CN110894539B - 鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法,涉及遗传育种的技术领域。所述方法在于鉴定二倍体马铃薯中的StSCI基因是否转录和表达。还公开了采用分子标记鉴定StSCI基因是否表达,以及筛选分子标记的方法包括:获得亲本材料的基因组序列信息、筛选亲本材料的差异位点、筛选分子标记和鉴定筛选的分子标记是否可用。采用筛选出的分子标记对二倍体马铃薯的自交亲和性进行鉴定,具有鉴定工作量小,节省了大量时间,而且鉴定结果不受环境影响,准确可靠等优点。

Description

鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法
技术领域
本发明涉及遗传育种的技术领域,具体涉及一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法、筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法、试剂、试剂盒和鉴定方法。
背景技术
在二倍体马铃薯育种过程中,二倍体马铃薯通常是自交不亲和的,当自身或与该植株具有相同S单倍型的花粉落在柱头上时,花粉管不能一直延伸至胚珠完成受精过程,因此与自身的S单倍型相同的花粉是不能让二倍体马铃薯植株产生种子的。为了在二倍体马铃薯育种中实现实生种子育种,有些研究致力于通过基因编辑而改变二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷。
但对自交亲和的二倍体马铃薯材料的鉴定一直都是很困难的。当前对二倍体马铃薯植株自交亲和表型的鉴定,需要植株生长至盛花期,用自身花粉进行大量的授粉工作,根据授粉后植株是否坐果判断植株的自交亲和性。但是植株坐果受到多种内外因素的影响,例如花粉发育不成熟导致花粉活性低、授粉时高温或者低温均影响植株坐果,而且马铃薯作为显花植物,可能因风吹或授粉时镊子没有处理干净而造成相邻植株间因串粉而导致的杂交坐果,因此单一年份植株不坐果或坐果数目少也不能准确代表该植株的自交亲和表型,需要多地点多年份的重复鉴定,因此传统自交亲和表型的鉴定方法耗时耗力且并不准确。因此,亟需研发一种简单、快速和准确的自交亲和表型的鉴定方法。
发明内容
有鉴于此,本发明致力于提供一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法,主要采用分子标记鉴定,筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法,采用筛选出的分子标记对二倍体马铃薯的自交亲和性进行鉴定,鉴定工作量小,节省了大量时间,而且鉴定结果不受环境影响,准确可靠。
本发明一方面提供了一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法:鉴定二倍体马铃薯中的StSCI基因是否转录和表达。
二倍体马铃薯材料RH89-039-16(参见文章Self-Fertility in a CultivatedDiploid Potato Population Examined with the Infinium 8303Potato Single-Nucleotide Polymorphism Array)是自交亲和的,二倍体马铃薯材料RH89-039-16的自交亲和性状是由一个基因控制的,这个基因命名为自交亲和诱导基因(self-compatibilityinduction gene,SCI),简写为StSCI基因。
研究发现,在二倍体马铃薯材料RH89-039-16中,StSCI基因位于12号染色体上,并且RH89-039-16在12号染色体上是杂合的,如果StSCI基因正常表达,可使得该二倍体材料由自交不亲和转变为自交亲和。StSCI基因在多数二倍体马铃薯材料中启动子缺乏活性,不能正常启动StSCI基因的表达,而在二倍体马铃薯材料RH89-039-16中,StSCI基因的启动子区域插入了一段538bp的特异性片段,这个片段中含有一个核心启动子元件,使得启动子具有了启动StSCI基因表达的活性,使StSCI基因在花粉中的表达。
StSCI基因编码的蛋白称为StSCI蛋白,StSCI蛋白具有抑制多种S-RNase的细胞毒性作用,从而阻止S-RNase降解花粉管中的rRNA和解聚花粉管中的细胞骨架,减少S-RNase对花粉管细胞的损伤,保证花粉管的正常延伸,使花粉管可以一直延伸至胚珠完成受精过程,进而克服了二倍体马铃薯材料的自交不亲和性,因此StSCI基因能够正常表达的二倍体马铃薯植株是自交亲和的。
进一步,所述StSCI基因的核苷酸序列包含或由如下序列组成:
1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或,
2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列;
优选地,其中所述同源序列为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列约90%或以上、91%或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上的多核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述StSCI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述StSCI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的互补序列。互补序列为能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
示例性地,所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性,且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性,可以鉴定与探针100%互补的靶序列。可选择地,可以调节严格条件以允许一些序列错配,使得探测到较低程度的相似性。
在本发明的一种实施方式中,所述StSCI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的简并序列。简并序列是指改变SEQ ID NO.1核苷酸某个或多个核苷酸序列后,改变的核苷酸序列位置对应编码的氨基酸种类不变,不会影响StSCI基因的功能和表达水平。
在本发明的一种实施方式中,所述StSCI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源序列。同源序列包括但不限于SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有约90%或以上、91%或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、99.9%或以上同一性的多核苷酸。
进一步,采用分子标记鉴定StSCI基因是否表达。
进一步,一种筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法,包括以下步骤:
(a)获得亲本材料的基因组序列信息:
采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯为亲本材料,对RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯进行基因组测序重测序,获得基因组序列信息;或
根据参考基因组的序列信息,开发对应的引物,对亲本材料的目标基因片段进行PCR扩增,对扩增产物进行序列测定,获得亲本材料特定片段的序列信息。
需要说明的是,对于自交不亲和的二倍体马铃薯的种类不作具体限定,能够满足自交不亲和,且为二倍体的马铃薯材料均可以用于本发明中。
进一步,自交不亲和的二倍体马铃薯的种类可以为但不限于PI 225689、DM1-3516R44、Solanum Chacoense、S15-65。优选交不亲和的二倍体马铃薯为PI 225689。
本发明将具有自交亲和性的二倍体马铃薯材料RH89-039-16作为亲本,与自交不亲和的二倍体马铃薯进行杂交获得杂交后代,进而将控制RH89-039-16自交亲和性的核苷酸序列通过基因重组的方式转移入二倍体马铃薯杂交后代中,构建包含有双亲优良性状的自交亲和系。
此时,先将亲本材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯进行基因组重测序,以便于寻找两亲本之间的基因组的序列差异,不仅可以用来研究RH89-039-16能够自交亲和的原因,还可以通过基因组的差异开发用于鉴定二倍体马铃薯自交亲和性状的分子标记。
或者,采用引物扩增的方式,对亲本材料的目标染色体片段进行PCR扩增,对扩增产物进行序列测定,获得亲本材料特定片段的序列信息,通过比对两种亲本材料中特定片段的序列信息的差异开发用于鉴定二倍体马铃薯自交亲和性状的分子标记。
(b)筛选亲本材料的差异位点
对两种亲本材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的序列信息进行比较,筛选出StSCI基因核苷酸序列和/或StSCI基因连锁的差异核苷酸序列位点;核苷酸序列的差异位点包括:单碱基差异位点和/或插入缺失标记。
需要说明的是,“分析StSCI基因核苷酸序列和/或StSCI基因连锁的核苷酸序列”代表三种分析方式:(1)分析StSCI基因核苷酸序列;(2)分析StSCI基因连锁的核苷酸序列;(3)分析StSCI基因核苷酸序列和StSCI基因连锁的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,对两种亲本材料RH89-039-16和PI 225689的基因组序列进行分析,通过分析StSCI基因核苷酸序列筛选出RH89-039-16与PI 225689之间的单碱基差异位点。
在本发明的一种实施方式中,对两种亲本材料RH89-039-16和PI 225689的基因组序列进行分析,通过分析StSCI基因核苷酸序列筛选出RH89-039-16与PI 225689之间的插入缺失标记。
在本发明的一种实施方式中,对两种亲本材料RH89-039-16和PI 225689的基因组序列进行分析,通过分析StSCI基因连锁的核苷酸序列筛选出RH89-039-16与PI 225689之间的单碱基差异位点。
在本发明的一种实施方式中,对两种亲本材料RH89-039-16和PI 225689的基因组序列进行分析,通过分析StSCI基因连锁的核苷酸序列筛选出RH89-039-16与PI 225689之间的插入缺失标记。
(c)筛选分子标记
针对步骤(b)中筛选出的单碱基差异位点,设计KASP标记引物序列;和/或,针对步骤(b)中筛选出的插入缺失标记,设计InDel标记的引物序列。
在本发明的一种实施方式中,设计KASP标记引物序列的方法是:在差异的单碱基序列上下游各保留n个碱基,进而设计出包含中间存在差异的单碱基的2n+1个碱基的引物序列,其中示例性地,n可为3-100,5-80,20-90,30-80,40-70或50-60;
在本发明的一种实施方式中,设计InDel标记引物序列的方法是:在存在插入缺失位点的上下游各设计合适的引物片段,设计出合适的引物对,由于这段序列存在碱基数目的改变,使用引物对把包含插入缺失位点的碱基序列经过PCR扩增后,再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)进行鉴定,可以观察到条带的差异。
(d)鉴定开发的分子标记是否可用
鉴定步骤(c)中筛选的分子标记是否与所述RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯亲本材料,以及RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的杂交后代的基因组测序的结果相同,结果相同则分子标记可用。
在本发明的一种实施方式中,筛选的KASP分子标记用于鉴定RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的杂交后代中二倍体马铃薯是否自交亲和时,经过比对分析KASP结果来确定杂交后代的基因组中是否存在单碱基差异位点,单碱基差异位点是与RH89-039-16相同,还是与自交不亲和的二倍体马铃薯相同来判断杂交后代是否自交亲和。
在本发明的一种实施方式中,筛选的InDel标记用于鉴定RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的杂交后代中二倍体马铃薯是否自交亲和时,经过比对分析PCR产物电泳后的条带差异来确定杂交后代的基因组中是否包含插入缺失片段,以此来判断杂交后代是否自交亲和。
进一步,所述步骤(b)中,基因连锁的遗传距离小于20cM。
在分析亲本材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的基因组中的差异序列时,不仅可以主要针对StSCI基因核苷酸序列中寻找差异序列,也可以在遗传距离小于20cM的StSCI基因连锁的核苷酸序列中寻找差异序列。由于是连锁遗传的原因,StSCI基因和StSCI基因连锁的核苷酸序列中的差异序列会同时通过基因重组的方式进入子代中,针对寻找出的差异序列开发的分子标记均可以用于鉴定亲本杂交后代是否自交亲。
基因连锁的遗传距离包括但不限于:1cM、2cM、3cM、4cM、5cM、6cM、7cM、8cM、9cM、10cM、11cM、12cM、13cM、14cM、15cM、16cM、17cM、18cM、19cM、19.5cM或19.9cM。
基因连锁的遗传距离越小,连锁强度越高,则发生交换的频率越低。若开发的分子标记与StSCI基因之间的遗传距离是20cM,则用该分子标记鉴定后代自交亲和性时有20%的遗传交换率,则对杂交后代进行自交亲和性鉴定的准确度介于60%与80%之间,即对100株二倍体马铃薯植物进行鉴定后,其中60到80株鉴定结果是准确的。
进一步优选地,所述步骤(b)中基因连锁的遗传距离小于10cM。
基因连锁的遗传距离包括但不限于:1cM、2cM、3cM、4cM、5cM、6cM、7cM、8cM、9cM、9.5cM或9.9cM。
优选减小开发的分子标记与StSCI基因之间的遗传距离,可以进一步提高分子标记鉴定的准确度。若开发的分子标记与StSCI基因之间的遗传距离是10cM,则用该分子标记鉴定后代自交亲和性时有10%的交换率,则对杂交后代进行自交亲和性鉴定的准确度介于80%与90%之间,即对100株二倍体马铃薯植物进行鉴定后,其中80到90株的鉴定结果是准确的。
进一步,所述步骤(b)中,通过分析StSCI基因核苷酸序列和/或StSCI基因连锁的核苷酸序列,筛选出RH89-039-16相较于自交不亲和的二倍体马铃薯中,StSCI基因的启动子区域插入了一段核苷酸序列,所述的核苷酸序列包含或由如下序列组成:
1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;或,
2)与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的功能性同源序列;或,
3)在严格条件下与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸。
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列,它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列,多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。启动子的序列长度并不能准确地确定,只要包含核心启动子片段在内的启动子均可以使StSCI基因表达。
在本发明的一种实施方式中,所述的插入序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述的插入序列的核苷酸序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的功能性同源序列。
优选地,其中同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列约90%或以上、91%或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、99.9%或以上同一性的多核苷酸。
在本发明的一种实施方式中,所述的插入序列的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸。
示例性地,所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性,且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性,可以鉴定与探针100%互补的靶序列。可选择地,可以调节严格条件以允许一些序列错配,使得探测到较低程度的相似性。
本发明另一方面提供上述筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法获得的分子标记。
分子标记包括但不限于KASP标记、InDel标记、RFLP标记、RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、AFLP标记、STS标记或EST标记中的一种或几种的组合。
在本发明的一种实施方式中,所述分子标记为KASP分子标记。
KASP分子标记可以针对二倍体马铃薯杂交后代中的单碱基差异位点进行检测,并且可以同时针对多个单碱基差异位点开发相应的KASP分子标记,同时快速检测差异,还可以提高鉴定的准确度。
在本发明的一种实施方式中,所述分子标记为InDel分子标记。
InDel分子标记可以针对二倍体马铃薯杂交后代中的插入缺失片段进行检测,根据InDel分子标记引物的PCR产物电泳后的条带差异来确定杂交后代的基因组中是否包含插入缺失片段,检测结果比较直接,鉴定的准确度高。
KASP标记引物和InDel标记的引物可以单独使用,也可以组合使用。
本发明另一方面提供包含上述分子标记的试剂。
对上述试剂的具体种类不进行限定,包括所述分子标记即可,如可以包括但不限于KASP分子标记和InDel分子标记。上述试剂可以用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和。
本发明另一方面提供,包含所述的分子标记,或所述的试剂的试剂盒。
对试剂盒的具体种类不作限定,但需包括所述的分子标记,或所述的试剂,还可以包括其它成分,如PCR聚合酶、缓冲液、dNTPs等。所述试剂盒可以用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和。
本发明另一方面提供一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,采用所述的分子标记,或所述的试剂,或所述的试剂盒鉴定二倍体马铃薯是否自交亲。
通过对二倍体马铃薯的基因组中特定核苷酸序列的鉴定(如是否包含单碱基差异位点或插入缺失片段)来判断是否具有自交亲和的能力,还可以根据核苷酸序列的鉴定结果,来判断出待测二倍体马铃薯植物中的StSCI基因处于纯合表达状态还是杂合表达状态,如此一来可以判断后代的自交亲和表型是否会发生分离,对育种中自交亲和亲本的选育工作具有重要意义,这是传统鉴定方法不具备的能力。
使用分子标记进行鉴定,可以在二倍体马铃薯苗期时提取其基因组进行鉴定,无需二倍体马铃薯生长至盛花期来观察是否能够自花授粉而确定是否自交亲和,工作量小,节省了大量时间。而且使用分子标记进行鉴定的鉴定结果不受环境影响,准确可靠。
在本发明的一种实施方式中,所述鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,包括以下步骤:
(i)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交,得到二倍体马铃薯杂交后代;
(ii)待杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组;
(iii)采用所述的分子标记对叶片的基因组进行鉴定,根据分子标记的鉴定结果,判断二倍体马铃薯杂交后代是否自交亲和。
在本发明的一种实施方式中,所述鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,包括以下步骤:
(i)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交,得到二倍体马铃薯杂交后代;
(ii)提取二倍体马铃薯杂交后代植物细胞的RNA,采用PCR方法检测二倍体马铃薯杂交后代植物细胞中是否存在StSCI基因mRNA本身或者其特征片段。
采用该方法可以直接检测杂交后代马铃薯植物中StSCI基因是否转录为mRNA,方法准确,且快捷简单。
相当于传统自交亲和表型的鉴定方法,本发明采用上述技术方案具有以下有益效果:
(1)本发明通过使用分子标记对二倍体马铃薯是否自交亲和进行鉴定,可以在二倍体马铃薯苗期时提取其基因组进行鉴定,无需二倍体马铃薯生长至盛花期通过传统表型鉴定方式去确定是否自交亲和,工作量小,节省了大量时间;
(2)本发明使用分子标记进行鉴定,直接通过检测样本的基因组来得出鉴定结果,鉴定结果不受环境影响,准确可靠;
(3)本发明根据分子标记鉴定结果,可以判断出待测二倍体马铃薯植物中的StSCI基因的纯合状态,进而判断后代的自交亲和表型是否会发生分离,对育种中自交亲和亲本的选育工作具有重要意义。
附图说明
图1所示为实施例1中PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测图;
图2所示为实施例1中单株A和B中StSCI基因的表达情况;
图3所示为实施例1中杂交后代自交亲和表型鉴定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
定义
术语“自交亲和性”是指在通过自花授粉、自体受精产生且能长出可育后代并产生种子的能力。
本文所用的术语“二倍体”是指在植株中每个营养细胞包含两组染色体(2x=2n,其中n为染色体的数量)。一组染色体由两个亲本提供。
本文中所用的术语“基因”被定义为在染色体中占据特定位置并包含对植株潜在的表型特征或性状作出贡献的遗传指令的遗传单位(通常用DNA序列表示)。
本文中所用的术语“杂交”是指利用雄株(或配子)使雌株(或配子)受精。术语“配子”是指由配子体有丝分裂在植株中产生的涉及有性生殖的单倍体生殖细胞(卵子或精子),在有性生殖期间两个异性配子融合形成二倍体合子。这个术语通常涉及花粉(包括精细胞)和胚珠(包括卵细胞)。因此“杂交”通常是指用另一个体的花粉使某一个体的胚珠受精。
术语“重组”是指减数分裂过程中两个同源染色体之间发生信息交换。在“重组”植株中,原本存在于染色体内的特定位置上的DNA(例如与基因/位点连接)与来自另一植株的DNA发生交换(即母本与父本交换或反之)。
术语“单碱基差异位点”,即SNP(ssingle nucleotide polymorphism),是指基因组水平上,两个亲本中存在的单个核苷酸(碱基)的差异位点。
术语“KASP标记”,KASP是Kompetitive Allele Specific PCR竞争性等位基因特异性PCR的缩写。
术语“KASP标记引物”是针对单碱基差异位点设计开发的引物。
术语“插入缺失标记”,即InDel(insertion-deletion),指的是两种亲本在基因组中的差异,相对另一个亲本而言,其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。
术语“InDel标记引物”是指根据基因组中插入缺失位点,设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物。
实施例1
一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法,包括以下步骤:
(1)对亲本材料RH89-039-16和PI 225689的基因组重测序:
RH89-039-16是自交亲和的马铃薯二倍体材料,PI 225689是自交不亲和的二倍体马铃薯材料,使用这两个材料为亲本进行杂交后,后代出现了自交亲和与自交不亲和的性状分离,为了准确鉴定后代的自交亲和表型,对亲本材料RH89-039-16和PI 225689进行基因组重测序,获得两个材料的序列信息。
(2)开发亲本材料RH89-039-16和PI 225689中与StSCI基因共分离的分子标记:
比较亲本材料RH89-039-16和PI 225689中包含StSCI基因的染色体片段的序列信息,发现RH89-039-16中的StSCI基因的启动子区域插入了一段538bp(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列,基于这段插入序列,设计了一对InDel分子标记,引物序列如下:
F:5′-CGTCGGATTCAGCAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO.9);
R:5′-AAGCGAATTACAAGCCTGTTTAGATTGAC-3′(SEQ ID NO.10);
(3)利用InDel分子标记对杂交后代植株进行表型鉴定:
待杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组,以待测基因组DNA为模板,利用步骤(2)中的引物进行PCR扩增反应;
PCR反应使用的扩增体系以20μl计为:10-20ng/μl模板DNA 1μl,10pmol/μl引物F和R各1μl,10mmol/L dNTP mix 0.4μl,0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl,10×PCR反应缓冲液2μl,余量为水;
PCR反应条件为:94℃5分钟;94℃20秒,55℃20秒,72℃30秒,35个循环;72℃10分钟;
对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图1所示,如果能扩出来大小为428bp的片段,则说明该单株是自交亲和的;如果不能扩增出片段,则说明该单株是自交不亲和的。
(4)利用定量PCR鉴定后代单株中StSCI基因的表达情况
为了验证分子标记鉴定出的自交亲和单株中StSCI基因的表达情况,待杂交后代中经分子标记鉴定为自交亲和的单株A和自交不亲和的单株B生长至盛花期,用镊子拨出植株的花粉,用天根公司的总RNA小提试剂盒(货号:DP419),参照试剂盒使用说明书,提取花粉中以及叶片中的总RNA,经TaKaRa反转试剂盒(货号:RR047A)参照使用说明书反转录后获得cDNA,用TaKaRa定量试剂盒(货号:RR820A)参照使用说明书进行qRT-PCR的方法检测StSCI基因的表达情况,定量结果如图2所示。
定量引物序列如下:
F:5′-ATCAGCTAGAGAACTTGCTATTTCATGGG-3′(SEQ ID NO.11);
R:5′-CGTGCCTCGTATGTCTAGCCAACTTA-3′(SEQ ID NO.12);
反转录反应体系及条件:
去除基因组DNA反应:5×gDNA Eraser Buffer 2μl,gDNA Eraser 1μl,Total RNA(1μg/μl)1μl,RNase Free ddH2O 6μl,42℃2分钟;
反转录反应:去除基因组DNA反应产物10μl,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl,RT Primer Mix 1μl,5×PrimeScript Buffer2 4μl,RNase Free ddH2O4μl,37℃15分钟,85℃5秒。
定量反应体系及条件:
定量PCR反应使用20μl体系:TB Green Premix Ex Taq II 10μl,PCR ForwardPrimer 0.8μl,PCR Reverse Primer 0.8μl,ROX Reference Dye 0.4μl,DNA模板2μl,RNase Free ddH2O 6μl。
反应条件:95℃30秒;95℃5秒,60℃30秒,40个循环;95℃15秒,60℃1分钟,95℃15秒。
由图2的结果可见,在自交亲和单株A的花粉中,StSCI基因是能够表达的;而在自交不亲和的单株B中,StSCI基因没有表达。
(5)自交亲和表型的鉴定:
对自交亲和单株A和自交不亲和单株B进行常规自交授粉,观察授粉后坐果情况,结果如图3所示,自交亲和单株A经过自交授粉后,果实能够正常发育,而自交不亲和单株B经自交授粉后,花朵凋落,没有坐果。
实施例2
一种筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法,包括以下步骤:
(1)获得亲本材料的基因组序列信息:
采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交获得杂交后代,对RH89-039-16和PI225689进行基因组重测序,获得基因组序列信息;
(2)筛选亲本材料的单碱基差异位点:
通过分析StSCI基因核苷酸序列和StSCI基因连锁的核苷酸序列,筛选发现RH89-039-16上位于12号染色体上58030614bp处是一个T碱基,而PI 225689材料上对应位置上是一个C碱基;
StSCI基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;基因连锁的遗传距离小于20cM;
(3)设计KASP分子标记:
在差异的单碱基序列上下游各保留50bp的碱基序列,并包含中间存在差异的单碱基总共设计101bp的KASP引物序列;引物序列是TTATGATCTTGATAAACTATATATTATCAATATGAATGTTGTAATTGAT A[T:C]ATTATTTTGAACTTTGTCCAATCTATATTAGTTATTTAAGTCATC ATATT(SEQID NO.3)和(SEQ ID NO.4);[T:C]位置就是58030614位置上的SNP位点;
(4)鉴定筛选的分子标记是否可用:
鉴定筛选的KASP分子标记是否与RH89-039-16和PI 225689亲本材料的基因组测序的结果相同,测试结果显示相同,该KASP分子标记可以用于后续鉴定。
实施例3
一种筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法,包括以下步骤:
(1)获得亲本材料的基因组序列信息:
采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交获得杂交后代,对RH89-039-16和PI225689进行基因组重测序,获得基因组序列信息;
(2)筛选亲本材料的插入缺失标记:
通过分析StSCI基因核苷酸序列和StSCI基因连锁的核苷酸序列,筛选出在12号染色体58136285处,RH89-039-16相对于PI 225689缺失了11bp的碱基序列;
StSCI基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;基因连锁的遗传距离小于20cM;
(3)设计InDel分子标记:
在存在插入缺失的位点的上下游各设计合适的引物片段,设计了能够扩增包含这11bp缺失序列在内的共108bp的片段的引物;两端引物序列分别是:
F:5′-GGTGTATCGAGTCGGAATAA-3′(SEQ ID NO.5);
R:5′-GATTCGGGAAATTGTACTCA-3′(SEQ ID NO.6);
(4)鉴定筛选的分子标记是否可用:
鉴定筛选的InDel分子标记是否与所述RH89-039-16和PI 225689亲本材料的基因组测序的结果相同,测试结果显示相同,该InDel分子标记可以用于后续鉴定。
实施例4
一种筛选用于鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的分子标记的方法,包括以下步骤:
(1)亲本材料RH89-039-16和C的基因组测序:
采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交获得杂交后代,对RH89-039-16和PI225689进行基因组重测序,获得基因组序列信息;
(2)筛选亲本材料的插入缺失标记:
通过分析StSCI基因核苷酸序列和StSCI基因连锁的核苷酸序列,筛选出在StSCI基因的启动子区域插入了一段538bp的核苷酸序列;
所述的插入核苷酸序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;基因连锁的遗传距离小于10cM;
(3)设计InDel分子标记:
在存在插入序列的上下游设计设计合适的第一引物对,以及在插入序列的上游和序列中设计合适的第二引物对,设计了能够扩增包含该启动子区域插入序列在内的第一引物对和扩增部分该启动子区域插入序列的第二引物对;两对引物序列分别是:
第一上游引物1F:5′-CGTCGGATTCAGCAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO.7);
第一下游引物1R:5′-TCCACATGAGTTGTTTGTTTGGTGTAT-3′(SEQ ID NO.8)
第二上游引物2F:5′-CGTCGGATTCAGCAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO.9);
第二下游引物2R:5′-AAGCGAATTACAAGCCTGTTTAGATTGAC-3′(SEQ ID NO.10);
(4)鉴定筛选的分子标记是否可用:
鉴定筛选的两对InDel分子标记是否与所述RH89-039-16和PI 225689亲本材料的基因组测序的结果相同,测试结果显示相同,该InDel分子标记可以用于后续鉴定。
实施例5
一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,包括以下步骤:
(1)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交,得到杂交后代;
(2)待杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组;
(3)采用实施例2的方法获得的KASP分子标记对叶片的基因组进行鉴定,若杂交后代在在12号染色体58030614bp处是[T:T]或者[T:C]则为自交亲和的,如果是[C:C]则是自交不亲和的。因为与RH89-039-16中的染色体上同位置的碱基相同,说明后代获得了含有StSCI基因的那条染色体。
实施例6
一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,包括以下步骤:
(1)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交,得到杂交后代;
(2)待杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组;
(3)采用实施例3的方法获得的InDel分子标记对叶片的基因组进行鉴定;由于RH89-039-16中含有StSCI基因且是杂合的,且12号染色体缺失了11bp,因此InDel分子标记引物在RH89-039-16中扩增的片段长度是97bp和108bp两条带,而在PI 225689中只有108bp这一条带。
因此,采用InDel分子标记引物在二倍体马铃薯杂交后代中扩增的PCR产物在进行PAGE电泳时,若出现与RH89-039-16带型一致则为自交亲和的;若是与PI 225689带型一致则为自交不亲和的。
实施例7
一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲的方法,包括以下步骤:
(1)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯PI225689为亲本材料进行杂交,得到杂交后代;
(2)待杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组;
(3)采用实施例4的方法获得的两对InDel分子标记对叶片的基因组进行鉴定;以待测基因组DNA为模板,利用实施例4中的第一引物对1F和1R为一组,第二引物对2F和2R为一组,分别进行PCR扩增反应;
PCR反应使用的扩增体系以20μl计为:10-20ng/μl模板DNA 1μl,10pmol/μl引物F和R各1μl,10mmol/L dNTP mix 0.4μl,0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl,10×PCR反应缓冲液2μl,余量为水;
PCR反应条件为:94℃5分钟;94℃20秒,55℃20秒,72℃30秒,35个循环;72℃10分钟;
(4)检测PCR扩增产物,对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如果第一引物扩出来的片段大小是500bp,且第二引物不能扩出任何条带,说明该杂交后代材料是自交不亲和的;如果第一引物对扩出来的片段大小是500bp,第二引物扩出来的条带是400bp的片段,说明该杂交后代材料是杂合自交亲和的,该植株可自交亲和,自交后后代会出现自交亲和表型的分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4289
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
atctcgagtt aatttcacat ttgatcactg aacttttccc actataagtg actacatgtt 60
atccactctt aacactacgt gcctcgacaa ttttaggtga aaagtctaaa ttacttaact 120
ttttctatct tgcagatttc cattgaaatc ccatatgtct ttatgcaatc tgttttctgt 180
ggtgcaatta tgtatgctat gatcggattt gaatggacgg tagcaaagtt cttttggtac 240
ttgttcttcc tgtttttcac cctcttgtac ttcactttct acggtatgat gaccgttgct 300
gttaccccaa atgtaagtgt tgctcaaatt gtcggctcct tcttctacgg agtatggaat 360
cttttctcag gattcatcat tccacgaact gtaagttctt gaaacacttc cattttattg 420
ttacatcaaa actgacttag agctcggaaa tgacatgttc tctgtatttt tttccatttt 480
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tgcctggacc ttgtatggtt tggttgcatc acaatttgga gatcttcaga acaaacttac 600
tgatgaggaa acagtggaac aatttttgag acgttacttc ggcttcaagc atgattttct 660
tccaatagtt gcagtcgcga ttgttgggta cactgttctt tttggcttca catttgcttt 720
cgctattaag gcattcaact tccaaacgag ataaaaagac attacctgct gaagatgtag 780
taaagacaac gtgtgaaacg ttctctccac tgctcgtgaa atggggaaga cgcggttagt 840
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tacccctttt atactctatg taagttagag ctctatcaaa aatatgaatc aatagtaaaa 2160
ctaatgtgtt ggataaagcg aattacaagc ctgtttagat tgacttatgt tatgtgcttt 2220
taaataaaaa aagaagttta taagcagttt tgtcaactta ttacttatag aataatgtta 2280
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ttaggcctcc aaatacgttg agccgcccct gcttaaccgt cgagacatat gaagtgtaac 2400
aacttttcaa caaacttttc tcagtttgct ttatataaag aaaaaaaatt cacaaaactt 2460
caaattcaat tttccaataa tggactattt cctattgcta ccagaagatt gtgtttgtga 2520
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caactctgct gctgaatccg acgttatttg ggtaaagttt ttaccagatg attatgaaga 2640
tatcaactcg agatatgtct ccccgcggat ttatccgtct aaaaaggagc tttactttag 2700
tctatgtgac ttccctgttc taatggatgg aggcaaattg gtaagtagct ctaaattggg 2760
aagtagcaag cttttctttt ggctcattag ttgaatatat gtataattgt tttgaagctt 2820
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acaaattaga ggagttttct ttttaaagat aaaatacaga gtttgaacta aaactattgg 2940
gttcctagaa tttatagggg tgttctagct ttgcctctaa ctgttggtgt tgtataacgg 3000
taaaggtcat gaacctttga cctgaggtct agagtttgag ttttaatcag agttgaaatc 3060
ttaggaattg agtcgtgttt aataggaagc actaaaatct actagtgtgc ttacggctgc 3120
gcaaatctta attaatcagc caatgaattt ttcttatttt attttgtttt tgttacaaac 3180
tgggaatcca actctctata gtaaaacgga agttcagata gtcaactaaa tgaacttcta 3240
agattttctg gccaatgggt tacaaacacc attaaaaatg caaaattaaa tagattataa 3300
taataattgt gtgaatttta ttttattttt gaatggacta tatataagct agtagtgtga 3360
atctaagatt ttattttatt tttgaaaaca gagtttttca cttgataaga aaacaggcaa 3420
gaaatgtttt atgatatcag ctagagaact tgctattaca tggggagttg atacaccatg 3480
gtattgggaa tggatttctc atcctgactc caggttcgtc gaaaaattat actacatata 3540
aaaagttatt cttttttttt atgtatgtac tacgtataaa aaattatact tcattgcctt 3600
ttaacgaatt tctacatatg ttattttttg aatcccttgg ttgaaattct acctctgcca 3660
ctattggtga gaattttttt tttacacaat caagccacct aaaagatata tatagatgag 3720
cctcactaaa atgtgtaatg aaatatgtta cctattacaa taggtaaaga tgatttgatg 3780
gtgcaaaaat tacttatatt ggcgatgtta tatataactt aaactcacta aatacgtgta 3840
tctaagacaa tatagacatt ttattttgca gattttcgga agtggctcat ctcaagggtg 3900
taagttggct agacatacga ggcacgattg gaacacaaat attgtcgaaa agaaccaaat 3960
atgttgttta tttggtgttc aaattgtcaa agaatcatga tggactagaa attgctaatg 4020
catttgttag gtttgtgaat cgtgtgagcg acaaagaggc cgaggaacga gctagtgtcg 4080
tgagtctagt cggaaaaagg gttaggagac gcaaacgtaa tgtgaaatgt ccacgaaaaa 4140
gagtcgatgg atggatggaa atagaattgg gaaattttat caatgataca ggagatgatg 4200
gagatgttga agcgcgattg atggagatta cgcagcttca tggaaaaggt ggccttattg 4260
ttcaaggaat tgaatttaga ccagaataa 4289
<210> 2
<211> 538
<212> DNA
<213> 未知
<400> 2
caggggcggc tcaacgtatt tggaggccta aaacaaaatt taaattaaag gcctaaaatc 60
ttttagctga ggcaattatt aaataaattg ttaacattat tctataagta ataagttgac 120
aaaactgctt ataaacttct ttttttattt aaaagcacat aacataagtc aatctaaaca 180
ggcttgtaat tcgctttatc caacacatta gttttactat tgattcatat ttttgataga 240
gctctaactt acatagagta taaaaggggt atagaaaatt acaacgcgag agtaagtgaa 300
gagagtgtaa gaagacaaaa caacgttttt cttgatttct tctatttgat tgaggttaag 360
gagaataaaa taatatatat atgaaaagta catttatctt aaataattaa ttttttctat 420
aaaaaaaatt aacacataat ttattgttgg taaaaatttg aggcccccct aaaattgggg 480
gcctaaggca tatgcctaat ttttataagc attgagccgg cactgcggtt aaatattg 538
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttatgatctt gataaactat atattatcaa tatgaatgtt gtaattgata tattattttg 60
aactttgtcc aatctatatt agttatttaa gtcatcatat t 101
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttatgatctt gataaactat atattatcaa tatgaatgtt gtaattgata cattattttg 60
aactttgtcc aatctatatt agttatttaa gtcatcatat t 101
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtgtatcga gtcggaataa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gattcgggaa attgtactca 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtcggattc agcagcagag tt 22
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tccacatgag ttgtttgttt ggtgtat 27
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgtcggattc agcagcagag tt 22
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aagcgaatta caagcctgtt tagattgac 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atcagctagagaacttgctatttcatggg 29
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgtgcctcgtatgtctagccaactta 26

Claims (14)

1.一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法,其特征在于,鉴定二倍体马铃薯中的StSCI基因是否转录和表达;
所述StSCI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用鉴定分子标记是否存在来预测StSCI基因是否表达,所述分子标记包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的插入缺失片段。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述分子标记的引物包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所述序列的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述分子标记的引物还包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所述序列的核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用鉴定分子标记是否存在来预测特定亲本材料及其杂交后代StSCI基因是否表达;
所述特定亲本材料为用于筛选所述分子标记的亲本材料;
筛选所述分子标记的方法,包括以下步骤:
(a)获得亲本材料的基因组序列信息:
采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯为亲本材料时,对RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯进行基因组重测序,获得基因组序列信息;或
根据参考基因组的序列信息,开发对应的引物,对亲本材料的目标基因片段进行PCR扩增,对扩增产物进行序列测定,获得亲本材料特定片段的序列信息;
(b)筛选亲本材料的差异位点:
对两种亲本材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的序列信息进行比较,筛选出StSCI基因核苷酸序列和/或StSCI基因连锁的差异核苷酸序列位点;
核苷酸序列的差异位点包括:单碱基差异位点和/或插入缺失标记;
(c)筛选分子标记:
针对步骤(b)中筛选出的单碱基差异位点,设计KASP标记引物序列;和/或,
针对步骤(b)中筛选出的插入缺失标记,设计InDel标记的引物序列;
(d)鉴定筛选的分子标记是否可用:
鉴定步骤(c)中筛选的分子标记是否与所述RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯亲本材料,以及RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯的杂交后代的基因组测序的结果相同。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)中,基因连锁的遗传距离小于20cM。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)中基因连锁的遗传距离小于10cM。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述分子标记为KASP分子标记,其引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述分子标记为InDel分子标记,其引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
10.检测权利要求2-4任一项所述分子标记的特异性试剂和/或试剂盒。
11.权利要求10所述的特异性试剂和/或试剂盒在鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和中的应用。
12.一种鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法,其特征性在于,采用权利要求10所述的试剂和/或试剂盒鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征性在于,包括以下步骤:
(i)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯为亲本材料进行杂交,得到二倍体马铃薯杂交后代;
(ii)待二倍体马铃薯杂交后代植株生长至苗期时,提取其叶片基因组;
(iii)采用检测分子标记的试剂和/或试剂盒对叶片的基因组进行鉴定,根据是否存在分子标记,判断二倍体马铃薯杂交后代是否自交亲和。
14.根据权利要求12所述的方法,其特征性在于,包括以下步骤:
(i)采用自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16与自交不亲和的二倍体马铃薯为亲本材料进行杂交,得到二倍体马铃薯杂交后代;
(ii)提取二倍体马铃薯杂交后代植物细胞的RNA,采用PCR方法检测二倍体马铃薯杂交后代植物细胞中是否存在StSCI基因mRNA本身。
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