间(参见实施例3)的突变，所有高置信度SNP(参见实施例1)确定为：这些(1)在DS、17SC0100-0018和17SC0100-0002中均为纯合子(因为所有三个SNP均为PSC的SC等位基因的纯合子(PSC/PSC))，(2)D16中的纯合子不同(因为PSC的SI等位基因是纯合子(psc/psc))和(3)16HP0001-0066和17SC0025-0008两者中是杂合子(因为两者都是SC等位基因PSC的杂合子(PSC/psc))。使用SPAdes版本3.11.1(Bankevich et al.，2012.J Comput Biol 19：455-477)对上述所列植物的150nt配对端Illumina数据(约25-30倍测序深度)进行新的基因组装以获得等位基因序列。将产生的重叠群比对到Dm参考(使用minimap2版本2.1)，并对那些与27kb可靠比对的进行过滤。从这些经比对的重叠群中，直接量化相对于DM的变化(使用bcftools的子程序mpileup和call，版本1.9)，并以Variant call Format(VCF)列出。

氨基酸变化分析

从该SC特异的突变列表中，通过与指定编码外显子重叠来识别所有非同义SNP。列出了相对于DM或SI序列的氨基酸变化。通过使用蛋白质序列执行blastp搜索和使用前100个blastp命中执行多个序列比对来识别独特的氨基酸变化。

启动子区和终止子区的变化

启动子区被选择为起始密码子上游的序列，直到上游基因的编码序列最长1500nt。在27kb区间内发现启动子区的显著变化，其中最显著的是数个较大的长度为数十至数百个核苷酸的缺失和插入。获得PSC区间相对于DM的所有变化，包括启动子/上游区以及终止子/下游区的变化。

结果

PGSC0003DMG400016861是基因A的野生型序列

PGSC0003DMG400016861(PGSC注释)是位于第12号染色体nt59039183至59041123(-链)的一个基因。它被注释为基因，并且包含F-Box结构域和PP2凝集素结构域。PGSC和ITAG注释显示两种不同的基因模型，ITAG注释有额外的外显子。该额外的外显子不被任何类似蛋白质支持，并且没有证据表明该外显子在SPUD DB和NCBI基因组数据查看器上可用的RNA-seq数据集中表达。因此，我们拒绝ITAG基因模型，支持PGSC基因模型(如稍后在实施例6中确认的)。

F-box蛋白涉及在蛋白酶体降解途径中起作用的SCF(Skp1-Cullin-F-box)复合物，通过识别蛋白质并用泛素标记它们以进行降解。F-box蛋白PP2-B10的F-box结构域涉及与SCF复合物中其他蛋白质的相互作用，而PP2结构域参与糖组分的识别(Stefanowicz etal.，2015.Critical Rev Plant Sci 34：523-552)。在自交亲和的植物中，我们在该基因中发现了六种对自交亲和的植物特异的非同义突变，其中之一，R249Q在类似的F-box蛋白中不常见，并且可能带来识别结构域的特异性的改变。此外，在该基因的启动子区发现了多种小和大的插入及缺失以及许多替换。最明显的是，自ATG的位置-108处发现了533nt的PSC特异的插入(与DM相比)，而该位置在其他SI植物中是不存在的，因为-85至-278nt区的193nt缺失。已知起始密码子上游的-50至-150nt区包含启动协同转录的关键元件。在启动子区中的这个和其他变化可能最终导致表达模式改变。在茄科植物自交不亲和性系统中，F-box蛋白涉及在亲和授粉期间花粉管中花柱分泌的S-RNase的解毒(Li et al.，2016.Plant J87：606-616)。此外，已知S-RNases是糖基化的(Broothaerts et al.，1991.Sexual PlantReprod 4：258-266)。本发明人得出结论，F-box蛋白，特别是由SEQIDNO：2-4和6-8编码的F-box PP2-B10蛋白应当在花粉中展现出及时的调控表达。因此，有可能改变的识别特异性的F-box PP2-B10蛋白的改变的表达产生自交亲和性是不令人惊讶的。假设该基因在自交花粉管中的表达使得自S-RNases的识别和降解，从而允许自体受精。

实施例5使用自交亲和的材料在单一品种中堆叠抗性基因

材料和方法

温室

植物种植在荷兰Solynta的温室(最低温度16-18℃，16小时光照)中。在小栓子(0.2升)中发芽和生长后，将幼苗移植到较大的盆(4升)中。在温室中进行去雄、杂交和随后的浆果收集。在振动成熟的花药之后，将花粉收集在Eppendorf管中，如果需要，将其储存在冰箱中，然后用于杂交。在浆果成熟后(授粉后约六周)进行种子收集和清洁。

植物材料

使用了四种不同的有已知的Phytophthora infestans抗性基因的野生近缘种。这些材料属于S.avilesii(Rpi-avl1，Verzaux et al.，2011.Am.J.Pot.Res.88：511-519)、S.tarijensi(Rpi-tar1，Vossen et al.，2009；WO 2011034433)、S.chacoense(Rpi-chc1，Vossen et al.，2009；WO 2011034433)和S.venturii(Rpi-vnt1，Foster et al.，2009.MPMI 22：589-600；Pel et al.，2009.Mol Plant-Microbe Interactions 22：601-615)。抗性基因的不同来源如图8所显示。Solynta系是在杂交和重复自交原始供体系(D号)和Sli基因供体“DS”之后获得的(Lindhout et al.2011)。

基因分型

KASP基因分型系统是一种基于两个特异性正向引物和一个通用性反向引物的PCR方法(可在lgcgroup.com获得)，每个正向引物对SNP的两个等位基因中的一个是特异的。扩增片段在50-100个碱基对之间。将KASP基因分型外包给瓦格宁根的van Haeringen实验室(参见vhlgentics.com)。使用不同的序列信息源来寻找合适的SNP(Anithakumari et al.，2010.Mol Breeding，26：65-75；Uitdewilligen et al.，2013.PLoS One 8：e62355；Vos etal.，2015.Theor.Appl.Genet.128，2387-2401)并且使用SolCap阵列(可在solcap.msu.edu/potato_infinium.shtml获得)寻找额外的标记。SolCap实验外包给德国的TraitGenetics(参见traitgentics.com)

田间试验

在三个单独的田间试验中筛选Phytophthora抗性。主要位置在粘土中(瓦格宁根，荷兰)。另外两个用于确认和备份的位置在沙土处。其中一项在沙土上的试验是在HLB(Wijster，荷兰)的监督下进行的。田间生长季节为2017年6月至9月。Phytophthora在两个沙质土壤上是自发的，并且这些区中的一个以发生剧毒Phytophthora菌株而闻名。尽管在土壤的实验田上已经可以看到Phytophthora感染的第一个自发体征，但是在2017年7月20日用Phytophthora菌株IPO-C进行额外的人工接种，以确保田间具有均匀的疾病压力。该菌株在人工培养基(每100毫升水含1g琼脂、12g黑麦粒和3g蔗糖)上生长，转移到分离的叶片中，并在7天的潜伏期后收集。最终浓度为5×104个孢子/毫升并在田间生长的植物上喷洒10L。示范区由10-12株植物的44个区块组成。这些区块由三个亲本系(P1、P2、P3)之一的背景下的具有0、1或2个不同RPi基因的BC1xBC2或BC2xBC2杂交物组成。没有产生有等位基因的chc1和tar1抗性基因的组合的杂交体。从0(所有植物死亡)到10(所有植物完全健康)，目测各个块的总体疾病评分。

结果

亲本系

从Solynta的育种计划中选择三个不同的亲本系：P1、P2和P3。这些系的系谱可以追溯到与两到三个不同的二倍体创始体(“D-数”)(图9)的杂交。这些植物主要是基于田间性能和生产足够的花、浆果和种子的能力发展的。这使得能够执行几轮自交。在最后两次自交期间，筛选表现最好的后代植株的纯合性。这是通过在12个马铃薯染色体上均匀分布的一组信息分子标记(单核苷酸多态性，SNP)进行的。图9中显示了三个系的发展，P1、P2、P3最终的纯合性评分分别为88％、88％和79％。这些百分比低于预期，这可能是由于在自交群体中相对偏好选择更多杂合植物。

分子标记开发

基于SolCap阵列的筛选选择特异的抗性基因连锁的SNP标记(表8)，这些标记被用于选择有抗性基因的回交植物，以便进一步育种和在田间试验之前分别筛选BC1xBC2、BC2xBC2后代群体，以确定单株植物中Rpi基因的数量。使用总共67个其他SNP来确定BC1和BC2植株中的回归亲本百分比，选择这些SNP是因为它们在四株供体植株的组和三个亲本系的组之间是多态的(表9)。它们遍布整个基因组(数据未示出)。寻找用于选择avl1 Rpi-基因的正确标记所需的时间引起包括avl1的BC2杂交的延迟。为了在田间试验中包括有avl1基因的杂交体，我们使用有avl1 R基因的最佳BC1植物。这些BC1植物因此包含更多野生亲缘DNA，这使得与BC2xBC2杂交体相比，BC1xBC2群体更不统一。

材料开发

在图10中显示了制作有双堆叠抗性基因的杂交体的全过程。四个野生近缘种(S.avilesii、S.tarinjense、S.chacoense和S.venturii)与三个马铃薯亲本系杂交(图8)并获得足够数量的F1种子(表2和表3显示了不同步骤)。生长和开花抗性最好的F1植株与亲本回交(互交)。根据图11中显示的原理，用四个标记来筛选六个最佳BC1群体的2000株植物。这些标记使得在第一回交群体中选择45-70株有接近抗性基因的重组和相对较小的基因上下渗入的植物成为可能。基因渗入的最大尺寸取决于良好标记的位置(标记M1和M4的位置)。对45-70株BC1后代植物的总回归亲本基因组百分比进行基因分型。使用开花最好、最旺盛的BC1植株回交轮回亲本。在选择最佳BC2植物时，遵循相同的步骤(但现在对抗性基因的另一面)。这就产生了一些被用来制造杂交体的BC2植株。抗性基因avl1位于第11号染色体的顶部(1.8Mb)，并且因此仅需要在抗性基因的近端选择重组。整个背景选择是非常成功的，因为在两代BC之后，供体野生物种亲本的大部分基因组不再存在。如果没有标记筛选，这是不可能实现的。BC1和BC2植株中轮回亲本的百分比基本不同(图12)。

例如，在第一个BC2群体中，变化呈正态分布且介于60-90％之间(BC1值60％)，在第二群体中，在75-97％之间(BC1值52-60％)变化，并且对于其他群体获得类似的结果。用于选择亲本植物的主要标准是回归亲本基因组的高水平。在BC2和标记选择之后，需要自交以制作有抗性等位基因纯合子的亲本，该自交步骤也能是去除任何剩余的不需要的基因渗入的额外步骤。例如，在自交中留下两个基因渗入时，预期16株后代植物中的1株是Rpi基因区的纯合子，没有任何其他的基因渗入。有不同Rpi基因系的两个纯合系的杂交将自动产生有两个抗性基因的同基因杂交体。在本研究中，我们杂交了2株BC2植物(或者在S.avilesii的Rpi的情况下，杂交1株BC1和1株BC2植物)。因此，需要对Rpi基因的存在执行标记辅助选择(表3)。因为杂交体是通过将两个有抗性基因杂合子的亲本杂交而制成的，因此进行分子标记分析以将后代植物分成四类(有两个Rpi基因的植物、一个Rpi基因、另一个Rpi基因和没有Rpi基因的植物)。表4中给出了分离比。由于S.tarinjense 852-5的Rpi基因与S.chacoense 543-5的Rpi基因是等位的，可能这两种抗性具有相同的作用模式，因此增加了这些基因的组合每有附加值的风险，因此没有产生有这两种基因的组合的杂交体。

在表5中显示了产生了有所有四个预期的抗性基因组合的杂交体。然而，总体来说，没有Rpi基因的植物与有两个Rpi基因的植物的数量相比(759对427)存在偏好。该偏好表明来自野生源的基因渗入影响杂交体的生存力，使得有两个基因渗入的杂交体较少。这在实践中不是问题，其中杂交体的亲本是Rpi基因纯合子，并且100％的杂交体将是两个抗性基因的杂合子。

疾病评估

在2017年6月16日将植物移植到主田(粘土)之后，在2017年8月20日进行第一次疾病评分。由原始的三个亲本系(没有基因渗入)之间的杂交体组成的实验场的边界线均有严重疾病或已经死亡。大多数没有Rpi基因的杂交体后代植物也是重病的，但是偶尔有一或两株植物没有表现出严重的症状并且生长得令人惊讶地非常好。该田地抗性的原因仍然未知。标记和抗性基因或野生物种供体的未知基因组部分之间的重组可能使得植物没有明显症状。自发的感染造成最严重的损害，这种自发的感染必须是由于非常剧毒的Phytophthora菌株或基因型×环境相互作用。在8月份，所有有一个或两个Rpi基因的植物在三个位置都没有显示症状(表6)。有时可见小的叶损伤，但这些可能是由其他病原体引起的。三个位置的结果相对相似，并且每个区块的植物看起来相当一致，显示出BC2(vnt1、chc1、tar1)和BC1(avl1)亲本的杂合度水平相对较低。在8月份对组合的基因组合vnt1+chc1、tar1+vnt1、avl1+tar1、avl1+chc1、avl1+vnt1的疾病症状进行评分，它们的评分总体比有单一抗性基因的植物的评分高(表6)。出乎意料地，只有vnt1的植物的组合评分(9.2)比含vnt1和chc1的植物的评分高。这种小的差异可能是由于不同组中植物的数量(10-12)相对较少。由于三个位置的结果相似(表6)，我们专注于其中一个地点的结果，并于2017年9月20日进行了额外的评分。存在大多数抗性基因的组合。表6显示了，由于avl1的抗性下降最快(9月20日评分为4.7)，仅有单个Rpi基因的其他植物的抗性也下降了(7.6、7.9和6.0)。有两个Rpi基因的杂交体的抗性仍然高(8.3、8.0、7.0、8.3和8.0)。尽管个体的亲本的评分较低(分别为4.7和6.0)，avl1/chc1组合仍然是有抗性的(评分8.3)。

讨论

为了防止已经以长期和费力的方式引入植物品种中的抗性的迅速破坏，需要改变育种方法。这种新方法必须使得新品种更快发展，这些品种不仅有一个抗性基因，而且具有不同作用抗性基因的组合(在单个品种中堆叠抗性基因)。仅仅在它们的R基因组成上不同的成功的品种将使在单一栽培中生长农艺上相同的品种而不增加快速适应Phytophthora的机会成为可能。通过遗传修饰在一个成功的四倍体品种中引入两个或更多个R基因是可能的(Haverkort et al.，2016.Pot Res 59：35-66)。然而，在许多国家，它仍不被接受为植物育种的新工具。CRIPR-Cas9和类似技术也可以成功地将无功能的抗性基因转变为有功能的抗性基因。

Solynta选择了另一种方式来制造具有不同组的抗性基因的品种(Lindhout etal.，2011.Potato Res 54：301-312；Lindhout et al.，2018.“Hybrid potato breedingfor improved varieties”.In：Achieving sustainable cultivation of potatoesVol.1Breeding improved varieties.Edt.Burleigh Dodds，Science Publishing，Cambridge，UK.ISBN：978 1 78676 100 2；Meijer et al.，2018.Euphytica 214：121；doi.org/10.1007/s10681-018-2191-6；Niks et al.，Breeding Crops with resistanceto diseases and pests.Wageningen Academic Publishers，The Netherlands，2011)。马铃薯育种的Solynta方式具有许多优点，但是为了允许回交育种计划，最重要的变化是：(a)四倍体向二倍体商业品种的转变；(b)纯合二倍体系的育种；(c)制作杂交体；(d)生产真正的种子。过渡至二倍体的和引入自交亲和性使得选择表现良好的纯合系成为可能。这些系可用于回交计划中。在这项研究中，目的是通过回交计划在现有基因型中引入已知的P.infestans抗性基因。随着近些年二倍体马铃薯近交系的发展，完全纯合且可育的二倍体系在2015年本研究开始时尚未获得。我们的三个回交亲本为88％纯合子(P1和P2)和79％纯合子(P3)。这三个品系显示出生育力、自交亲和性和植物活力的最佳组合，而不考虑块茎性状。其他更多的纯合子植物不那么旺盛或不开花/结籽，因此不被选择。我们的研究旨在尽快产生双堆叠杂交体。因此，我们包括整个背景筛选。在单个BC1植株(60％纯合回归亲本)的BC2个体中的回归亲本百分比可以在60-90％之间变化。通过选具有高回归亲本百分比和相对小的基因渗入的生长良好的植物，可以获得有特异的R基因的高度纯合的BC2植物。BC2植物的一轮自交将产生有R基因纯合子的BC2S1植物，并且最终仍然可以选择没有供体亲本的罕见基因组片段。通过杂交同一自交系的两株植物，可以制作有不同R基因，双堆叠的杂交体。最终与四个或更多不同的R基因杂交是可行的。

种植后两个月，所有四个抗性基因的存在产生有高水平抗性(在8.6和10之间)的植物，一个月后(2017年9月20日)，所有有抗性基因组合的植物的抗性水平在8和9之间变化。唯一的例外是avl1+vnt1组合，其中抗性水平等于或甚至低于单独vnt1的抗性水平。这表明avl1不再有助于avl1+vnt1组合的抗性水平并且avl1似乎对耐久性无助力。尽管个体亲本抗性评分的值下降(分别为6.0和4.7)，chc1+avl1组合保持高抗性评分(8.3)。这说明在这种组合中，avl1仍然有助于使chc1和avl1植物有更耐久的抗性。

在这项研究中，我们显示出，在相对短的两到三年的时间内，可以在精良的二倍体马铃薯系中基因渗入和组合不同的Phytophthora infestans抗性基因。如果能够在气候室中优化条件以在一年中获得更多代，这甚至可能更快。在杂交体中不同抗性基因的组合显示出比仅存在单个抗性基因时更高的抗性水平。这些差异在时间上变得更明显，并表明更持久的效果。我们显示出以非常直接和快速的方式，可以在二倍体马铃薯中基因渗入有价值的基因(例如抗性基因)，并且这些基因能通过杂交制种进行堆叠。

实施例6 PSC在二倍体SC和SI马铃薯萌发的(germinated)花粉中的表达分析

为了更深入地了解所观察到的SC和SI表型的遗传基础，对SC和SI植物的已建立群体的花粉进行基因表达(RNA-seq)分析，并将所观察到的RNA-seq读数与关于RNA表达的公开数据进行比较以确认基因模型(表13)。在FPKM(每百万碱基的片段)中测量表达。确定观察到的表达产物完全支持与本文公开的PGSC0003DMG400016861一致的PSC基因模型。

材料与方法

植物材料

基因型17SC0011-1096、18SC0012-0076和18SC0012-0180是属于群体17SC0011和18SC0012的自交不亲和的二倍体F1后代，并且是PSC的SI等位基因的纯合子(psc/psc)。如上所述，存在多个psc等位基因，所有这些等位基因都赋予自交不亲和性的表型。基因型18SC0012-0151和17SC0011-1157是属于群体17SC0011和18SC0012的自交亲和的二倍体F1后代，并且是PSC的SC等位基因的杂合子(PSC/psc)。群体17SC0011和18SC0012描述于实施例3中。

气候腔室条件

所有植物均在气候腔室内含基质混合物的4l罐中从试管苗生长。这些植物生长在长日下，用产生300μMm^-2s^-1光的日光灯管产生18小时的光，和6小时的黑暗。温度在白天设定为20℃，在夜间设定为18℃，相对湿度恒定在70％。

花粉获取与萌发

使用实施例2中描述的方法获得来自植物17SC0011-1096、18SC0012-0076、18SC0012-0180、18SC0012-0151和17SC0011-1157的花粉。在获取后，通过将带有花粉的打开的Eppendorf管在含硅胶的空气密封盒中在室温下储存24小时来干燥花粉。然后，将花粉储存在-20℃直至进一步使用。

通过将2.5mg干燥花粉悬浮在5ml液体培养基(9％(w/v)蔗糖、50mg/L硼酸、73.5mg/L CaCl₂·2H₂O、118mg/L Ca(NO3)₂·4H₂O、123mg/L MgSO₄·7H₂O)中，在用封口膜密封的直径3.5cm的培养皿中进行花粉萌发。在室温下的125RPM的摇动培养箱中，在黑暗中使花粉在培养皿中萌发24h。然后使用经修改以增大孔径尺寸，从而不损坏花粉管的移液管尖端将含有萌发花粉的液体培养基小心地移入2ml Eppendorf管中。然后将Eppendorf管以2500rpm离心1分钟，并通过移液小心地除去培养基。然后将颗粒和一些剩余的培养基立刻在液氮中冷冻，加入两个直径为2mm的不锈钢珠，并使用TissueLyser II(Qiagen GmbH，希尔登，德国)在20Hz下研磨样品1分钟。

提取RNA

向研磨过的花粉样品中加入缓冲液RLT(Qiagen GmbH)，同时确保样品保持冷冻。然后，根据制造商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen GmbH，希尔顿，德国)执行RNA提取。将250-300bp的插入大小的cDNA文库测序为150nt的配对末端读数，每个样品产生3000万-4200万个读数对。

其他RNA-seq数据集

为了创造(组织特异的)表达水平的概况，从公共域(NCBI-SRA，日期2018/17/13)下载标记为ORGANISM“Solanum tuberosum”的所有配对末端测序RNA-seq数据集，总计441个配对fastq数据集。在这441个公共数据集中，3个是从花柱组织(SRR7402817-SRR7402819)和所有其他来自不同的非花粉组织、发育阶段和植物的材料产生的。

Solyntus参考组件

对于表达分析，最近获得的纯合子参考系Solyntus的组合草案(版本1.0，可从万维网www.plantbreeding.wur.nl/Solyntus/下载)被用作参考基因组。Solyntus是作为Solynta计划的一部分产生的基本上纯合的品种。这种独特的基因型是第一个马铃薯(Solanum tuberosum)基因型，它是高度纯合的、相对旺盛的和自交亲和的。本研究中的定位区间是通过基本相似性搜索从DM v4.03基因组组装(Sharma et al.，2013，G3：GenesGenomes Genetics 3(11)：2031-2047)到Solyntus 1.0基因组组装(使用blastn和bedtools)推断出来的，分别位于(Solyntus 1.0基因组组装坐标)53532708-53954293(区间I，421.6kb＜--628.9kb)、53683239-53867377(区间II，184.1kb＜--168.7kb)、53731620-53763003(区间III，31.4kb＜--27.4kb)和53753977-53763003(区间IV，9.0kb＜--12.6kb)。在括号之间分别是连续的定位区间号[Solyntus 1.0坐标]、Solyntus-1.0中的大小和DM-4.03/4.04中的大小。所有区间位于染色体ST4.03ch12_RaGOO(第12号染色体)上，并且在Solyntus 1.0组装中不包含单个间隙。区间大小变化是由对应DM序列中的大量间隙(N)和两个基因组之间的广泛变化引起的。DM基因组上的对应区间(DM-4.03/4.04)：区间I：chr12：58601503-59230363，区间II：chr12：58962004-59130723；区间III：59016142-59043512；区间IV：chr12：59030880-59043512(实施例3)。

Solyntus 1.0上的基因注释是有三个不同的基因目录推断出来的(马铃薯DM4.03[上面的]、2019年9月6日的ITAG4.0Tomato Genome Annotation Release[Femandez-Pozoet al.，2015Nucleic Acids Res.43：D1036-D1041]和Pepper-v.1.55[Kim et al.，2014.Nat Genet 46，270-278])，通过使用GeMoMa(v1.6.1)将它们定位到Solytus组装上。这样做是为了补偿单个基因目录中的缺陷，并最大化我们对可能的基因和/或表达的基因座的存在的认识。

RNA-seq读数定位和转录物丰度定量

使用hisat2(版本2.1.0)将所有5SC、3SI和所有441公共RNA-seq数据集定位到Solyntus参考基因组。将使用GeMoMa获得的杂交基因目录用于使用StringTie(版本2.1.1)和设置-t-c 5-f 0.05-G和GeMoMa级联的Solyntus1.0gff文件进行转录引导的丰度估计。评估以PSC基因座为中心的周围500kb区间中观察到的所有表达，在该区间中总共定位了90个(推断的)基因座。我们确认在SC样品中除了这些基因座之外没有任何明显的表达。在500kb区间中，在与如上定义的定位区间I至IV相交时，我们表示了随后较少数量的候选基因。

确认单倍型特异的表达

在500kb区间中的90个表达的基因座中，在所有SC/SI样品中仅8个表达高于20FPKM的选定阈值。我们使用这些位点来测量单倍型特异的(PSC或psc)表达水平差异。所选择的表达阈值能够使足够的读取深度最终且可靠地将表达式阶段化为(至多)2个单倍型。与PSC基因座本身(其在SI植物中缺乏表达)一起，这些8+1基因座在8个样品中的每一个样品中被单倍型化(samtool阶段版本1.7，默认设置)。产生的单倍型(配对的)fastq文件使用SPAdes(版本3.11.1)进行新的基因组装。过滤所产生的重叠群以获得充足的丰度和假定的全长mRNA，对应于主要(单倍型)表达的异构体。在一些情况下，这移除了选择性剪接的异构体，其中没有一种被充分的读数支持为有任何明显的生物学重要性。使用这些单倍型mRNA序列的变化来确(否)定是否在每个对应的基因座/样品中表达一个或两个单倍型。

结果

对几种SC和SI基因型进行RNA-seq分析，并与如上所描述的多种组织的精细表达目录进行比较。除了来自花柱组织的三个(公共)样品之外，在超过400个公共RNA-seq数据集样品中没有花粉相关的组织类型。在将花粉中的表达与这种广泛的表达目录进行比较时，显示在PSC所在的完整的500kb区间中，表达被显著调控，因为与任何(其他)组织相比，花粉中的表达是不同的。在比较许多条件下平均表达的许多基因在SC和SI花粉中都完全沉默，并且一些基因展现出花粉(和/或花柱)特异的表达。在一个区间中比较SC和SI花粉的表达水平时，甚至在我们的初始定位区间稍大时，只有两个候选基因有7倍的(PGSC0003DMG400016861，即psc)和5倍(PGSC0003DMG400008625)的显著表达差异。低于2的倍数变化被认为不显著，因此是不相关的。在这两种情况下，该基因仅在SC花粉中展现出生物学上相关的表达水平。第二个基因(PGSC0003DMG400008625)可以在第二定位区间(II)中被拒绝作为PSC的候选。两个连续的重组筛选都进一步减小了区间大小。在最离散的区间，PSC是单一表达的基因。RNA-seq研究的结果总结在表13中，并显示PSC表达可被注释到基因模型PGSC0003DMG400016861。

在观察单倍型特异的表达时，进一步加强了基因PGSC0003DMG400016861是PSC的观察。在所有SC样品(即PSC/psc)中都没有观察到RNA中的任何杂合子变体，就好像这些植物是纯合的PSC/PSC植物一样。通过限制性分析(实施例7)，我们能够确认这不是由这些基因型中的psc(偶然地)缺失引起的，显示这些植物的DNA含有psc(因此是真正的PSC/psc)。对相邻基因的单倍型特异的表达的观察进一步支持这一发现。检查有足够表达的相邻基因，并且所有(在mRNA的任何外显子中包含特异的变体)明显对应于PSC和psc单倍型的混合物。由此，我们得出结论，如表1所列并在实施例1中讨论的PSC和psc启动子之间的许多差异确实改变了PSC蛋白的调控。PSC启动子，而不是其psc对应物，能够使花粉特异的上调，允许PSC蛋白在花粉中表达，并产生含PSC基因的植物的自交亲和的表型。

出乎意料地，在来自三个SI花粉样品的两个中检测到一些PSC单倍型特异的表达。这小于来自SC基因型的花粉的PSC单倍型特异的表达的1％。由于所有基因表达均来自在SI基因型中不存在的PSC等位基因，因此认为这种背景表达是由于在基因表达研究的工艺流程中引入的杂质所致。我们通过相同的单倍型特异的限制性位点分析(参见实施例7)确认这三种SI基因型都是psc/psc，因此缺乏PSC，从而确认了这种PSC表达的低水平是由杂质引起的考虑。

实施例7使用新型CAPS标记的单倍型特异的限制性位点分析

方法

DNA提取、PCR条件、酶切和凝胶电泳

根据制造商的方案，使用Phire Plant Direct PCR试剂盒(Thermo FisherScientific，不来梅，德国)进行DNA提取和PCR。PCR扩增子在37℃下酶切2小时。PCR扩增子和限制片段在2％琼脂糖凝胶上显影。通过与GeneRuler^TMlkb plus DNA阶梯状电泳条带(赛默飞世尔科技公司，不来梅，德国)比较来决定片段大小。

结果

为了确定马铃薯中PSC基因的SC等位基因的存在，我们在PSC的编码序列中开发了CAPS标记，该标记能够区分SC等位基因和SI等位基因。首先，我们识别了存在于我们的全基因组测序的基因型中的PSC基因座的所有变化。然后，我们确定哪些变体仅存在于我们的SC基因型中(实施例4)。基于这些结果，我们确定了仅存在于我们的SC基因型中的几个SNP(表1)。我们在SNP 59040898(a＞g，DM＞DS)上发展了CAPS标记。该CAPS标记由PSC外显子1上的引物对和限制性内切酶Eco32I组成。引物扩增186bp长的扩增子。在SC PSC等位基因中，存在允许酶切扩增子成92bp和94bp长片段的Eco32I限制性位点。

我们在五种SI基因型(psc/psc)、七种SC基因型PSC杂合子(PSC/psc)和一种基因型PSC纯合子(PSC/PSC)上测试了该标记(图15)。

虽然在一个SI基因型(18SC12-180)上的PCR反应失败，所有其他基因型显示了预期结果：PSC杂合子显示存在原始186bp扩增子和消化产物(18SC12-194、18SC12-151、psc-019、17SC11-1023、17SC11-1157、17SC11-1149和17SC25-008)两者，psc纯合子显示仅存在原始186扩增子(18SC12-076，18SC11-1104、17SC11-1031和17SC11-1096)而PSC纯合子显示仅存在消化产物。

实施例8 PSC转基因植物的产生

为了确认SEQ ID NO：6是PSC基因的SC等位基因，我们设计了能够在SI基因型中转基因表达SC等位基因的载体。

材料与方法

植物材料

基因型18SC0012-076和18SC0012-180是来自群体18SC0012的SI F1植物。基因型17SC0011-1104是来自群体17SC0011的SI F1植物。群体18SC0012和17SC0011描述于在实施例3中。

表达构建体的设计

我们使用PSC供体植物DS的序列(实施例2，SEQ ID NO：6)来设计PSC表达盒。为了允许PSC的天然表达，我们构建了含天然启动子(起始密码子上游1563bp)、三个外显子和天然终止子(终止密码子下游740bp)的核酸序列(SEQ ID NO：17)。因此，从供体植物DS的PSC基因中除去两个内含子。该序列通过Genscript(Genscript Biotech，莱顿，荷兰)合成并克隆到pBINPLUS中。我们将含PSC插入的载体称为pBINPLUS-PSC。

pBINPLUS-PSC转化至Agrobacterium tumefaciens中

我们使用电穿孔方案将pBINPLUS-PSC质粒转化至A.tumefaciens菌株AGL0中。取40μl的AGL0感受态细胞，并加入110μl冰冷的milliQ水。我们用移液管将50μl该混合物移入在冰上经预冷的Eppendorf管中，并加入1μl质粒。我们将细胞在冰上静置15分钟，并将细胞转移到经预冷的电穿孔比色皿中。我们用Micropulser^TM(Bio-Rad实验室，Veenendaal，荷兰)的程序Ec1(1.8kV，0.1cm比色皿)电穿孔该混合物。我们加入1ml LB，在28℃和200RPM的摇床上孵育细胞3小时。然后，用转化培养物接种含利福平(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板。我们从LB板中挑选8个菌落，并使用M13引物和插入特异的引物筛选是否存在构建体。确认所有选择的菌落含有正确的载体。

马铃薯SI基因型的转化

我们使用Visser(Visser，1991，Plant tissue culture manual.Springer，Dordrecht，pp：301-309)描述的茎外植体方法用pBINPLUS-PSC转化基因型18SC0012-076、18SC0012-180和17SC0011-1104。再生后，在含头孢噻肟(200μg/ml)、万古霉素(200μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的MS20培养基上生长芽。在芽达到足够长的情况下，进行扦插并在无抗生素的MS20中生长。在没有抗生素的MS20中生长两周后，将植物种植在气候腔室中。

气候腔室条件

气候腔室中的转基因植物和未转化对照生长在与实施例6中所描述的相同的条件下。

自花授粉花柱的显微观察

使用与实施例2中所描述的相同的方法观察花粉管生长。

倍性分析

通过植物细胞测定服务(迪丹，荷兰)使用流式细胞仪确定转基因植物和未转化对照的倍性。

结果

我们从18SC0012-076基因型获得34个转化再生体，从18SC0012-180基因型获得7个转化再生体，从17SC0011-1104基因型获得23个转化再生体。我们基于芽的大小进行选择以转移到气候腔室。这种选择由源自18SC0012-076的5株独立转化的植物、源自17SC0011-1104的9株独立转化的植物和源自18SC0012-180的3株独立转化的植物组成。我们也种植了来自18SC0012-076和17SC0011-1104的非A.tumefacien对照，它们经历了转化方案的所有步骤，除了A.tumefacien接种，并且在不含卡那霉素的MS-20培养基上生长。此外，我们种植了来自所有三种基因型的未转化对照，这些基因型根本没有经历转化方案。我们种植的来自每个独立转化的基因型和对照有1、2或3个克隆。

在气候腔室中生长两周后，我们注意到转基因植物与未转化对照相比的形态差异。值得注意的是，一些转基因植物展现出扩大的叶和花，使我们怀疑这些植物已经变成四倍体。因为已知由于异等位花粉效应，四倍体马铃薯是自交亲和的，因此这些转基因不能用于确认PSC的功能(de Nettancourt，1977，Incompatibility in Angiosperms.Springer-Verlag，Berlin；McClure et al，2011，Annals of botany 108.4：647-658)。

为了确定我们的怀疑是否正确，我们从所有植物中获得叶样品并分析倍性水平。虽然许多转基因型确实是四倍体(11/17)，但一些是二倍体(6/17)。在非转基因对照中，只有一个非A.tumefaciens对照基因型是四倍体，所有其他基因型是二倍体(表15)。

花粉管生长

使用实施例2中描述的方法通过紫外显微镜研究转基因和未转化的18SC0012-180的花柱。在PSC转基因植物(图18a)中，许多花粉管深入到花柱中，而在未转化的对照植物(图18b)中，如在自交不亲和的植物中预期的那样，花粉管生长到花柱中受到严重损害。

我们得出结论，PSC基因在PSC转基因的18SC0012-180中表达，并且这些植物被成功转化为自交亲和的表型。

SEQ ID NO：9

＞DM-PGSC0003DMT400043434

SEQ ID NO：10

＞PSC-PGSC0003DMT400043434

表1在比较DM4.04参考序列与PSC序列时，第12号染色体上PSC区的改变(基于VCF输出的简化输出)。

表6对每个地区的Rpi基因不同组合的范围为0(死亡)至10(完全抗性)的平均评分

表7育种系DS的原始二倍体亲本(Hosaka and Hanneman，1998.Euphytica 103：265-271)，D1和D16(Hutten et al.，1994.Thesis，Wageningen University，Wageningen，ISBN 9054852925)。基于Vos et al.，2015.2015.Theor Appl Genet 128：2387-2401的20k马铃薯阵列的试验计算纯合性水平。

表12本文中提供的PSC基因和转录物的序列

Claims

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列和与所述氨基酸序列有至少70％的序列一致性并赋予马铃薯植物自交亲和性的序列。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，在所述植物的花粉中表达的情况下，与所述氨基酸序列有至少70％序列一致性的所述序列赋予马铃薯植物自交亲和性。

3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子，进一步包含与编码所述蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子，其中，所述启动子在植物细胞中，优选在花粉中启动编码所述蛋白质的所述核酸序列的转录。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中，所述启动子包含位于Solyntus 1.0基因组组装的坐标53954293至53532708处的天然PSC基因的截短或非截短启动子区，优选其中，所述启动子至少包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的核酸序列。

5.一种启动子核酸序列，所述启动子核酸序列包含以下项或由以下项组成：如SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20所示的核酸序列，和与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20有至少80％序列一致性并且有在植物花粉中表达基因，优选如权利要求4中所定义的PSC基因的启动子活性的序列。

6.一种赋予马铃薯植物自交亲和性的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子由选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列及与它们有至少70％序列一致性并赋予马铃薯植物自交亲和性的序列组成。

7.一种含马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因的分离的核酸分子，所述马铃薯自交亲和性(PSC)基因的自交亲和性等位基因是如SEQ ID NO:1或5所示的基因A的野生型S.tuberosum等位基因的突变序列，所述基因A编码在植物中赋予配子体自交不亲和性的产物，所述突变序列与SEQ ID NO:1或5有至少70％的序列一致性，并且其中，所述突变序列编码抑制植物中配子体自交不亲和性的产物。

8.根据权利要求7中所述的含PSC的自交亲和性等位基因的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码如SEQ ID NO:9所示的蛋白质。

9.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与权利要求7或8所述的核酸分子或其互补序列杂交。

10.一种重组的核酸构建体，所述重组的核酸构建体包含根据权利要求1-4或6-9所述的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至在植物中起作用的启动子，优选权利要求5所述的启动子。

11.一种载体，所述载体包含权利要求10所述的重组的核酸构建体。

12.一种植物原生质体、细胞或愈伤组织，所述植物原生质体、细胞或愈伤组织用权利要求10所述的重组的核酸构建体或权利要求11所述的载体转化，所述植物优选是马铃薯植物，更优选是S.tuberosum组Tuberosum植物。

13.一种转化的植物，所述转化的植物由权利要求12所述的原生质体、细胞或愈伤组织再生。

14.权利要求13所述的转化的植物，其中，存在权利要求10所述的重组的核酸构建体或权利要求11所述的载体，优选以同源重组的形式取代S.tuberosum植物的内源基因组序列。

15.权利要求13或14所述的转化的植物的部分，其中，所述部分是分离的细胞、繁殖材料或分离的器官，优选块茎或种子。

16.一种食品，所述食品由权利要求15中的细胞、繁殖材料和器官中的至少一种制备。

17.一种用于选择S.tuberosum植物的方法，所述方法包含在所述S.tuberosum植物的基因组中筛选权利要求1中所定义的突变序列或权利要求2中所定义的核酸分子的存在，优选包含在所述S.tuberosum植物的基因组中筛选表1所示的PSC序列特异的单核苷酸序列多态性(SNP)或多核苷酸多态性(PNP)的存在。

18.一种用于生产植物的方法，所述植物在其基因组中包含马铃薯自交亲和性(PSC)的自交亲和性等位基因的至少一个拷贝，所述拷贝的产物在植物中抑制配子体的自交不亲和性或赋予自交亲和性，所述方法包含以下步骤：

a)通过执行权利要求17所述的方法来选择植物；

b)将所选择的植物与另一植物或其自身杂交以产生种子；

c)任选地将所述种子种植成植物以产生后代植物；

d)进一步任选地重复步骤b)和c)的杂交及种植步骤，以及

e)任选地从后代植物中选择所述等位基因在其中以纯合或杂合形式存在的植物。

19.根据权利要求18中所述的方法，其中，步骤a)和/或e)中的所述选择通过使用针对突变的等位基因的多态性标记的标记辅助选择来执行。

20.根据权利要求18-19中任一项所述的方法，其中，所述植物是马铃薯植物，更优选是Solanum tuberosum种的植物。

21.一种植物，所述植物能通过权利要求18-20中任一项所述的方法获得。

22.权利要求21所述的植物，进一步包含选自以下每一种Phytophthora infestans抗性基因中的至少一个等位基因：

-S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1，Chr11(位置～1.8Mb)；

-S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1，Chr10(位置～53Mb)；

-S.chacoense 543-5 Rpi-chc1，Chr10(位置～53Mb)，和

-S.venturii 283-1 Rpi-vnt1，Chr9(位置～51Mb)。

23.权利要求21或22所述的植物，其中，所述植物包含权利要求1-4或6-9中的任一项所定义的核酸序列，并且其中，所述植物不包含存在于基因组标记SOT12-58962004和SOT12-59130723之间的基因组区的不赋予自交亲和性的一种或更多种基因。

24.一种马铃薯植物，所述马铃薯植物包含权利要求1-4或6-9中任一项所定义的核酸序列，并且进一步包含选自以下每一种Phytophthora infestans抗性基因中的至少一个等位基因：

-S.avilesii 478-2 Rpi*-avl1，Chr11(位置～1.8Mb)；

-S.tarinjense 852-5 Rpi-tar1，Chr10(位置～53Mb)；

-S.chacoense 543-5 Rpi-chc1，Chr10(位置～53Mb)，和

-S.venturii 283-1 Rpi-vnt1，Chr9(位置～51Mb)。

25.权利要求21-24中任一项所述的植物的植物部分，优选块茎或种子。

26.一种食品，所述食品由权利要求25所述的植物部分制备。

27.一种S.tuberosum马铃薯植物，其中权利要求1中所定义的马铃薯自交亲和性(PSC)基因PSC基因的至少一个等位基因被功能性失活或者被功能性激活以在所述植物中提供向所述植物赋予自交亲和性的基因，失活优选通过使用CRISPR-CAS、TALEN和CRE-LOX中的任一项进行，所述赋予自交亲和性的基因包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列及与它们有至少70％序列一致性且使用优选CRISPR-CAS、TALEN和CRE-LOX中的任一项赋予自交亲和性的序列。

28.一种S.tuberosum马铃薯植物，其中权利要求7中所定义的基因A的野生型S.tuberosum等位基因在功能上被恢复，恢复优选通过使用CRISPR-CAS、TALEN和CRE-LOX中的任一项来进行。

29.一种标记，所述标记用于表1所示PSC序列特异的单核苷酸多态性(SNP)或多核苷酸多态性(PNP)的特异性检测，优选其中，所述标记是用于表1所示位置59040898处(a>g，DM>DS)的SNP的特异性检测，优选其中，所述标记是CAPS标记，所述CAPS标记包含用于扩增外显子1上含SNP位点的区域的PCR引物对并且进一步包含用于在PCR扩增的片段上检测所述SNP的限制性内切酶，优选其中，所述限制性内切酶是Eco32I，优选其中，所述引物对由SEQ IDNO:15的正向引物和SEQ ID NO:16的反向引物组成，优选其中，通过所述限制性内切酶酶切186bp扩增子产生94bp和92bp片段，表示存在所述PSC序列特异性的单核苷酸多态性(SNP)。