CN104818272A - 一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与小麦寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记SSR52，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3的遗传距离为0.3cM。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。

Description

一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52及其应用

技术领域

本发明涉及小麦分子育种领域，具体涉及一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52及其应用。

背景技术

小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，历年种植面积分别占耕地面积的22％～30％，粮食作物总面积的22％～27％，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、江苏、四川、安徽等省份；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％，是我国约一半人口的主食，因此高产小麦品种的选育一直是育种家关注的重点。

小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitative trait locus,QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的整个生长时期均可检测、选择效率高等优势。

小麦产量由三个主要因素构成，即产量＝穗数×穗粒数×粒重。分蘖是影响小麦穗数进而影响小麦产量的重要农艺性状之一，同时又是单子叶植物的一种特殊的分枝现象，具有重要的研究意义。

小麦分蘖遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因QTL的分子标记定位及其遗传效应开展。部分分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将其作为质量性状来研究(Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plantgrowth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757；Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tillerinhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53)。同时，也有很多学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究(ShahaMM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome 3A ofbread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732；谢玥，龙海，侯永翠，郑有良.小麦寡分蘖材料H461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006,26:21-23；王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论文,2009；温明星.望水白多分蘖、矮秆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕士学位论文,2010；Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,XinmingYang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mappingof a fertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449)。迄今为止，已报道的分蘖相关主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，微效基因位于5A，3B，7B，1D、5D染色体，其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。

小麦材料H461相对于小麦品种川农16(国审品种)具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9)。同时，小麦品种川麦107和分蘖数显著高于H461。因此，利用H461和川麦107构建遗传研究群体，进一步验证小麦H461的寡分蘖特性，定位控制分蘖基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。

分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列(simplesequence repeats，SSR)是一类广泛存在于基因组上的由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于其在基因组上大量的分布，多态性高，且操作技术简单、费用低廉，在分子标记辅助育种中已被广泛应用。因此，筛选出与分蘖基因紧密连锁的新型SSR分子标记，对小麦寡分蘖基因进行选择，将有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，对提高小麦群体质量和产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供与小麦H461寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记。

本发明的另一目的在于提供所述分子标记的PCR引物。

本发明的第三个目的在于提供与上述寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的新寡分蘖基因Ltn3来自小麦H461，该基因位于小麦2D染色体。Ltn3能显著降低小麦分蘖，LOD值大于5.43，解释约12.5％的表型变异。

本发明所提供的分子标记SSR52的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.3cM。

本发明还提供了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用PCR引物进行PCR扩增，能扩增出SEQ ID No.1所示片段的植株样品为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。

可选的，所述方法包括以下步骤：

(1)以待鉴定植株的基因组DNA作为模板，用PCR引物进行PCR扩增：

a)PCR扩增反应体系：5μl 10×PCR buffer、1.5U Ex Taq^TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、模板DNA100ng、双蒸水加至总量为50μl；

b)PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；

c)PCR产物检测：PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测；

(2)鉴定Ltn3的结果：能扩增出SEQ ID No.1所示片段的的植株样品为含有寡分蘖基因Ltn3的植株。

其中，所述待鉴定植株的DNA取自小麦样品三叶期的叶片。

本发明还提供了所述分子标记的PCR引物，其中，上游引物序列(SSR52-F)如SEQ ID No.2所示，下游引物序列(SSR52-R)如SEQID No.3所示。

本发明还提供了所述分子标记SSR52在小麦育种中的应用。

本发明还提供了所述分子标记SSR52在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。

本发明还提供了本分发明所述方法在小麦育种改良中的应用。

本方还提供了所述的PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。

在本发明中，小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记SSR52是通过以下方法获得的

(1)利用寡分蘖小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有223个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。

(2)用CTAB法提取遗传作图群体的各株系的DNA，选取wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的90K SNP芯片，以亲本H461和川农16的DNA为模版，进行基因分型，获得RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B，杂合型为H。

(3)小麦成熟期田间鉴定所述F8群体植株的分蘖数。

(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(IntervalMapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据将寡分蘖基因Ltn3定位于2DL染色体上一个4cM的区段内。

(5)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，通过SSRHunter软件寻找简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)。

(6)设计普通PCR引物，用于后续筛选，利用Oligo7.0和primer5.0软件设计61对SSR引物，如表1所示的SSR11-SSR71，61对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2-123所示)。PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度100～300bp，退火温度55℃，简单重复序列包含在扩增产物内部。

(7)SSR分析

a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的61对SSR引物，以亲本H461和CN16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1个多态性SSR分子标记命名为SSR52。

b)F8群体的SSR分析：以上述步骤获得的具有多态性的分子标记SSR52的特异性引物，同时扩增亲本H461、CN16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的带型记为A，扩增片段长175bp。亲本CN16的带型记为B，扩增片段长181bp。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于CN16的记为B。

c)连锁图谱的密化：根据分子标记SSR52的鉴定数据，结合90KSNP芯片的基因分型数据，作图软件JoinMap 4.0构建遗传高密度图谱。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3，计算寡分蘖基因Ltn3的位置和分子标记之间的遗传距离，发现分子标记SSR52与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.3cM，LOD值大于5.43，解释表型变异约12.5％。

有益效果：

本发明首次公开了来自小麦H461的寡分蘖基因Ltn3，该基因位于小麦2D染色体长臂，显著降低了小麦分蘖。该基因在小麦株型(调控分蘖)育种中具有较高的利用价值。

本发明首次公开了基于PCR平台精确检测小麦H461新寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。

本发明公开的分子标记SSR52与寡分蘖基因Ltn3极显著相关，呈共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定分蘖品种的选择鉴定效率，且成功率高。

附图说明

图1为小麦H461寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与本发明分子标记SSR52之间的连锁遗传图谱。

图2为利用引物SSR52-F/R进行基因分型的鉴定结果，其中条带左起分别为MM37、CN16、CM107、H461。

图3为H461*川麦107的F7植株分子标记SSR52检测的电泳图谱；其中1、2和3分别为CN16、川麦107和H461；6、8、9、10、11、13、16、18、19、21为寡分蘖基因型植株，4、5、7、12、14、15、17、20为多分蘖基因型植株。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1

本实施例用于说明小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记SSR52的获得方法：(1)利用寡分蘖小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有223个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。

(2)用CTAB法提取遗传作图群体的各株系的DNA，选取wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的90K SNP芯片，以亲本H461和川农16的DNA为模版，进行基因分型，获得RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B，杂合型为H。

(3)小麦成熟期田间鉴定所述F8群体植株的分蘖数。

(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(IntervalMapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据将寡分蘖基因Ltn3定位于2DL染色体上一个4cM的区段内。

(5)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，通过SSRHunter软件寻找简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)。

(6)设计普通PCR引物，用于后续筛选，利用Oligo7.0和primer5.0软件设计61对PCR引物，如表1所示的SSR11-SSR71，61对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2-123所示。PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度100～300bp，退火温度55℃，简单重复序列包含在扩增产物内部。

(7)SSR分析：a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的61对SSR引物，以亲本H461和CN16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1个多态性SSR分子标记命名为SSR52。

b)F8群体的SSR分析：以上述步骤获得的具有多态性的分子标记SSR52的特异性引物，同时扩增亲本H461、CN16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的带型记为A，扩增片段长175bp。亲本CN16的带型记为B，扩增片段长181bp。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于CN16的记为B。

c)连锁图谱的密化：根据分子标记SSR52的鉴定数据，结合90KSNP芯片的基因分型数据，作图软件JoinMap 4.0构建遗传高密度图谱。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3，计算寡分蘖基因Ltn3的位置和分子标记之间的遗传距离，发现分子标记SSR52与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.3cM，LOD值大于5.43，解释表型变异约12.5％。小麦H461寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与本发明分子标记SSR52之间的连锁遗传图谱见图1。

表161对SSR引物序列及扩增片段长度

      

      

      

      

实施例2

1.1DNA的提取

试验材料选取H461、川农16、川麦107，其中川农16、川麦107为多分蘖品种，H461为寡分蘖品种。采用CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。

1.2检测小麦寡分蘖基因Ltn3的引物的筛选

1.2.1引物设计

(1)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGS小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，通过SSRHunter软件寻找简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)。

(2)设计普通PCR引物61对(表1)，用于后续筛选。利用Oligo7.0和primer5.0软件设计PCR引物。PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度100～300bp，退火温度55℃，简单重复序列包含在扩增产物内部。

1.2.2普通PCR测试引物特异性

(1)配置PCR体系：

      

(2)在PCR仪上按下列条件进行PCR扩增反应：

95℃预变性5min，94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min，12℃保温。

(3)PCR产物检测：PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。

1.2.3检测引物在亲本间的差异性

(1)提取绵麦37(MM37)、川农16(CN16)、川麦107(CM107)、H461、及三叶期的叶片DNA。

(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，用本发明所述PCR引物(上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ IDNo.3所示)进行PCR扩增。

(3)PCR扩增反应体系：5μl 10×PCR buffer、1.5U Ex Taq^TMDNA聚合酶、2mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl。

(4)PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

(5)PCR产物检测：PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测；

(6)鉴定结果：61对引物中，仅发现一对引物SSR52-F/R能将H461划分为A型，扩增片段175bp；将MM37、CN16、CM107划分为B型，鉴定结果如图2所示，图2中条带左起分别为MM37、CN16、CM107、H461。

实施例3检测SSR52-F/R在鉴定遗传群体分蘖能力上的适用性

(1)以H461为母本，川麦107为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F7代RIL验证群体。

(2)提取群体株系三叶期的叶片DNA，包括H461和川麦107。

(3)以步骤(1)所得的DNA作为模板，用本发明所述PCR引物(上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ IDNo.3所示)进行PCR扩增。

(4)PCR扩增反应体系：5μl 10×PCR buffer、1.5U Ex Taq^TMDNA聚合酶、2mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl。

(5)PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

(6)PCR产物检测：PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。

(7)鉴定结果如图3所示。10株能扩增出与H461相同的A型片段175bp，为含有寡分蘖基因Ltn3的植株，预测这些植株在成熟后分蘖数较低。8株能扩增出与川农16、川麦107相同的B型片段181bp，为不含有寡分蘖基因Ltn3的植株，预测这些植株在成熟后分蘖数较高。

(8)小麦成熟期田间鉴定18个F7植株的分蘖数，结果具有SSR52分子标记的植株平均分蘖数仅1.2个(见表2寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52预测遗传群体分蘖能力的结果)，显著低于不具有SSR52分子标记的植株分蘖数(平均8.75个)；实际结果与预期结果一致，说明本发明的寡分蘖基因Ltn3确实有显著降低分蘖数的作用；同时本发明的分子标记SSR52可以用于跟踪鉴定寡分蘖基因Ltn3。

表2

      

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.3cM。

3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，小麦寡分蘖基因Ltn3显著降低小麦分蘖，LOD值大于5.43。

4.一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用PCR引物进行PCR扩增，能扩增出SEQ ID No.1所示片段的植株样品为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待鉴定植株的基因组DNA作为模板，用PCR引物进行PCR扩增：

a)PCR扩增反应体系：5μl 10×PCR buffer、1.5U Ex Taq^TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、模板DNA 100ng、双蒸水加至总量为50μl；

b)PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；

c)PCR产物检测：PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测；

(2)鉴定Ltn3的结果：能扩增出SEQ ID No.1所示片段的的植株样品为含有寡分蘖基因Ltn3的植株。

6.权利要求1-3中任意一项所述分子标记的PCR引物，其特征在于，上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ IDNo.3所示。

7.分子标记SSR52在小麦育种中的应用。

8.分子标记SSR52在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。

9.权利要求4或5所述的方法在小麦育种改良中的应用。

10.权利要求6所述的PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。