CN108866235B - 一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及其应用。利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对对大白菜品系间杂交亲和性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果一致率达到85.7％。因此，可利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对大白菜品系间是否杂交亲和进行鉴定，也可用于苗期预测大白菜品系间的杂交亲和性，避免盲目配制组合而造成新品种杂交种产量低而无法推广。本发明的优点是分子标记为共显性，鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将为加快选育具有杂交亲和的大白菜品种提供高效的辅助育种方法和技术。

Description

一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及 其应用
技术领域
本发明涉及植物分子育种技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及其应用。
背景技术
大白菜作为异花授粉作物，具有明显的杂种优势。大白菜杂种优势的利用主要通过自交不亲和系或雄性不育系配制杂交种来实现。但在实际育种过程中，两个优良自交系在配制杂交种过程中常会出现杂交不亲和的现象，其主要原因是育种材料同质化愈加严重、血缘基础狭窄等问题往往造成两个大白菜自交系带有相同的S基因，导致不亲和反应的发生。因此，双亲因具有相同的S基因而导致大白菜杂交不亲和已严重阻碍了大白菜品种种子的生产，快速准确鉴定大白菜亲本间是否具有相同的S基因对于提高大白菜杂交种种子的产量具有重要意义。
自交不亲和性广泛存在于高等植物中，包括70多个科的250多个属。芸薹属植物属于典型的孢子体自交不亲和，该类不亲和在遗传上由一个具有复等位基因的高度多态性的S位点控制，在一个S位点上包含多个S等位基因。到目前为止，芸薹属中约有100多个S单元型已经被鉴定，这些S单元型包含与花粉、柱头识别反应相关的3类基因：S位点糖蛋白基因(SLG)、S位点受体激酶基因(SRK)和S位点蛋白11基因(SP11)。随着分了生物学、生物信息学的发展，十字花科作物S基因研究工作逐渐深入，主要集中在S单元型中SLG、SRK、SP11基因序列的多样性分析，同时陆续公布了S单元型的序列信息，利用上述序列的多态性开发用于检测大白菜杂交亲和性的分子标记已成为可能。但是关于通过分子标记辅助选择杂交亲和的大白菜品系的相关研究还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定大白菜品系间的杂交亲和性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜杂交亲和性的引物对。
本发明提供的引物对由引物甲和引物乙组成；
所述引物甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物乙为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
上述引物对中，所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1:1。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述引物对的新用途。
本发明提供了上述引物对在如下A1-A8中任一中的应用：
A1、鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性；
A2、制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的产品；
A3、选育杂交亲和的大白菜品种；
A4、制备选育杂交亲和的大白菜品种的产品；
A5、大白菜育种；
A6、制备大白菜育种的产品；
A7、预测大白菜品系间的杂交亲和性；
A8、制备预测大白菜品系间的杂交亲和性的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的方法包括如下步骤：以待测大白菜甲为母本，待测大白菜乙为父本进行杂交，分别检测所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙是否含有大小为194bp的片段和大小为155bp的片段；
若所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙均仅含有大小为194bp的片段(均不含有大小为155bp的片段)，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交不亲和或候选杂交不亲和；
若所述待测大白菜甲含有大小为155bp和194bp的片段或仅含有大小为155bp的片段且所述待测大白菜乙仅含有大小为194bp的片段，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交亲和或候选杂交亲和；
所述大小为194bp的片段如序列表中序列3所示；
所述大小为155bp的片段如序列表中序列4所示。
上述方法中，所述检测所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙是否含有大小为194bp的片段和大小为155bp的片段的方法如下：分别以所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙的杂交亲和性：
若所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙的扩增产物均仅含有大小为194bp的条带(均不含有大小为155bp的条带)，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交不亲和或候选杂交不亲和；
若所述待测大白菜甲的扩增产物含有大小为155bp和194bp的条带或仅含有大小为155bp的条带且所述待测大白菜乙的扩增产物仅含有大小为194bp的条带，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交亲和或候选杂交亲和。
上述方法中，确定扩增产物的大小是通过凝胶电泳实现的。所述凝胶电泳为2-3％的琼脂糖凝胶电泳，具体为2％、2.5％或3％的琼脂糖凝胶电泳。
所述PCR扩增采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
上述方法中，所述待测大白菜甲(母本)为大白菜BC1F1群体的各单株或F1杂交种群体的各单株。所述待测大白菜乙(父本)为04GX-3或XIN3-AC。
所述大白菜BC1F1群体为由CMS 04GX-3(母本)与04GX-3(父本)杂交后代的各单株组成的群体。所述F1杂交种群体为由CMS 04GX-3(母本)与XIN3-AC(父本)杂交后代的各单株组成的群体。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了大白菜育种的方法。
所述大白菜育种的方法为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：选择含有大小为155bp和194bp的片段或仅含有大小为155bp的片段的大白菜作为母本，选择仅含有大小为194bp的片段的大白菜作为父本进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：采用上述方法筛选出杂交亲和的大白菜作为亲本进行育种；
所述大小为194bp的片段如序列表中序列3所示；
所述大小为155bp的片段如序列表中序列4所示。
含有上述引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。
上述大小为194bp的片段和大小为155bp的片段也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了上述试剂盒或上述大小为194bp的片段或上述大小为155bp的片段的新用途。
本发明提供了上述试剂盒或上述大小为194bp的片段或上述大小为155bp的片段在如下A1-A8中任一中的应用：
A1、鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性；
A2、制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的产品；
A3、选育杂交亲和的大白菜品种；
A4、制备选育杂交亲和的大白菜品种的产品；
A5、大白菜育种；
A6、制备大白菜育种的产品；
A7、预测大白菜品系间的杂交亲和性；
A8、制备预测大白菜品系间的杂交亲和性的产品。
上述应用或方法中，杂交不亲和是指单株种子量小于10克；杂交亲和是指单株种子量大于等于10克。杂交不亲和的大白菜品种是指单株种子量小于10克的大白菜品种；杂交亲和的大白菜品种是指单株种子量大于等于10克的大白菜品种。
实验证明，利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对对大白菜品系间杂交亲和性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果一致率达到85.7％。因此，可利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对大白菜品系间是否杂交亲和进行鉴定，也可用于苗期预测大白菜品系间的杂交亲和性，避免盲目配制组合而造成新品种杂交种产量低而无法推广。本发明的优点是分子标记为共显性，鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将为加快选育具有杂交亲和的大白菜品种提供高效的辅助育种方法和技术。
附图说明
图1为大白菜BC1F1群体的琼脂糖凝胶检测结果。
图2为大白菜F1杂交种群体的琼脂糖凝胶检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大白菜“04GX-3”：参考文献：Tongbing Su,Shuancang Yu,Zhenping Gong,Fenglan Zhang,Yangjun Yu,Deshuang Zhang,Xiuyun Zhao,Weihong Wang.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage.Journal of Plant Pathology:1-9，在文献中的名称为0XINH。公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“XIN3-AC”：参考文献：Tongbing Su,Shuancang Yu,Zhenping Gong,Fenglan Zhang,Yangjun Yu,Deshuang Zhang,Xiuyun Zhao,Weihong Wang.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage.Journal of Plant Pathology:1-9，在文献中的名称为XINCAC。公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“CMS 04GX-3”是由大白菜“CMS96”(张德双,张凤兰,徐家炳,等.大白菜CMS96不育系和保持系电镜观察[J].华北农学报,2012,27(2):133-139.)与大白菜“04GX-3”经过连续7代回交而获得，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、大白菜BC1F1群体杂交亲和性表型鉴定以及分子标记验证
一、大白菜BC1F1群体的获得
2017年以大白菜细胞质雄性不育系CMS 04GX-3为母本，以保持系04GX-3为父本，按父母本比例1:2的比例定植于小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得F1群体。如果单株种子量小于10克，定义为杂交不亲和；如果单株种子量大于等于10克，定义为杂交亲和。最终在40株F1中获得1株种子量为19.54的单株，其余单株种子量均小于5克。
以2017年获得的杂交亲和的大白菜细胞质雄性不育系F1(种子量为19.54克的F1单株)为母本，以保持系04GX-3为父本，2017年12月播种于日光温室，温度控制在15℃以下，2018年3月春化完成后定植于小棚中，按父母本比例1:2的比例定植，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得BC1F1群体。
二、大白菜BC1F1群体杂交亲和性表型鉴定
调查步骤一获得的BC1F1群体中每个单株的种子产量，按0、1、2、3、4分级，0级为单株种子量小于5克；1级为单株种子量大于等于5克小于10克；2级为单株种子量大于等于10克小于15克；3级为单株种子量大于等于15克小于20克；4级为单株种子量大于等于20克，其中0级和1级定义为杂交不亲和，2级、3级和4级定义为杂交亲和。
结果表明：8株保持系(父本)全部表现为自交不亲和，在77株BC1F1群体中，42株表现为杂交亲和，35株表现为杂交不亲和。
三、大白菜BC1F1群体的分子标记验证
采用CTAB法分别提取保持系04GX-3和大白菜BC1F1群体的各单株的基因组DNA。
以上述DNA为模板，利用特异引物对InDel BVRC_BrS1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。特异引物对InDel BVRC_BrS1由F和R这两条单链DNA组成，其序列如下：
上游引物InDel BVRC_BrS1-F：5'-ACCAGGTGAACCCTGAAAAC-3'(序列1)；
下由引物InDel BVRC_BrS1-R：5'-CCAATGAGTCCATGCCTGTT-3'(序列2)。
其中，20μL的PCR体系包括：2.0μL 10×PCR Buffer(购自TaKaRa公司，产品目录号为9151A)、0.8μL dNTPs(每种2.5mM)(购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A)、浓度均为10μmol/L的上述的两条引物各1.0μL、0.2μL Taq DNA polymerase(浓度为5U/μL)(购自TaKaRa公司，产品目录号为R001)、1.0μL模板DNA(200ng/μL)和14μL ddH2O。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电泳30min，EB染色后用凝胶成像系统观察结果。将仅扩增出一条大小为194bp的条带的基因型记为A型；将同时扩增出双亲条带(一条大小为155bp的条带和一条大小为194bp的条带)的基因型记为H型。
结果如表1所示，8株保持系(父本)全部仅扩增出一条大小为194bp的条带，基因型均为A型。在42株表型为杂交亲和的BC1F1材料中，32株大白菜同时扩增出双亲条带(一条大小为155bp的条带和一条大小为194bp的条带)，基因型为H型，鉴定准确率为76.2％(32/42)。在35株表型为杂交不亲和的BC1F1材料中，34株大白菜仅扩增出一条大小为194bp的条带，基因型为A型，鉴定准确率为97.1％(34/35)。本发明方法的平均鉴定准确度为85.7％。
表1为InDel BVRC_BrS1对BC1F1群体杂交亲和性的验证结果
Figure BDA0001781619650000061
Figure BDA0001781619650000071
注：A为仅扩增出大小为194bp的单一条带，H为同时扩增出大小为194bp和155bp的杂合条带。
实施例2、大白菜F1杂交种群体杂交亲和性表型鉴定以及分子标记验证
一、大白菜F1杂交种群体的获得
2017年以大白菜细胞质雄性不育系CMS 04GX-3为母本，以保持系04GX-3为父本，按父母本比例1:2的比例定植于小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得F1群体。如果单株种子量小于10克，定义为杂交不亲和；如果单株种子量大于等于10克，定义为杂交亲和。最终在40株F1中获得1株种子量为19.54的单株，其余单株种子量均小于5克。
2018年以2017年获得的后代作为母本，以XIN3-AC为父本，按父母本比例1:2的比例定植于同一小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，种子成熟后分别按单株收种子获得F1杂交种群体。
二、大白菜F1杂交种群体杂交亲和性表型鉴定
调查步骤一获得的大白菜F1杂交种群体中每个单株的种子产量，按0、1、2、3、4分级，0级为单株种子量小于5克；1级为单株种子量大于等于5克小于10克；2级为单株种子量大于等于10克小于15克；3级为单株种子量大于等于15克小于20克；4级为单株种子量大于等于20克，其中0级和1级定义为杂交不亲和，2级、3级和4级定义为杂交亲和。
结果表明：4株父本全部表现为自交不亲和，在35株F1群体中，13株表现为杂交亲和，22株表现为杂交不亲和。
三、大白菜杂交种F1群体的分子标记验证
采用CTAB法分别提取父本XIN3-AC和F1群体单株大白菜的基因组DNA。
以上述DNA为模板，利用特异引物对InDel BVRC_BrS1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。特异引物对InDel BVRC_BrS1由F和R这两条单链DNA组成，其序列如下：
上游引物InDel BVRC_BrS1-F：5'-ACCAGGTGAACCCTGAAAAC-3'；
下由引物InDel BVRC_BrS1-R：5'-CCAATGAGTCCATGCCTGTT-3'。
其中，20μL的PCR体系包括：2.0μL 10×PCR Buffer(购自TaKaRa公司，产品目录号为9151A)、0.8μL dNTPs(每种2.5mM)(购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A)、浓度均为10μmol/L的上述的两条引物各1.0μL、0.2μL Taq DNA polymerase(浓度为5U/μL)(购自TaKaRa公司，产品目录号为R001)、1.0μL模板DNA(200ng/μL)和14μL ddH2O。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电泳30min，EB染色后用凝胶成像系统观察结果。将仅扩增出一条大小为194bp(序列3)的条带的基因型记为A型；将同时扩增出双亲条带(一条大小为155bp(序列4)的条带和一条大小为194bp(序列3)的条带)的基因型记为H型。
结果如表2所示，4株父本全部仅扩增出一条大小为194bp的条带，基因型均为A型，13株表型为杂交亲和的F1杂交种全部同时扩增出双亲条带(一条大小为155bp的条带和一条大小为194bp的条带)，基因型均为H型，22株表型为杂交不亲和的F1杂交种全部仅扩增出一条大小为194bp的条带，基因型均为A型。本发明方法的鉴定准确度为100％。
表2为InDel BVRC_BrS1对F1杂交种杂交亲和性的验证结果
Figure BDA0001781619650000081
Figure BDA0001781619650000091
注：A为仅扩增出大小为194bp的单一条带，H为同时扩增出大小为194bp和155bp的杂合条带。
上述结果表明，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测大白菜杂交亲和性。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的InDel分子标记及其应用
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
accaggtgaa ccctgaaaac 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
ccaatgagtc catgcctgtt 20
<210>3
<211>194
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
accaggtgaa ccctgaaaac aatcttccaa gctatgtaag tttaagataa gaaccaataa 60
tattctatct actctcgaga ttgcttcttt tttttttgaa tggcactctc gagattgcta 120
aaacacttat attttgaaca acgctaaaac aatttaaatg cttttatttt tataaacagg 180
catggactca ttgg 194
<210>4
<211>155
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
accaggtgaa ccctgaaaac aatcttccaa gctatgtaag tttaagaacc aataatattc 60
tatctactct cgagattgct gaaacactta tattttgaac aacgctaaaa caatttaaat 120
gcttttattt ttataaacag gcatggactc attgg 155

Claims (8)

1.鉴定或辅助鉴定待测大白菜杂交亲和性的引物对，其由引物甲和引物乙组成；
所述引物甲为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物乙为序列2所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1:1。
3.权利要求1或2所述的引物对在如下A1-A6中任一中的应用：
A1、鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性；
A2、制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的产品；
A3、选育杂交亲和的大白菜品种；
A4、制备选育杂交亲和的大白菜品种的产品；
A5、预测大白菜品系间的杂交亲和性；
A6、制备预测大白菜品系间的杂交亲和性的产品。
4.一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的方法，包括如下步骤：以待测大白菜甲为母本，待测大白菜乙为父本进行杂交，分别检测所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙是否含有大小为194bp的片段和大小为155bp的片段；
若所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙均仅含有大小为194bp的片段，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交不亲和或候选杂交不亲和；
若所述待测大白菜甲含有大小为155bp和194bp的片段且所述待测大白菜乙仅含有大小为194bp的片段，则所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙杂交亲和或候选杂交亲和；
所述大小为194bp的片段如序列表中序列3所示；
所述大小为155bp的片段如序列表中序列4所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙是否含有大小为194bp的片段和大小为155bp的片段的方法如下：分别以所述待测大白菜甲和所述待测大白菜乙的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行扩增，分别检测扩增产物的大小。
6.大白菜育种的方法，为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：选择含有大小为155bp和194bp的片段的大白菜作为母本，选择仅含有大小为194bp的片段的大白菜作为父本进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：采用权利要求4或5所述的方法筛选出杂交亲和的大白菜作为亲本进行育种；
所述大小为194bp的片段如序列表中序列3所示；
所述大小为155bp的片段如序列表中序列4所示。
7.含有权利要求1或2所述的引物对的试剂盒。
8.权利要求7所述的试剂盒在如下A1-A6中任一中的应用：
A1、鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性；
A2、制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交亲和性的产品；
A3、选育杂交亲和的大白菜品种；
A4、制备选育杂交亲和的大白菜品种的产品；
A5、预测大白菜品系间的杂交亲和性；
A6、制备预测大白菜品系间的杂交亲和性的产品。
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