CN107794261A - 油菜每角粒数主效qtl位点紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
油菜每角粒数主效qtl位点紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与油菜每角粒数主效基因位点紧密连锁分子标记及应用，其紧密连锁标记可用于油菜分子标记辅助选择育种以及该主效QTL的图位克隆。本发明针对利用杂种F1和亲本连续回交多代，结合分子标记辅助选择的方法构建近等基因系，挑选背景回复率高的杂合单株自交获得QTL‑NIL分离群体。然后逐步加密目标区间的分子标记，并通过分析其基因型寻找交换单株，最终将目标区间缩小到物理距离仅有88Kb，逐步加密分子标记对其进行基因型分析寻找交换单株，获得了分子标记BrSF46‑28和BrSF46‑78。用这两个紧密连锁的分子标记进一步对扩大的NIL群体进行基因分型，发现不同等位基因之间每角粒数有显著差异，因此本发明可应用于油菜分子标记辅助选择育种，提高选择效率，加快育种进程。
Description
技术领域
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种油菜每角粒数主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
油菜是世界上重要的油料作物之一，也是产油效率最高的油料作物之一。我国是世界油料作物消费大国，但其供给长期处于短缺状态(王汉中，2010)，2013年我国植物油进口比重高达64.7％(王汉中和殷艳，2014)。面对国产总量严重不足，对外的依存度越来越高的情况，因此大力发展油菜产业、提高油菜单产是解决我国食用植物油消费当务之急。在相同种植密度下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量是由单株角果数、每角粒数和千粒重三个因子构成。每角粒数与产量的相关性(-0.0169-0.6692)(田志宏等，2003)较高，且在油菜种质资源中变异范围很大(约每角5粒到35粒)(Chen et al.，2013)，因此通过改良每角粒数来提高油菜单产是可行的。
虽然传统育种方法曾经为生产提供了许多优良油菜品种，但由于育种周期长、选择效率低，已经无法完全满足当前油菜生产的需要。随着分子生物学和分子遗传学的发展，育种家们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的育种手段，其基本原理是在油菜育种过程中直接利用与目标性状基因紧密连锁和共分离的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入巨资开展这方面的研究工作。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状扩展到复杂的多基因数量性状。随着基因组学和测序技术的高速发展，油菜分子标记研究日渐受到关注，研究的领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因标记和定位、品种纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国油菜分子育种研究还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等。
大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative traitloci，QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。随着现代生物科学技术水平的进步，要想精确定位到单基因水平，利用初级群体显然不能实现，因此要对初定位的QT L进一步精细定位以及基因克隆，必须要构建高级群体。近等基因系(Near-isogenic lines,NIL)是一个非常理想的遗传群体，是由双亲杂交的F1代与轮回亲本经过多代回交，再加每代的分子标记辅助选择得到的高世代回交群体。由于近等基因系是通过连续回交多代的策略而获得的，并且每代要通过分子标记辅助选择，因此其遗传背景简单(与轮回亲本一致)，纯度高，与非轮回亲本间的表型差异仅可能是导入片段的差异而产生的。近等基因系是针对目标主效QTL构建的，因此其目标性状只在目标QTL区域有分离(Eshed and Zamir,1995；Paterson,et al.,1990)，其本质是将数量性状位点分解为单个孟德尔因子，即将数量性状质量化(Monna,et al.,2002；Yamamoto,et al.,1998)。而且所得到的后代群体中的目标单株的表型和基因型都比较稳定且可靠，可以进行多年多点重复实验进行后代验证。采用近等基因系策略精细定位主效或者微效QTL的方法相对比较简单，并且定位位置精确(Zhang,et al.,2009)。考察每个近等基因系的表型变异也不需要复杂的遗传统计方法，利用简单的T测验就可以分析。
利用在目标QTL区间逐步加密的分子标记对大规模分离群体进行基因型分析寻找交换单株，结合其表型逐步将目标QTL界定于更小的标记区间内。迄今，利用QTL-NIL法在主要农作物(水稻、玉米、小麦等)中已精细定位和克隆了一大批QTL。目前油菜中只有两例QTL克隆的报道，一个位于A9连锁群控制粒重和角果长度(Liu et al.,2015)，一个位于C9连锁群控制每角粒数(Li et al.,2015)。本研究通过QTL精细定位，旨在筛选到对油菜每角粒数具有正向效应的主效QTL，用于油菜产量性状的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记BrSF46-28，所述的分子标记引物为：BrSF46-28F:5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’，BrSF46-28R:5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’。
本发明的另一个目的在于提供了一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记BrSF46-78，所述的分子标记引物为：BrSF46-78F：5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’；BrSF46-78R：5’-GCACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
本发明的还有一个目的在于提供了一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记Br SF46-28或SF46-78引物的应用，包括在油菜育种中的应用，在油菜每角粒数主效QTL图位克隆中的应用。
本发明还有一个目的在于提供了一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒，该试剂盒包括引物：BrSF46-28F:5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’，BrSF46-28R:
5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’和BrSF46-78F：5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’；BrSF46-78R：5’-GCACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
本发明还有一个目的在于提供了一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒的应用，包括在油菜育种中的应用，在油菜每角粒数主效QTL图位克隆中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
利用在每角粒数上有极显著差异的油菜品种中双11号(约21粒每角)和73290(约11粒每角)杂交，杂种F1代与轮回亲本中双11连续回交4代，得到BC4F1群体，经过前景和背景筛选再通过自交产生BC5F2代QTL-NIL分离群体作为精细定位的材料。本发明用到的研究材料由中国农业科学院油料作物研究所油菜生物技术育种课题组提供。
采用磁珠法利用Biomek3000核酸工作站提取亲本中双11和No.73290以及QTL-NIL群体叶片的基因组DNA，利用自主开发的SSR/InDel引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。对其中的单拷贝多态性共显性标记进行遗传定位，挑选定位于目标主效QTL区间的分子标记用于后续的精细定位，获得紧密连锁的分子标记。
利用上述方法，申请人最终获得了油菜每角粒数主效QTL紧密连锁的分子标记BrSF46-28和BrSF46-78。
扩增分子标记BrSF46-28的引物为：BrSF46-28F：5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’；BrSF46-28R：5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’。
扩增分子标记BrSF46-78的引物为：BrSF46-78F：5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’；BrSF46-78R：5’-GCACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
分子标记BrSF46-28的引物在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PAGE分析，可筛选得到具备优势每角粒数性状的植株。
分子标记BrSF46-78的引物在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PAGE分析，可筛选得到具备优势每角粒数性状的优势植株。
分子标记BrSF46-28的引物和分子标记BrSF46-78的引物联合在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PA GE分析，可筛选得到具备优势每角粒数植株。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明精细定位了油菜品种中双11控制每角粒数的主效QTL，物理距离仅88kb。在常规育种方法中，每角粒数性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(每角粒数表型受环境影响较大)。通过检测每角粒数主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中每角粒数主效QTL位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与每角粒数性状紧密连锁的分子标记，即可判断等位基因的优劣，进而准确快速筛选每角多粒单株。
附图说明
图1为本发明的技术方案。
图2精细定位示意图。
具体实施方式
实施例1：QTL-NIL的构建
根据精细定位的策略(图1)，针对qSN.A6构建了NIL。本试验使用亲本中双11号和No.73290杂交获得杂种F1，期间利用qSN.A6两侧分子标记BrSF47-389和BnID108选择杂合单株和轮回亲本中双11连续回交4代获得BC4F1代。然后利用目标主效QTL以外且均匀分布于油菜19条连锁群上的80个分子标记(Yang et al.，2016)进行遗传背景筛选，从BC4F1群体中挑选目标片段杂合且背景回复率>95％的单株自交获得BC4F2种子。大田种植BC4F2代QTL-NIL分离群体，利用上述分子标记筛选重组单株，并在成熟期收获考种，通过比较不同类型重组单株的每角粒数数据，将qSN.A6界定到分子标记BrSF47-10和BrSF46-167之间(Yang etal.，2016)。为了进一步缩小QTL区间，从BC4F2代群体中筛选出QTL区域杂合单株自交获得BC4F3种子。大田种植BC4F3种子，定苗后取样9588株，作为精细定位的实验材料。
实施例2：分子标记的开发
首先，利用自主设计的引物与白菜或甘蓝型油菜的基因组序列进行比对，确定目标QT L对应的基因组区域。利用MISA软件在此基因组区域搜索SSR。利用BWA软件把亲本No.73290重测序序列定位到亲本中双11的参考基因组序列上，用samtools软件找出目标QTL区间的InDel位点。然后，用Primer3.0软件设计SSR/InDel引物。
采用磁珠法提取亲本中双11和No.73290以及QTL-NIL群体叶片的基因组DNA，利用自主开发的SSR/InDel引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。
PCR反应体系：
PCR反应程序：
程序结束后置于4℃冰箱保存。凝胶电泳使用前先加入Loading buffer热变性5min即可上样。
实施例3：QTL-NIL分离群体基因型分析和重组单株筛选
(1)采用磁珠法提取QTL-NIL分离群体的基因组DNA；
(2)利用上述开发的分子标记对QTL-NIL分离群体的基因组DNA进行分子标记分析；
(3)对QTL-NIL分离群体这些分子标记的基因型进行分析筛选重组单株。
实施例4：重组单株的收获和考种
在油菜成熟期统一收获交换单株，风干两周后，对各个单株的每角粒数进行考种，标准如下：
(1)角果数：取主序上生长发育良好的所有角果，统计角果数；
(2)手工脱粒，尽可能保证所有角果的籽粒全部脱粒且无损失，然后用SC-G考种仪统计总粒数。
(3)每角粒数＝总粒数/角果数
实施例5：精细定位
结合重组单株的基因型和和表型数据进行分析发现，在目标区域内NIL与轮回亲本中双11比较，每角粒数显著降低的NIL都有一个共性就是导入了分子标记BrSF46-28或BrS F46-78，而且同时导入这两个标记的NIL降低更显著(表1)。
因此本发明共筛选到两个分子标记，这两个分子标记均与油菜每角粒数性状紧密相关，所述的BrSF46-28的分子标记的引物为：BrSF46-28F：5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’；BrSF46-28R：5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’。BrSF46-78分子标记的引物为：BrSF46-78F:5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’，BrSF46-78R:5’-GCACAG CCAACGTTTTGAA-3’。
表1：NIL基因型与表型数据
实施例6：
单个分子标记BrSF46-28或BrSF46-78或分子标记BrSF46-28和BrSF46-78联合在油菜高产育种中的应用：
(1)田间播种中双11号和No.73290的杂种F1单株自交后获得的F2种子。
(2)在定苗后对随机选取184个F2单株挂牌取样，并提取叶片总DNA利用分子标记BrS F46-28和BrSF46-78对其进行分子标记分析，并根据亲本进行带型的判读。
(3)在成熟期收获正常成熟的挂牌单株进行主序千粒重的考种。
(4)对基因型和表型都无缺失数据的单株进行分析。
结果表明，当使用分子标记BrSF46-28和BrSF46-78联合对F2单株进行筛选时(表2)，F2单株中两个分子标记基因型都和亲本中双11号相同时，其平均每角粒数显著高于另外那些和No.73290相同的(P＝9.1E-10)；而且两个分子标记基因型都和亲本中双11相同的F2单株其每角粒数超过F2群体均值(18.8粒/角)的占78.1％。当仅使用BrSF46-28分子标记对F2单株进行筛选，当F2单株中BrSF46-28基因型和亲本中双11号相同时，F2单株其每角粒数超过F2群体均值的占71.8％；当仅使用BrSF46-78分子标记对F2单株进行筛选，当F2单株中BrSF46-78基因型和亲本中双11号相同时，F2单株其每角粒数超过F2群体均值的占77.4％。
所述的BrSF46-28的分子标记的引物为：BrSF46-28F：5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’；BrSF46-28R：5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’。BrSF46-78分子标记的引物为：BrSF46-78F:5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’，BrSF46-78R:5’-GC ACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
表2：利用分子标记BrSF46-28和BrSF46-78对F2单株进行辅助选择的结果
注：A、B、H分别代表来源于亲本中双11号、No.73290以及杂合的分子标记带型。
以上结果足以说明本发明提供的分子标记BrSF46-28和BrSF46-78，无论是单独使用还是联合使用，都能有效的对油菜的每角粒数进行有效的辅助选择。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 油菜每角粒数主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其应用
<130> 油菜每角粒数主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtggcgaca tgtctgaata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggtagggag gggatttgaa 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcataatca cctaatacta gtttgc 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcacagccaa cgttttgaa 19
Claims (9)
1.一种与油菜每角粒数紧密连锁分子标记引物，包括：BrSF46-28F: 5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA -3’；BrSF46-28R: 5’- AGGTAGGGAGGGGATTTGAA -3’。
2.一种与油菜每角粒数紧密连锁分子标记引物，包括：BrSF46-78F：5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC -3’； BrSF46-78R：5’- GCACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
3.权利要求1所述的分子标记引物在油菜育种中的应用。
4.权利要求2所述的分子标记引物在油菜育种中的应用。
5.一种与油菜每角粒数主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒，该试剂盒包括引物：BrSF46-28F: 5’-CGTGGCGACATGTCTGAATA-3’， BrSF46-28R:5’-AGGTAGGGAGGGGATTTGAA-3’和 BrSF46-78F：5’-TGCATAATCACCTAATACTAGTTTGC-3’； BrSF46-78R：5’-GCACAGCCAACGTTTTGAA-3’。
6.权利要求5所述的试剂盒在油菜育种中的应用。
7.权利要求1所述引物在油菜每角粒数主效QTL图位克隆中的应用。
8.权利要求2所述引物在油菜每角粒数主效QTL图位克隆中的应用。
9.权利要求5所述的试剂盒在油菜每角粒数主效QTL图位克隆中的应用。
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