CN111676229B - 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米雄性核不育基因ms40，该基因由Seq ID No：1所示的核苷酸序列组成；该基因编码的蛋白质由Seq ID No：2所示的氨基酸序列组成。本发明还公开了用于筛选鉴定该基因的分子标记和引物。本发明提供了一种新的玉米核不育基因ms40，其突出特点是败育时期较早，且败育彻底；其次，本发明核不育基因为SNP突变，该突变体只影响育性，对其他基因功能没有影响，其在不同的遗传背景下不育性很稳定，利用价值较大；此外，本发明核不育基因可通过SPT技术用于玉米制种，具有广阔应用前景。

Description

一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玉米雄性核不育基因；还涉及用于鉴定该核不育基因的分子标记及其引物；此外，还涉及它们的用途。

背景技术

玉米是最早利用杂种优势的植物之一，杂种优势的利用极大地提高了玉米的产量、抗性和适应性等。玉米是典型的异花授粉作物，因此，在制种时需要进行严格的人工去雄，如果去雄不及时不彻底，极易造成混杂，进而会影响到玉米商品杂交种子的纯度；其次，人工去雄还耗费大量的劳力，大大增加种子的生产成本。而利用雄性不育制种，不仅可以大大提高种子纯度，保证制种质量，而且可以节约劳力、增加制种产量和降低种子生产成本，因而是解决玉米人工去雄制种问题的有效途径。

植物雄性不育(Male Sterility)分为细胞质雄性不育(Cytoplasmic MaleSterility，CMS)和细胞核雄性不育(Genic Male Sterility，GMS)。细胞质雄性不育是核质互作的产物，其不育细胞质类型主要有T、S、C三种，通过细胞质雄性不育系、保持系和恢复系三系配套进行种子生产。美国曾大面积推广应用T型不育细胞质配制的玉米杂交种，但是由于上世纪七十年代针对T型不育胞质的玉米小斑病T小种的大爆发，给美国的玉米生产造成严重损失，只能放弃应用T型雄性不育细胞质。同时，S型胞质不育存在不育性不稳定，C型胞质不育很难找到恢复系、且面临玉米小斑病C小种的威胁等问题。所有这些因素都限制了细胞质雄性不育在玉米制种上的应用。

细胞核雄性不育一般由核基因突变产生，目前在玉米中已经发现200多个核不育突变体，其中已经克隆报道了17个雄性不育基因，除MS44由单显性基因控制外，其他核不育基因均为隐性不育基因。核不育一般为显性或隐性单基因遗传，其存在一个明显的缺点，即后代群体常表现为1：1的育性分离，很难找到一个保持系，因而难以在玉米制种中直接应用。

美国先锋国际良种有限公司发明了一种新型不育系制种技术-SPT种子生产技术，该技术将育性恢复基因、花粉致死基因和籽粒荧光基因连锁构建SPT保持系表达盒，然后将其导入到隐性核不育系纯合子基因组中，构建SPT系；用SPT系给相应不育系授粉，即可得到不育系的后代，解决了核不育系繁种的问题。通过SPT技术实现了不育系和保持系的一系两用；同时SPT盒只通过雌配子传代，有效杜绝了转基因花粉的扩散，不存在转基因污染的问题。SPT种子生产技术成功解决了细胞核雄性不育系和保持系分离的难题，在杂交种制种上已经得到广泛的应用。但是SPT技术要求利用的核不育基因具有稳定的彻底败育的表型，而现有的很多核不育的花粉败育性不彻底、不育性不稳定，影响制种质量，亟待寻找花粉败育彻底的核不育基因的材料。

发明内容

本发明人利用甲基磺酸乙酯(EMS)对玉米自交系RP125花粉进行处理，在其诱变后代中意外发现一个不育突变体，该突变体表现为雄花干瘪，花粉粒不可染，为完全败育的雄性不育突变体。经进一步研究发现，该雄性不育受单隐性基因控制，将该核不育基因命名为ms40。本发明是在此意外发现的基础上实现的。

现本发明的技术方案如下：

本发明提供一种玉米核不育基因ms40，所述的玉米核不育基因ms40由Seq ID No：1所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了上述玉米核不育基因ms40在玉米制种上的应用。

本发明提供了上述玉米核不育基因ms40在培育隐性雄性不育的转基因玉米中的应用。

本发明还提供了上述核不育基因编码的蛋白质，所述的蛋白质由Seq ID No：2所示的氨基酸序列组成。

本发明还提供了上述核不育基因ms40的分子标记，所述分子标记的PCR扩增引物由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列组成；所述引物序列为：

正向引物ms40-indel-F:5′-CCTCATTGTCCCGCCTCTG-3′(SEQ ID No：3)，

反向引物ms40-indel-R:5′-CCGCCGTACGTACAATGACA-3′(SEQ ID No：4)。

本发明还提供了上述分子标记在鉴定玉米核不育基因ms40上的应用。

本发明还提供了用于扩增上述分子标记的引物，所述的引物由SEQ ID No：3和SEQID No：4所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了利用上述分子标记鉴定筛选玉米核不育材料的方法，包括以待测玉米样品基因组DNA为模板，以SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，得扩增产物；

如果扩增产物仅为一条65bp的带，则该植株为不育株；如果扩增产物仅为一条72bp的带，则该植株为纯合可育株；如果扩增产物为一条72bp的带和一条65bp的带，则该植株为杂合可育株。

本发明还提供了上述核不育基因ms40的SNP标记，所述的SNP标记的扩增引物由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的核苷酸序列组成。所述引物为：

正向引物SNP-F:5′-TGTCATTGTACGTACGGCGG-3′(SEQ ID No：5)，

反向引物SNP-R:5′-CGTGGGATGTACGGCGATG-3′(SEQ ID No：6)。

本发明还提供了利用上述SNP标记鉴定筛选核不育基因ms40材料的方法，包括以待测玉米材料基因组DNA为模板，以SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，得片段大小为957bp的扩增产物，然后对所得扩增产物进行测序；通过一代测序，检测其438位碱基；若该位置碱基为C，则该待测玉米材料的基因型为可育野生型植株；若该位置碱基为T，则该待测玉米材料的基因型为ms40突变体；若该位置碱基为C/T，则该待测玉米材料的基因型为野生型和突变体的杂合基因型。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明提供了一种新的玉米核不育基因ms40，其突出特点是败育时期较早，且败育彻底，在玉米制种中具有巨大利用价值；(2)本发明核不育基因为SNP突变，该突变体只影响育性，对其他基因的基因功能没有影响，因而对其他农艺性状等都没有影响，其在不同的遗传背景下不育性很稳定，利用价值较大；(3)该核不育基因可通过SPT技术用于玉米制种，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为野生型RP125和不育突变体ms40的花药对比照片；其中1为野生型RP125；2为不育突变体ms40。

图2为野生型RP125和不育突变体ms40的雄穗对比照片；其中1为野生型RP125；2为不育突变体ms40。

图3为野生型RP125和不育突变体ms40的花药显微照片；其中1为野生型RP125；2为不育突变体ms40。

图4为本发明玉米雄性核不育基因ms40与其分子标记在染色体上的相对位置及候选基因示意图。

图5为利用本发明分子标记鉴定不育材料和可育材料的电泳图谱；其中1为不育株；2、4、5、7、8和9为纯合可育株；3、6、11和12为带型杂合的可育株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1本发明玉米核不育突变体的发现过程

(1)2015年春，用EMS(甲基磺酸乙酯)对玉米自交系RP125的花粉进行处理，再用处理后的花粉为玉米自交系RP125授粉，获得M₁代种子。

(2)种植M₁代，对每一株M₁植株进行自交，收获得M₂代；

(3)按照不同果穗分小区种植M₂代，在开花期对每一个M₂代植株的花药形态进行田间观察，并对所有实验材料进行单株挂牌，从植株雄穗有少量花药外露时开始，逐株进行育性调查，重复调查3次，每两天调查一次，调查时同时收集调查数据，最后进行统计分析。

结果在一个小区中发现存在育性异常的突变体植株，该突变体在植株在营养生长阶段和生殖生长阶段与野生型(RP125)均没有明显差异，但是雄穗的小穗形态与野生型差异明显。将小穗在体式显微镜下观察，发现野生型小穗饱满充实，内含大量花粉粒，粒大而饱满；但突变体的小穗干瘪，不含花粉粒(分别见图1、图2和图3)，该突变体的花粉粒败育彻底。将该核不育突变体命名为ms40，为了保存不育突变体，用野生型RP125给不育株授粉。

实施例2本发明不育突变体ms40的不育性状的遗传分析

按照如下方法进行：

用野生型RP125花粉为实施例1中不育突变体ms40授粉得到F₁代，F₁代自交获得F₂代；对F₂代植株进行育性调查及统计，育性调查方法参照实施例1步骤(3)。

镜检结果：可染株为155株，不可染株为39株，经卡方检验符合3:1的分离比例，说明该突变体的不育性状由隐性单基因控制。将该核不育基因命名为ms40。

另外，观察还发现不育突变体在开放授粉情况下可以正常授粉结实，说明该突变体的雌性发育不受该核不育基因的影响。

实施例3本发明核不育基因ms40的初定位

按照如下方法进行：

(1)选取均匀覆盖在玉米10条染色体上的134对indel分子标记，利用双亲(本发明不育突变体ms40，B73)对引物进行初筛，得到42对在双亲间呈现多态性的引物；

(2)随机选取(ms40×B73)F₂群体中完全可育株和完全不育株各15株，利用CTAB法提取叶片DNA。分别等量混合各株DNA，构建可育池DNA和不育池DNA；利用步骤(1)中筛选到的多态性引物对不育池DNA和可育池DNA进行基因分型，结果发现umc2289与umc1940两对分子标记(相应的引物见表1)在不育池中与ms40带型一致，在可育池中与(ms40×B73)F₁带型一致。两对分子标记位于4号染色体长臂末端。为了进一步证明该上述两对分子标记是否与不育性状连锁，以F₂群体中完全不育单株DNA为模板，以上述两对引物为引物进行PCR扩增。

表1初定位的两对分子标记的引物序列

分子标记	正向引物(5′--3′)	反向引物(5′--3′)
			umc2289	GGCTCCGATTCACTTGATGC	CAGCACCACCCAGTTAACCAC
umc1940	AACAACAAATGGGATCTCCGTTAC	CCATCTGCTGAGGGCTTATCTG

结果发现扩增的带型出现了偏分离现象，即大部分不育株与ms40一致的带型，因此，将ms40基因初步定位于第4染色体长臂上的umc2289与umc1940两个分子标记之间，两个分子标记之间的物理位置间隔为19.57Mb。

实施例4本发明核不育基因ms40的精细定位和候选基因克隆

(1)为进一步缩小定位区间，扩大了不育突变体(ms40×B73)F₂群体，通过育性调查，一共鉴定出735株完全不育单株，通过CTAB法对不育单株的叶片DNA进行提取。

(2)在实施例3中的初定位区间内，在该区段内开发了34对在双亲(不育突变体ms40，B73)和其F₁呈多态性的indel标记。最终利用735株完全不育单株将候选基因定位于X214和X242两个分子标记之间(相应引物序列见表2)，两个分子标记分别存在1株和2株交换单株。两个分子标记之间的物理位置间隔为282Kb,其中包含有5个候选基因(见图4)。

表2精细定位的两对分子标记的引物序列

分子标记	正向引物(5′--3′)	反向引物(5′--3′)
			X214	AGCGGCAAGATTCTCCCTTT	CATGTTTGTACCTGCGCTGC
X242	GATATGGCCGGCCTTTTGTT	GAGCCCTACCAGTACCAGTG

(3)通过对5个候选基因进行功能注释，并根据该突变体的突变表型，以及文献报道(Ferguson等.New Phytologist,2016；Swee-Suak Ko等.Plant Cell,2014)，推测基因登录号Zm00001d053895可能为一个该核不育基因的候选基因。

(4)根据步骤(3)推测的候选基因，设计引物ms40-F，ms40-R；以野生型RP125和不育突变体ms40的DNA为模板进行扩增。使用Toyobo公司高保真酶KOD FX对目的序列进行扩增。PCR反应体系(50ul)：2×kod buffer 25ul，dNTP 10ul，正向和反向引物各1.5ul，100ng/ul模板DNA 1ul，KOD酶1ul，加ddH₂O至50ul。PCR反应程序为：94℃5min，98℃10s，55℃30s，68℃2.30min，68℃8min，4℃保存，35～40个循环。结束反应，配制1.5％的琼脂糖凝胶，在150V的电泳仪电泳25min，采用美基生物琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物并进行TA克隆。其中上述引物为：

正向引物ms40-F:5′-AGCTCATGCAAAGACCCGAA-3′(SEQ ID No：7)，

反向引物ms40-R:5′-CCACACATGCATGAGGCAAC-3′(SEQ ID No：8)。

(5)将检测为阳性的菌液送至擎科生物技术有限公司用ABI3730XL DNA测序仪进行双向测通，利用CodonCode Aligner5.1及DNAMAN对目标序列进行分析。

通过对野生型和突变体序列进行比较发现，在玉米ms40基因编码区第7个外显子的第22个碱基处，由野生型的碱基C突变为突变体的碱基T，并导致其编码的氨基酸发生了改变，由甘氨酸(GGG)突变为碱性精氨酸(AGG)。因此推测Zm00001d053895是不育性状的目的基因。该核不育基因ms40的核苷序列如SEQ ID No：1所示，其蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。

实施例5玉米隐性核不育基因ms40关键候选基因SNP分子标记验证试验

(1)以突变体ms40为母本，野生型RP125为父本进行杂交得到F₁，自交后得到F₂，在F₂群体中进行姊妹交，分果穗种植姊妹交群体。

(2)在苗期对姊妹群体的育性基因型进行鉴定

在苗期，对姊妹交群体的所有单株取5g新鲜玉米叶片，采用CTAB法提取基因组DNA。根据实施例4中寻找到的突变位点设计SNP标记的引物SNP-F，SNP-R，以提取的基因组DNA为模板，以SNP-F和SNP-R为引物进行PCR扩增，引物序列如下：

正向引物SNP-F:5′-TGTCATTGTACGTACGGCGG-3′(SEQ ID No：5)，

反向引物SNP-R:5′-CGTGGGATGTACGGCGATG-3′(SEQ ID No：6)。

PCR的反应体系为：TIANGEN的Taq DNA Polymerase，10×Taq Buffer2.4ul，2.5mMdNTP Mixture 0.8ul，10uM的正向反向引物各0.2ul，2.5U/ul DNA Polymerase 0.2ul，模板DNA 80ng，补ddH20至15ul；PCR的反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火67℃30s，延伸72℃30s，循环10次，每次退火温度降低1℃；变性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，循环35次；充分延伸72℃5min。最后4℃保存。

(4)所得扩增产物的片段大小为957bp，将扩增产物送至擎科生物进行测序，根据突变位点碱基判断单株基因型，即检测其438位碱基，若该位置碱基为C，则该待检植株为野生型基因型；若该位置碱基为T，则该待检植物基因型为突变体基因型；若该位置碱基为C/T，则标志着该待检植株为杂合基因型，并在田间对单株进行标记。

(5)育性田间调查

在散粉期，对姊妹交群体的每一个单株进行育性调查。育性调查方法参照实施例1步骤(3)。

通过对基因型数据与育性调查结果进行比对，发现基因型为野生型基因型的，其田间育性均为可育；基因型为突变体基因型的，其田间育性均为不育；基因型为杂合基因型的,田间育性均为可育。因此，基因型数据与田间育性调查结果一致，说明ms40雄性不育突变表型是由该关键候选基因的SNP突变所导致。

实施例6与核不育ms40基因型-表型共分离的分子标记的设计、筛选与鉴定按照如下方法进行：

(1)采用CTAB法提取双亲(双亲分别为核不育突变体ms40和B73)成熟期叶片的DNA，分别以所提取的基因组DNA为模板，以ms40-F、ms40-R为引物进行PCR扩增，并克隆测序，发现了一些indel差异，根据这些差异位点设计开发了6对标记。所设计标记的引物如下(见表3)：

表3根据双亲差异设计的indel引物

(2)以双亲(核不育突变体ms40，B73)和其F₁的DNA为模板，分别以表3中的6对引物为引物进行PCR扩增。PCR的反应体系为：TIANGEN的Taq DNA Polymerase，10×Taq Buffer2.4ul，2.5mM dNTP Mixture 0.8ul，10uM的正向反向引物各0.2ul，2.5U/ul DNAPolymerase 0.2ul，模板DNA 80ng，补ddH20至15ul；PCR的反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火67℃30s，延伸72℃30s，循环10次，每次退火温度降低1℃；变性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，循环35次；充分延伸72℃5min。最后4℃保存。结果只有引物6在双亲和F₁之间呈多态性。

(3)引物连锁鉴定以(ms40×B73)F₂群体中的不育株和可育株对引物6进行基因型鉴定，结果(见图5)发现可育株只能扩增出一条72bp的带，或者同时扩增出一条72bp的带和一条65bp的带；不育株只能扩增出一条65bp的带。

上述结果说明用引物6扩增所得DNA片段与育性基因连锁紧密，且为共显性，可作为核不育基因ms40的分子标记。将引物6扩增所得分子标记命名为ms40-indel。所述的引物6为：

正向引物ms40-indel-F:5′-CCTCATTGTCCCGCCTCTG-3′(SEQ ID No：3)，

反向引物ms40-indel-R:5′-CCGCCGTACGTACAATGACA-3′(SEQ ID No：4)。

实施例7利用分子标记辅助选择核不育基因ms40的回交转育试验

按照如下方法进行：

(1)以核不育突变体材料ms40为母本，以B73为父本杂交，获得F₁代；

(2)播种F₁代；在开花期以F₁为母本，以轮回亲本B73为父本进行回交，获得BC₁代；

(3)BC₁代中带有核不育基因材料的选择：播种BC₁代，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，用CTAB法提取单株DNA，以ms40-indel-F和ms40-indel-R为引物进行PCR扩增；保留带型为双带的杂合基因型单株，拔除纯合野生型的单株；

(4)在成株期选取与轮回亲本B73相似度高(例如大于88％相似度)的材料；以所选BC₁代单株为父本为轮回亲本B73授粉，获得BC₂代；

(5)对选出的BC₂代材料重复步骤(3)和步骤(4)的操作2-4次，选出与轮回亲本B73相似度高的回交代植株；自交，获得BC₄F₂-BC₆F₂代；

(6)将步骤(5)中选出的单株进行背景筛选，选择除了不育性状外，其余性状与B73背景相似度接近100％的单株，如果选的单株扩增后为纯合突变体，则该单株为最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其他玉米材料进行杂交；利用实施例6中的分子标记ms40-indel对单株基因型进行鉴定，若单株是杂合带型(即同时扩增出一条72bp的带和一条65bp的带)，即可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株用于杂交育种或制种。

通过上述分子标记辅助选择，不仅可以加快转育进程，节省了人力物力，而且极大的缩短了育种年限。另外，除了不育性状外，回交转育所得材料与B73表现相同，说明不育基因对其他性状没影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范畴。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用

<141> 2020-06-30

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgggagggg gagtccacca ccaccacccg tgcgtggctg ctgatggaga tggggccggg 60

gccgggcccg ggccggccag cgtggaggcc gcgttgaggc ctcttgtcgg cgtcgacgcc 120

tgggactact gcgtctactg gaggctgtct cctgatcaga ggttcttgga gatggctggg 180

ttctgctgca gcagtgagtt cgaggcacag cttccagcgc tgggcgacct gcctccatca 240

atccagctcg actcctcgtc tgcagggatg cacgccgagg caatggtgtc caaccagccg 300

atctggcaga gcagccgcgt gccagagctc caaacaggtt actccagtgg catggtgcag 360

gagcccgggt ccggcggcgg cccgaggacg cggctgctgg tgcccgtcgc cggcggcctc 420

gtcgagctct tcgcggcgag atacatggcg gaggaggagc agatggcgga gctggtgatg 480

gcgcagtgcg gggtgccgag cggcggcgag gggggcgcgt ggccaccggg attcgcgtgg 540

gacggcggcg ccgcggacgc gtcgcgtggg atgtacggcg atgcggtgcc gccgtcgctc 600

agcctgttcg acgccgccgg cagcgtcgcg gcggacccgt tccaggcggt gcagcaggcg 660

ccgggcgccg gtggtggtgg ggtggacgac gtcgccgggt ggcagtatgc tgctgcggct 720

gggagcgagc tggaggcggt gcagctgcag caggagcagc agccgcgcga tgcggactcg 780

gggtccgagg tcagcgacat gcagggggac ccagaggacg acggcgacgg cgacggcgac 840

gcgcaggggc gtggcggcgg caagggcggc gggaagcggc agcagtgcaa gaacctcgag 900

gcggagcgga agcggcggaa gaagctcaac gagcggctct acaagctcag gtcgctcgtc 960

ccgaacatct ccaagatgga ccgcgcggcg atcctcaggg acgccatcga ctacatcgtg 1020

ggcctgcaga accaggtgaa ggcgctgcag gacgagctgg aggacccggc ggacggcgcc 1080

ggcgcccccg acgtcctcct ggaccacccg ccgccggcga gcctggtggg gctggagaac 1140

gacgagtcgc cgcccacgag ccaccagcac ccgctcgccg ggaccaagag ggcccgtgcg 1200

gcggcggagg aggaggagga ggagaagggg aacgacatgg agccgcaggt ggaggtgcgg 1260

caggtggagg ccaacgagtt cttcctgcag atgctgtgcg agcgccggcc cgggcgcttc 1320

gtccagatca tggactccat cgccgacctg ggactggagg tcaccaacgt caacgtcacc 1380

tcccacgaga gcctcgtcct caacgtcttc cgcgccgcca ggcgggacaa tgaggtggca 1440

gtgcaggcgg acagactgag ggactcgctg ctggaggtga tgcgggagcc gtacggcgta 1500

tggtcgtcgt cggcgccgcc ggtggggatg agcggcagcg gcatcgccga cgtgaagcat 1560

gacagcgtgg acatgaagct cgatggcatc atcgacgggc aggcggcacc gagcgtcgca 1620

gtgggggttt cagaggatca ctacggcggc tacaaccatc tcctccaata cctcgcttga 1680

<210> 2

<211> 559

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Gly Gly Gly Val His His His His Pro Cys Val Ala Ala Asp Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ala Gly Ala Gly Pro Gly Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Leu

20 25 30

Arg Pro Leu Val Gly Val Asp Ala Trp Asp Tyr Cys Val Tyr Trp Arg

35 40 45

Leu Ser Pro Asp Gln Arg Phe Leu Glu Met Ala Gly Phe Cys Cys Ser

50 55 60

Ser Glu Phe Glu Ala Gln Leu Pro Ala Leu Gly Asp Leu Pro Pro Ser

65 70 75 80

Ile Gln Leu Asp Ser Ser Ser Ala Gly Met His Ala Glu Ala Met Val

85 90 95

Ser Asn Gln Pro Ile Trp Gln Ser Ser Arg Val Pro Glu Leu Gln Thr

100 105 110

Gly Tyr Ser Ser Gly Met Val Gln Glu Pro Gly Ser Gly Gly Gly Pro

115 120 125

Arg Thr Arg Leu Leu Val Pro Val Ala Gly Gly Leu Val Glu Leu Phe

130 135 140

Ala Ala Arg Tyr Met Ala Glu Glu Glu Gln Met Ala Glu Leu Val Met

145 150 155 160

Ala Gln Cys Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Gly Ala Trp Pro Pro

165 170 175

Gly Phe Ala Trp Asp Gly Gly Ala Ala Asp Ala Ser Arg Gly Met Tyr

180 185 190

Gly Asp Ala Val Pro Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asp Ala Ala Gly Ser

195 200 205

Val Ala Ala Asp Pro Phe Gln Ala Val Gln Gln Ala Pro Gly Ala Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Val Asp Asp Val Ala Gly Trp Gln Tyr Ala Ala Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ser Glu Leu Glu Ala Val Gln Leu Gln Gln Glu Gln Gln Pro Arg

245 250 255

Asp Ala Asp Ser Gly Ser Glu Val Ser Asp Met Gln Gly Asp Pro Glu

260 265 270

Asp Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Ala Gln Gly Arg Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gly Gly Gly Lys Arg Gln Gln Cys Lys Asn Leu Glu Ala Glu Arg Lys

290 295 300

Arg Arg Lys Lys Leu Asn Glu Arg Leu Tyr Lys Leu Arg Ser Leu Val

305 310 315 320

Pro Asn Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala Ala Ile Leu Arg Asp Ala Ile

325 330 335

Asp Tyr Ile Val Gly Leu Gln Asn Gln Val Lys Ala Leu Gln Asp Glu

340 345 350

Leu Glu Asp Pro Ala Asp Gly Ala Gly Ala Pro Asp Val Leu Leu Asp

355 360 365

His Pro Pro Pro Ala Ser Leu Val Gly Leu Glu Asn Asp Glu Ser Pro

370 375 380

Pro Thr Ser His Gln His Pro Leu Ala Gly Thr Lys Arg Ala Arg Ala

385 390 395 400

Ala Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Gly Asn Asp Met Glu Pro Gln

405 410 415

Val Glu Val Arg Gln Val Glu Ala Asn Glu Phe Phe Leu Gln Met Leu

420 425 430

Cys Glu Arg Arg Pro Gly Arg Phe Val Gln Ile Met Asp Ser Ile Ala

435 440 445

Asp Leu Gly Leu Glu Val Thr Asn Val Asn Val Thr Ser His Glu Ser

450 455 460

Leu Val Leu Asn Val Phe Arg Ala Ala Arg Arg Asp Asn Glu Val Ala

465 470 475 480

Val Gln Ala Asp Arg Leu Arg Asp Ser Leu Leu Glu Val Met Arg Glu

485 490 495

Pro Tyr Gly Val Trp Ser Ser Ser Ala Pro Pro Val Gly Met Ser Gly

500 505 510

Ser Gly Ile Ala Asp Val Lys His Asp Ser Val Asp Met Lys Leu Asp

515 520 525

Gly Ile Ile Asp Gly Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Gly Val Ser

530 535 540

Glu Asp His Tyr Gly Gly Tyr Asn His Leu Leu Gln Tyr Leu Ala

545 550 555

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

cctcattgtc ccgcctctg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 4

ccgccgtacg tacaatgaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 5

tgtcattgta cgtacggcgg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 6

cgtgggatgt acggcgatg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 7

agctcatgca aagacccgaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 8

ccacacatgc atgaggcaac 20

Claims (8)

1.一种玉米核不育基因ms40，其特征在于，所述的玉米核不育基因ms40的核苷酸序列如Seq ID No：1所示。

2.权利要求1所述的玉米核不育基因ms40在玉米制种上的应用。

3.权利要求1所述的玉米核不育基因ms40在培育隐性雄性不育的转基因玉米中的应用。

4.权利要求1所述的玉米核不育基因ms40编码的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

5.权利要求1所述的玉米核不育基因ms40的分子标记，其特征在于，所述分子标记的PCR扩增引物由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物组成。

6.权利要求5所述的分子标记在鉴定玉米核不育基因ms40上的应用。

7.用于扩增权利要求5所述分子标记的引物对，其特征在于，所述的引物对由SEQ IDNo：3和SEQ ID No：4所示的引物组成。

8.利用权利要求5所述分子标记鉴定筛选玉米核不育材料的方法，其特征在于，包括以待测玉米样品基因组DNA为模板，以SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，得扩增产物；

如果扩增产物仅为一条65bp的带，则该植株为不育株；如果扩增产物仅为一条72bp的带，则该植株为纯合可育株；如果扩增产物为一条72bp的带和一条65bp的带，则该植株为杂合可育株。

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